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方法文章

利用基于 S9.6 的免疫沉淀方法绘制 R-环和 RNA:DNA 杂交体图谱

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DOI：

10.3791/62455

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2021年8月24日

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

本文内容

摘要

R环是一类普遍存在的由转录驱动的非B型DNA结构，其形成依赖于DNA序列及拓扑结构的有利性，并存在于所有基因组中。近年来，R环被发现参与多种适应性与非适应性生物学功能，并与人类疾病背景下的基因组不稳定性相关。因此，准确绘制基因组中这些结构的分布图已成为众多研究者关注的重点。本文介绍了DRIP-seq（DNA:RNA免疫沉淀结合高通量测序），这是一种稳健且可重复的技术，能够实现对R环的精确且半定量的定位。此外，还描述了该方法的最新改进版本，即通过超声处理实现片段化（sDRIP-seq），从而实现链特异性和高分辨率的R环定位。因此，sDRIP-seq克服了传统DRIP-seq方法在分辨率和链特异性方面的若干常见局限，成为R环定位的首选方法。

摘要

R环是一类普遍存在的由转录驱动的非B型DNA结构，其形成依赖于DNA序列及拓扑结构的有利性，并存在于所有基因组中。近年来，R环被发现参与多种适应性和非适应性生物学功能，并与人类疾病背景下的基因组不稳定性相关。因此，精确绘制基因组中这些结构的位置成为众多研究者关注的重点。本文描述了DRIP-seq（DNA:RNA免疫沉淀结合高通量测序）技术，该方法稳定且可重复，能够实现对R环的精确、半定量定位。此外，还介绍了一种该方法的最新改进版本——通过超声处理实现DNA片段化的sDRIP-seq（sonication-based DRIP-seq），可实现链特异性和高分辨率的R环定位。因此，sDRIP-seq克服了传统DRIP-seq在分辨率和链方向性方面的常见局限，成为当前R环定位的首选方法。

引言

R环是三链核酸结构，主要在转录过程中由新生RNA转录本与模板DNA链杂交形成。这导致RNA:DNA杂合体的生成，并使非模板DNA链以单链环状形式被置换出来。生化重建1,2,3,4 和数学建模5，结合其他生物物理测量方法6,7已证实，R环更易出现在具有特定有利特征的区域。例如，当鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）在两条链上的分布呈现链不对称性，使得转录出的RNA富含G（即具有正向GC偏倚）时，该区域在转录过程中更倾向于形成R环，这是因为DNA:RNA杂交链相较于DNA双链具有更高的热力学稳定性。8已进化出正向GC偏斜的区域，例如许多真核基因的起始部分4,9,10,11容易形成R-loop 体外 和 体内3,4,12负性DNA超螺旋张力也有利于结构的形成13,14 因为R环能有效吸收此类拓扑应力，并使周围的DNA纤维恢复至有利的松弛状态5,15.

传统上，R环结构被认为是在转录过程中RNA与DNA偶然自发缠绕而形成的。然而，DNA:RNA免疫沉淀技术（DRIP）与高通量DNA测序（DRIP-seq）的结合应用实现了对R环的首次全基因组范围定位，揭示这类结构在人类细胞中的普遍存在程度远超预期4,16。在哺乳动物基因组中，R环出现在数以万计保守且可转录的基因热点区域，尤其倾向于位于基因第一个内含子重叠的GC偏斜CpG岛以及众多基因的末端区域17。总体而言，在人类细胞中，R环共同占据了基因组的3%–5%，这一比例与其他生物（包括酵母、植物、果蝇和小鼠）中的测量结果一致18,19,20,21,22。

