尿液生物标志物研究的收集、处理和储存注意事项

Summary

该协议旨在为尿路感染生物标志物研究的尿样采集、处理和储存提供考虑因素。

Abstract

有几种尿蛋白有望成为尿路感染的新型标志物。与目前的诊断方法相比，识别具有更高预测准确性的新型生物标志物有可能大大提高管理尿路感染患者的能力。然而，样本采集、处理和储存都可能影响生物标志物研究的结果。了解这些阶段中的每一个阶段对生物标志物研究的影响对于为该领域未来的高质量研究提供信息以及批判性地审查该领域的其他研究是必要的。在这里，该研究回顾了有关尿样处理每个阶段影响的文献，并报告了各种情况对尿蛋白的影响。该方案将侧重于收集技术、储存时间和温度、处理技术、试剂的使用以及生物标志物稳定性的长期冷冻。它将重点介绍蛋白质，但将简要讨论可用于生物标志物研究的其他材料。在此过程中，该协议将为未来的研究人员提供指导，以协助设计尿液生物标志物研究。

Introduction

尿路感染 （UTI） 是儿童和成人中最常见的细菌感染之一¹。虽然某些人群的 UTI 诊断可能并不复杂，但在其他人群中可能更复杂，例如患有神经性膀胱^{的人 2}。准确诊断 UTI 的能力将通过减少不必要的抗生素的使用来帮助改善抗生素管理工作，并可能有助于 UTI 的早期诊断，从而降低发病率的风险。鉴于 UTI 的患病率，人们对改善这种常见感染的管理具有重大兴趣。

文献中越来越多的新型生物标志物显示出诊断 UTI^{的能力 3,4,5,6,7}。然而，有几个与尿液样本处理相关的因素有可能改变结果。这些因素包括收集方法、短期和长期储存的温度和持续时间、处理技术、试剂使用和冻融循环⁸。了解这些变化如何影响生物标志物读数对于批判性地解释文献中的研究以及设计专注于尿液生物标志物的高质量研究是必要的。

在这里，对文献进行了叙述性回顾，介绍了每个因素的影响，包括收集技术、短期和长期储存温度和持续时间、试剂使用以及冻融循环对可能用作尿液生物标志物的蛋白质的影响，并根据文献综述为最佳加工提供建议。该方案将侧重于使用 western blot 或 ELISA 测量的蛋白质生物标志物。

Protocol

该协议遵循该机构人类研究伦理委员会的指导方针。确保在收集和利用生物标本进行研究之前获得机构审查委员会 （IRB） 的批准。

1. 收集

1. 在无菌标本杯中获取尿液样本。根据特定的研究设计确定尿液样本的类型，以及具体的纳入和排除标准。对于 UTI 研究，请使用 clean-catch 方法或导管插入术，以避免会阴污染。
2. 为了获得干净的尿液样本，指导参与者用小毛巾擦拭尿道周围区域，将少量排尿到马桶中，然后排尿到标本杯中。
3. 指导女性在排尿前用手指张开阴唇，男性在排尿前缩回包皮（如果适用）以避免污染。
4. 记录采集时间。
5. 根据个人研究设计和研究问题的要求，从每个参与者那里收集相关的临床数据。
6. 如果电子健康记录无法可靠地获得这些数据，请考虑在处理和储存之前对每个样本进行尿液分析或尿液试纸检测。

2. 样品处理和储存

1. 立即处理样品。如果无法做到这一点，请将样品在 4 °C 下储存长达 24 小时。
2. 如果样品不能在 4 °C 下储存或需要在 4 °C 下储存超过 24 小时，则向样品中加入 0.2 M 硼酸或 10 mM NaN₃ 。检查以确保此类试剂与计划的下游应用兼容。
3. 记录样品在 4 °C 下停留的持续时间。
4. 将样品以 1000-1500 x g 离心 10-20 分钟。离心不需要在 4 °C 下进行。
5. 收集上清液并将其分装到单独的微量离心管中。
6. 使用多个清晰的标识符（例如日期和样品标识 （ID））标记试管。考虑使用专为在 -80 °C 下储存生物样品而设计的计算机生成的条形码。 如果不可用，请确保用于标记样品的笔是防水的。
7. 为每个冷冻箱贴上标签，使每个位置都有一个特定的代码。为此，请用不同的字母对每列进行编号，用数字对每一行进行编号。这将允许创建地图或其他参考线，以便于样本定位。
8. 立即将样品在 -80 °C 下冷冻。 记录冻结的时间。
9. 测量当天在 37 °C 水浴中解冻样品，以尽量减少在室温或 4 °C 下不必要的储存。
10. 记录每个等分试样的额外冻融循环的时间和次数。

3. 分析

1. 使用市售 ELISA 时，请遵循制造商的说明。
2. 一式两份运行示例。
3. 确定目标蛋白质的预期浓度，以确保样品中的蛋白质水平在试剂盒范围内。如果预期蛋白质水平超过上限，则稀释样品。
4. 从读板器 （ELISA） 或蛋白质印迹获得数据后，手动（不推荐）或使用任何软件确定样品中每个生物标志物的浓度。
5. 分析结果。数据分析取决于个体研究设计。
6. 考虑调整生物标志物值以考虑尿液浓度。
   注意:传统上，生物标志物研究人员使用尿肌酐作为正常化方法，尤其是在肾功能正常的参与者中，以解释尿液浓度。然而，其他人报告说，归一化对结果没有影响⁴。为了克服这一障碍，一些研究人员报告了归一化和非归一化结果。
7. 建议报告从收集到冷冻的时间范围，以及已发表手稿处理前在 4 °C 下的持续时间，以便在样品处理的背景下解释结果（图 1）

4. 各种储存条件对中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 （NGAL） 的影响。

1. 用 2 ng/mL 重组 NGAL 加标新鲜尿液。
2. 将尿液分装并置于不同的处理和储存条件下。
   1. 将尿液以 1000-1500 x g 离心 10-20 分钟。离心不需要在 4 °C 下进行。 在不同条件（20°C、4°C、-20°C）下储存 24 小时、48 小时或 72 小时。
   2. 将样品的等分试样储存在 -80 °C 以进行比较。
3. 按照步骤 4.2.1 所述将样品保持在不同条件下后，使用市售的 ELISA 试剂盒测量样品中 NGAL 的水平，该试剂盒包括根据制造商的说明的对照品。

Results

离心对 NGAL 水平的影响很小。储存在 -80 °C 下的离心样品的 NGAL 水平低于非离心样品 （2.17 ng/mL ± 0.32 ng/mL、2.77 ng/mL ± 0.21 ng/mL）。冻结循环也对第三个冻融循环后的 NGAL 水平产生影响。（图 2）。在研究的条件 （离心、冻融循环和储存温度） 中，储存温度对 NGAL 水平的影响最大。样品采集后立即在 -80 °C 下储存是最稳定的样品保存方法。在所有其他储存条件下，NGAL 水平都存在差异，样品在室温 （20 °C） 下储存，水平变化最大。（图 3）

综上所述，这些结果表明测得的蛋白质水平如何根据样品处理方法而变化，不仅强调了一致且可靠的方案对可重复结果的重要性，还强调了评估此处分析的单个生物标志物参数的必要性。

图 1:尿液生物标志物最佳处理的方案工作流程。 此流程图说明了处理尿液样本以获得尿液生物标志物的建议工作流程。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:冻融循环样品中的尿液 NGAL 浓度。 第 3 次冻融循环后尿液 NGAL 浓度降低。误差线表示标准差。共分析 8 个样品，在所有 4 种冻融循环条件下一式两份运行。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:各种储存条件下的尿液 NGAL 浓度。 将加标重组 NGAL 的尿液样品在 20 °C、4 °C、-20 °C 下储存 24 h、48 h 或 72 h。样品也立即在 -80 °C 下冷冻以进行比较。尿液 NGAL 的浓度根据冷冻温度和持续时间有较小程度的变化。误差线表示标准差。共分析 20 个样品，在所有 10 种时间和温度条件下一式两份运行。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

产生一致和可重复的结果的重要性不仅限于单个研究的成功，而且还将能够更好地比较文献中的结果⁹。关键程序步骤研究之间的差异可能会引入不可逆的偏倚，这可能会影响生物标志物信号及其解释，这可能是导致几项研究之间存在差异的原因¹⁰。这表明需要建立一种更标准化的方法来处理尿液样本以进行生物标志物研究。