对人类细胞中R-loop形成热点区域的分析表明，这些区域与特定的染色质特征相关23。总体而言，R-loop存在于核小体占据度较低且RNA聚合酶密度较高的区域。在启动子区域，R-loop与两种共转录沉积的组蛋白修饰H3K4me1和H3K36me3的募集增加相关17。在基因末端，R-loop与紧密排列且能高效完成转录终止的基因相关17，这与先前的观察结果一致24。研究还表明，R-loop参与了噬菌体、质粒、线粒体以及酵母基因组复制起始位点的DNA复制起始过程25,26,27,28,29,30,31。此外，76%倾向于形成R-loop的人类CpG岛启动子可作为早期且组成型的复制起始位点32,33,34,35，进一步加强了R-loop与复制起始位点之间的关联。综上所述，这些研究提示R-loop代表了一类新型的生物信号，能够以依赖于上下文的方式触发特定的生物学效应23。

早期研究表明，在免疫球蛋白类别转换重组过程中，R环可在类别转换序列处形成3,36,37。这类程序性R环被认为可通过引入双链DNA断裂来启动类别转换重组38。此后，有害R环的形成（通常理解为R环过度积累所致）被发现与基因组不稳定性以及高频重组、转录-复制碰撞、复制障碍和转录应激等过程相关（综述见39,40,41,42,43）。因此，改进R环结构的定位技术，成为深入解析这些结构在健康与疾病状态下分布及功能的一项重要而迫切的挑战。

DNA:RNA 免疫沉淀（DRIP）依赖于 S9.6 单克隆抗体对 DNA:RNA 杂交体的高亲和力44。DRIP-seq 可实现 R-loop 形成的稳健全基因组分析4,45。尽管该技术具有实用性，但由于使用限制性内切酶进行温和的 DNA 片段化，其分辨率有限。此外，DRIP-seq 无法提供 R-loop 形成方向性的信息。本文中，我们报道了一种 DRIP-seq 的改进方法，可在链特异性基础上以高分辨率定位 R-loop。该方法在免疫沉淀前采用超声处理对基因组进行片段化，因此称为 sDRIP-seq（超声处理偶联高通量测序的 DNA:RNA 免疫沉淀）（图 1）。超声处理的使用提高了分辨率，并减少了 DRIP-seq 方法中由限制性内切酶引起的片段化偏差46。sDRIP-seq 生成的 R-loop 图谱与 DRIP-seq 结果以及先前报道的高分辨率 DRIPc-seq 方法结果高度一致，后者通过对免疫沉淀获得的 R-loop 结构中的 RNA 链构建测序文库来实现分析45。

面对众多可选方法，用户可能会疑惑哪种基于DRIP的方法更符合自身需求。我们提供以下建议。DRIP-seq尽管存在局限性，但在技术上最容易操作，且是本文讨论的三种方法中最为稳健（产量最高）的一种，因此仍具有广泛的应用价值。目前已发表大量DRIP-seq数据集，可为新数据提供有用的比较基准。此外，由于数据无链特异性，其生物信息学分析流程更为简单。建议新用户首先通过DRIP结合定量聚合酶链式反应（qPCR）以及DRIP-seq来逐步掌握R-loop定位技术。sDRIP-seq的技术难度略高：由于超声处理（见下文）导致产量略有降低，且测序文库构建过程稍复杂。然而，其所获得的链特异性和更高分辨率具有重要价值。需注意的是，sDRIP-seq可同时捕获双链RNA:DNA杂交体和三链R-loop结构。而由于文库构建步骤的限制，DRIP-seq无法捕获双链RNA:DNA杂交体。DRIPc-seq技术要求最高，且需要更多的起始材料。作为回报，它提供了最高的分辨率和链特异性。由于测序文库来源于R-loop或杂交体中的RNA部分，DRIPc-seq可能受到RNA污染的干扰，尤其是因为S9.6抗体对双链RNA（dsRNA）具有残余亲和力19,47,48。相比之下，sDRIP-seq的测序文库源自DNA链，因此可在无需担忧RNA污染的前提下实现链特异性和高分辨率定位。总体而言，这三种方法均具有应用价值，各自在复杂程度和技术注意事项方面略有不同。然而，三者所产生的数据集高度一致48，且均对RNase H预处理高度敏感，后者是确保信号特异性的关键对照45,49。需要注意的是，由于测序文库构建过程中存在片段大小筛选，一些较小的杂交体（估计<75 bp），例如在滞后链DNA复制引发位点（冈崎引物）周围短暂形成的杂交体，将被排除在外。同样，由于所有DRIP方法均涉及DNA片段化，那些依赖负超螺旋结构维持稳定的不稳定的R-loop也将丢失5。因此，DRIP类方法可能低估R-loop的丰度，特别是对于短小且不稳定的R-loop，这类结构可能更适合通过in vivo方法进行捕获45,48。值得注意的是，R-loop也可在单DNA分子水平上，通过亚硫酸氢钠处理后，以不依赖S9.6抗体的方式，在深度测序、高分辨率及链特异性条件下进行分析12。此外，已有研究采用催化失活的RNase H1酶策略，在in vivo条件下定位天然R-loop，揭示了主要在暂停启动子区域形成的短小而不稳定的R-loop50,51,52。