大多数尿液生物标志物研究的研究设计将决定尿液收集的时间和方法。但是，当以非时间敏感方法测量生物标志物时，我们建议避免在第一天早上进行采样。虽然由于首晨尿液样本的浓缩性质，被认为可提供信息最丰富的尿液概况，但这些样本并不适合测量尿液生物标志物，因为它们容易受到细菌和上皮细胞的污染。女性尿液样本尤其如此:女性首次排尿与中段尿液样本的比较表明蛋白质的比例显著不同¹¹。因此，第二个早晨或随机中游尿液样本更适合研究蛋白质生物标志物¹²。尿液收集的方法通常也由研究设计决定。我们建议使用干净的尿液或导管样本。最初为常规临床目的收集的残余尿液通常用于 UTI 研究，是一种公认的样本采集方法。然而，虽然 Clean Catch 是一个简单的程序，但导尿管插入术是侵入性的。导管尿收集只能由接受过适当培训并在当地 IRB 批准下进行的人员进行。我们建议与接受过适当培训的临床医生合作，获取导尿样本或利用最初收集的残余尿液进行常规临床护理。

应立即处理样品，以保持任何目标标记物的完整性。但是，这通常是不可能的;因此，有必要检查储存条件（包括持续时间和温度）对样品稳定性的影响。一般来说，应尽量减少在室温下储存，因为有充分的理由认为，生物标志物（如 NGAL）在室温下长时间储存样品会导致降解¹³。虽然一些研究发现，在室温 （25 °C） 下储存 24 小时对包括 NGAL 和 KIM-1 在内的生物标志物浓度的影响最小^14,15，^但其他研究则确定，在此时间范围内确实开始发生显著降解⁸。已发现尿液生物标志物 IL-18 对 25 °C 的短期储存特别敏感^14,15。如果可能，样品应在 4 °C 下短期储存。在 4 °C 下，NGAL 和 KIM-1 、 IL-18 、 L-FABP 和胱抑素 C 在 24 h⁸ 和长达 48 h¹⁵ 内表现出高稳定性。然而，在 4 °C 下 48 小时后，KIM-1 开始显着降解¹⁶。最后，如果样品在室温下短期储存超过 8 小时，或者在 4 °C 下储存超过 16 小时，则应考虑将叠氮化钠或硼酸作为防腐剂，以抑制细菌过度生长和污染¹²。

长期储存的持续时间是另一个重要的考虑因素。与 -20 °C 储存相比，在 -80 °C 下储存样品可显著提高尿蛋白的稳定性，这导致 NGAL 等蛋白质降解的显著可变性^14,13。在 -80 °C 下，样品可以可靠地储存至少 6 个月¹⁶ 和长达 2 年¹⁰。一项研究发现，在 -80 °C 下 5 年后，蛋白质水平略有但显著下降⁸，建议应在 5 年之前对样品进行分析。在样品的长期储存过程中，冻融循环次数应减少到 3 次或更少^10,11。已发现超过三个冻融循环会改变尿液样本¹⁷，此处提供的数据也证实了这一点。值得注意的是，对于文献中没有记录稳定性的生物标志物，我们建议研究人员在计划在 -80 °C 以外的任何温度下储存样品之前考虑进行试点稳定性研究。

关于使用试剂保持蛋白质稳定性尚无共识。鉴于尿液中相对缺乏蛋白酶，尿液样本不需要蛋白酶抑制剂。数据表明，使用和不使用蛋白酶抑制剂储存的尿液样品之间的蛋白质类型或数量没有差异，这支持了这一点。¹⁸ 此外，添加蛋白酶抑制剂对 NGAL、KIM-1 或 NAG¹⁰ 的尿水平没有影响。虽然一些研究使用了蛋白酶抑制剂，但它们的使用在更广泛的尿液生物标志物文献中并未标准化。其他试剂包括防止细菌过度生长的试剂，例如叠氮化钠和硼酸。虽然传统上不在 UTI 生物标志物文献中使用，但应根据感兴趣的生物标志物的机制进行考虑。对于其水平与菌尿程度相关的生物标志物，使用这些试剂可能更可取。可以考虑使用这些试剂的另一种情况是尿液不能在 4 °C 下储存少于 24 小时，或者必须在处理前在室温下长时间储存。虽然在 UTI 生物标志物文献中不常用，但如果担心细菌过度生长并且无法实现最佳储存条件，则可以在样品中添加叠氮化钠或硼酸。¹⁹

离心是减少尿液样本被其他细胞（例如红细胞、白细胞、上皮细胞）的蛋白质污染的重要步骤。样品采集后应快速离心或过滤样品。文献表明，尿液中的细胞可以在样品采集后 20-30 分钟内开始裂解，这可能会混淆蛋白质测量¹²。尽管通常无法进行快速离心，但研究人员必须承认尿液蛋白替代来源的潜力。鉴于脓尿在 UTI 中很常见，对于专注于 UTI 尿液生物标志物的研究人员来说，这是一个重要的考虑因素。离心前不应冷冻样品。事实上，即使事先离心，冷冻样品也可能导致在解冻时形成主要是草酸钙脱水和无定形钙晶体的沉淀。在 -20 °C 下冷冻过夜的样品中，Saetun 等人证明这些沉淀物可能导致尿蛋白水平降低²⁰。支持不冷冻非离心尿液建议的另一个考虑因素是，非离心样品中的潜在细胞裂解可能会进一步混淆结果。

离心后，下一步是将样品分装。要冷冻的尿液等分试样的适当数量取决于个体研究设计。分装到几个试管中可以在以后最大限度地减少冻融循环。等分试样的体积取决于预期的下游应用。大多数 ELISA 或蛋白质印迹使用少量尿液，因此通常每个等分试样至少 0.5 mL 就足够了。然而，无偏倚的方法（例如质谱法）需要更多的尿液量。我们建议确定计划实验所需的最小尿量，以确保足够的尿量。

在该方案中，遗漏了有关特定尿液生物标志物测量的具体细节，因为这在很大程度上取决于个体研究设计。然而，这些生物标志物中的大多数可以使用 ELISA 进行测量。ELISA 的第一步包括用抗体包被 96 孔板。许多试剂盒在附带此步骤时已经完成，但其他试剂盒要求研究人员执行此步骤。用抗体包被板后，下一步是添加标准品、样品和对照品。大多数试剂盒将提供用于 ELISA 的标准品。请务必按照试剂盒的说明进行标准品制备，以确保创建正确的标准曲线。建议使用阴性对照。下一步是添加检测抗体，然后添加酶偶联物。最后一步是添加底物，通常后跟终止缓冲液。此时，ELISA 已准备好由 96 孔板读数仪读取。请遵循制造商的说明，了解如何为相关 ELISA 适当配置读板器。这在解释最终结果时尤其重要。重要的是要适当地注意制造商说明中预期标准曲线的分布，因为这会影响曲线的拟合和结果的准确性。请注意标准曲线的 R² 。这表示曲线符合标准的程度。低 R² 低于 0.90 表明移液不准确，这让人质疑 ELISA 结果的准确性。然后，标准曲线可用于根据读板器产生的吸光度确定生物标志物浓度。

我们的方案与文献中侧重于尿蛋白的其他方案相似，²¹ 许多已发表的尿液生物标志物研究使用类似的方案^{6、23、24、25、26}。研究人员使用蛋白酶抑制剂²⁶ 或过滤尿液样本而不是离心来改变该方案，以使该方案适应没有此类设备的设置 ^4,28。创建单一标准方案的一个主要限制是各种生物标志物具有不同的特性，这可能会影响加工注意事项。此外，下游应用因研究设计而异，这也可能会影响加工。我们强调了本协议中的步骤，以根据研究人员的研究设计的具体情况向研究人员发出可能需要考虑的地方的信号。最后，该协议的重点是 UTI 研究中经常研究的尿蛋白生物标志物。为无偏倚方法（如质谱法）采集的样品可能需要额外的考虑²⁸。此外，其他新型生物标志物，例如 RNA 标志物，将需要独特的方案来实现最佳加工和储存。关于尿组研究的样本注意事项的方案在其他地方²⁹.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
硼酸	Sigma-Aldrich	B6768	对于无法快速处理和冷冻的样品，应考虑
使用 冷冻盒	Fisher Scientific	03-395-464
微量离心管	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA 试剂盒	R&D Systems	DLCN20	用于创建具有代表性的结果
移液器和吸头	取决于移液器尺寸和液体体积。
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002	对于无法快速处理和冷冻的样品，应考虑
使用尿液收集杯	Thermo Scientific	3122B03ORG	除非其他研究需要，否则不需要无菌杯