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方案

以下方案针对培养条件下生长的人类Ntera-2细胞系进行了优化，但无需修改即可成功应用于其他多种人类细胞系（HEK293、K562、HeLa、U2OS）、原代细胞（成纤维细胞、B细胞），以及经少量修改后适用于其他生物体（小鼠、果蝇）。

1. 细胞收获与裂解

  1. 将Ntera-2细胞培养至75%–85%融合度。确保最佳细胞数量为500万至600万个细胞，并 >开始任何DRIP实验前，细胞存活率需达到90%。
  2. 用1×PBS洗涤细胞一次，加入1.5 mL 1×胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育2分钟，直至细胞从培养皿上脱落。
  3. 加入5 mL预热的培养基，用移液器充分吹打使细胞重悬为单细胞悬液。将悬液转移至新的15 mL离心管中，在300 x g条件下轻柔离心沉淀细胞。 g 3 分钟
  4. 用 5 mL 1×PBS 洗涤细胞一次，在 300 × g 条件下轻柔离心收集细胞 g 3 分钟。
  5. 将细胞完全重悬于1.6 mL TE缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 7.5，1 mM EDTA pH 8.0）中。加入5 µL蛋白酶K（20 mg/mL储存液）和50 µL SDS（20%储存液），轻轻倒置离心管5次，直至溶液变得黏稠。切勿使用移液器吹打混合，仅通过倒置混匀。
  6. 37 °C 下孵育试管过夜。

2. DNA 提取

  1. 将DNA裂解液倒入预先离心过的15 mL高密度相锁凝胶管中，加入1倍体积（1.6 mL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。轻柔倒置混合5次，然后在1,500 × g 条件下离心5分钟。
  2. 在新的15 mL离心管中加入1/10体积的3 M醋酸钠（NaOAc）（pH 5.2）和2.5倍体积的100%乙醇。将相锁凝胶管中的上层水相倒入该管中，轻柔倒置直至DNA完全沉淀（最多10分钟）。
  3. 使用宽口1,000 µL吸头卷取DNA丝状物，并转移至洁净的2 mL离心管中，注意避免带入残留的上清液。
  4. 向管中加入1.5 mL 80%乙醇洗涤DNA，轻柔倒置管子5次，孵育10分钟。
  5. 重复上一步骤两次。洗涤过程中不得离心。最后一次洗涤后，用移液器尽可能吸除乙醇，注意不要扰动DNA沉淀。
  6. 将管子倒置，使DNA在空气中彻底干燥。此步骤可能需要30分钟至1小时，具体时间取决于DNA的量。
  7. 直接在DNA沉淀上加入125 µL TE缓冲液，用于限制性内切酶消化进行DNA片段化；或加入100 µL TE缓冲液，用于超声波剪切进行DNA片段化。将样品置于冰上1小时，使用宽口200 µL吸头轻轻吹打数次以充分重悬DNA。在开始片段化步骤前，继续将样品置于冰上保存1小时。

3. DNA 片段化

注意：进行基于限制性内切酶的 DRIP-seq 时，请执行步骤 3.1；进行基于超声处理的 DRIP-seq 时，请跳至步骤 3.2。

  1. 限制性内切酶（RE）片段化
    1. 根据供应商说明书，使用限制性内切酶混合物对重悬的基因组DNA（黏稠度很高）进行消化。
      1. 在最终反应体系中加入0.1 mM的亚精胺。使用包含4–5种酶的混合酶体系，每种酶加入30 U，总体积为150 µL。
        注：DRIP-seq最初使用的酶组合（HindIII、SspI、EcoRI、BsrGI、XbaI）4旨在产生平均长度为5 kb的DNA片段。应避免影响CpG甲基化，并保留基因组中的GC富集区域。其他酶组合也可使用16。这些酶组合适用于人和小鼠基因组，但可根据需要进行调整。
      2. 将反应混合物在37 °C下孵育过夜。
        注：消化后的DNA混合物不应再具有黏稠性。若此步骤中仍存在黏稠感，表明消化不完全。
      3. 若观察到黏稠性，可额外加入每种酶10 U，并在37 °C下继续孵育2–4小时。
        注：若用户收获的细胞数量超过推荐量，可能无需消化全部沉淀。
    2. 将过夜消化的DNA（150 µL）轻柔地转移至已预离心的2 mL相锁凝胶轻质管中。加入100 µL水和等体积（250 µL）的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。轻柔颠倒混合5次，然后在16,000 × g下离心10分钟。
    3. 在新的1.5 mL离心管中加入1.5 µL糖原、1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）和2.5体积的100%乙醇。将相锁凝胶管中的DNA溶液转移至该管，颠倒混合5次。在-20 °C下孵育1小时。
    4. 在4 °C下以16,000 × g离心35分钟。用200 µL 80%乙醇洗涤DNA沉淀，在4 °C下以16,000 × g离心10分钟。
    5. 将沉淀空气干燥后，加入50 µL TE缓冲液。将离心管置于冰上30分钟，轻柔地重悬DNA。
    6. 使用分光光度计测定片段化DNA的浓度（OD260）。
    7. 可选但推荐：取1 µg消化后的DNA与分子量标记物一同上样至0.8%琼脂糖凝胶，以验证消化是否完全。在100 V电压下电泳1小时。
      注：若消化不完全，可补充添加酶。消化不完全可能导致免疫沉淀后分辨率下降。
    8. 此步骤后，取10 µg消化后的DNA加入4 µL核糖核酸酶H（RNase H），在37 °C下处理1–2小时，以确保免疫沉淀获得的信号来源于DNA:RNA杂交体。随后进行S9.6免疫沉淀（步骤4）。
      ​注：消化后的DNA可在-80 °C冷冻保存长达一个月，产量无明显损失。
  2. 超声处理
    1. 将提取的全部或部分DNA置于0.5 mL微量离心管中，总体积为100 µL，进行超声处理。在超声仪上执行15–20个循环（每个循环30秒开启/30秒关闭）（分别在第5、10和15个循环后短暂离心，以确保超声均匀）。
    2. 使用分光光度计测定超声处理后DNA的浓度（OD260）。
      注：此步骤中DNA的黏稠性应已消失。
    3. 进行琼脂糖凝胶电泳，确认超声后DNA的片段大小分布（300–500 bp）。
      ​注：过度超声可能导致R-loop结构断裂和解离，从而显著降低产量。
    4. 此步骤后，取10 µg超声处理的DNA加入4 µL RNase H，在37 °C下处理1–2小时，以确保免疫沉淀获得的信号来源于DNA:RNA杂交体。随后进行S9.6免疫沉淀（步骤4）。

4. S9.6 免疫沉淀

注意：无论 DNA 是通过限制性内切酶（REs）还是超声处理进行片段化，免疫沉淀步骤均相似。

  1. 准备三个离心管，每管中加入4.4 µg的片段化DNA，最终体积为500 µL TE缓冲液。从每管中保留50 µL（总体积的1/10）用于后续作为输入DNA。
  2. 向450 µL稀释后的DNA中加入50 µL 10x结合缓冲液（100 mM NaPO₄ pH 7，1.4 M NaCl，0.5% Triton X-100）和10 µL S9.6抗体（1 mg/mL）。
  3. 在4 °C下，于微型管旋转仪上以7–10 rpm转速孵育过夜。
  4. 对于每个离心管，用700 µL 1x结合缓冲液洗涤50 µL Protein A/G琼脂糖珠悬液，在室温下于微型旋转仪上以7–10 rpm转速颠倒混匀10分钟。在1,100 × g离心1分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
  5. 将步骤4.3中的DNA加入50 µL珠子中，在4 °C下于微型旋转仪上以7–10 rpm转速颠倒孵育2小时。
  6. 在1,100 × g离心1分钟，弃去上清液。
  7. 用750 µL 1x结合缓冲液在微型旋转仪上以7–10 rpm转速颠倒洗涤珠子15分钟。在1,100 × g离心1分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
  8. 向珠子中加入250 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris-Cl pH 8，10 mM EDTA pH 8，0.5% SDS）和7 µL蛋白酶K（20 mg/mL原液），在55 °C下以12 rpm转速旋转孵育45分钟。
  9. 在1,100 × g离心1分钟。将上清液转移至预离心的2 mL相锁凝胶轻质管中，加入等体积（250 µL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）。轻轻颠倒混匀五次，在室温下于16,000 × g离心10分钟。
  10. 在新的1.5 mL离心管中加入1.5 µL糖原、1/10体积的3 M NaOAc（pH 5.2）和2.5体积的100%乙醇。用移液器将相锁凝胶管中的DNA转移至该管，颠倒混匀五次。在-20 °C孵育1小时。
  11. 在4 °C下于16,000 × g离心35分钟。用200 µL 80%乙醇洗涤DNA，在4 °C下于16,000 × g离心10分钟。
  12. 将沉淀空气干燥，每管中加入15 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8）。将离心管置于冰上20分钟，轻轻重悬。将三个离心管的内容物合并至一个离心管中（共45 µL）。
  13. 使用5 µL重悬后的DNA（共45 µL）进行qPCR检测DRIP效率（参见代表性结果）。将5 µL DNA用10 µL水稀释，每反应使用2 µL。

5. 仅针对超声处理DNA的文库前步骤

注意：超声处理会导致R-loop中的移位单链DNA断裂。因此，三链R-loop结构在超声处理后会转化为双链DNA:RNA杂合体。结果，在建库前必须将这些DNA:RNA杂合体重新转化为双链DNA。此处采用第二条链合成步骤。另一种已被成功使用的方法是先进行单链DNA连接，再进行第二条链合成53。

  1. 向步骤 4.12 中获得的 40 µL DRIP 富集 DNA 中加入 20 µL 5x 第二链缓冲液（200 mM Tris pH 7，22 mM MgCl2，425 mM KCl）、10 mM dNTP 混合物（dATP、dCTP、dGTP 和 dTTT 或 dUTP，若用户计划进行链特异性 DRIP 测序）、1 µL 16 mM NAD 以及 32 µL 水。充分混匀后，冰上孵育 5 分钟。
  2. 加入 1 µL DNA 聚合酶 I（10 单位）、0.3 µL RNase H（1.6 单位）和 0.5 µL E. coli DNA 连接酶。混匀后，于 16 °C 孵育 30 分钟。
  3. 立即使用磁性磁珠以 1.6x 的比例纯化反应产物。用 40 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8）洗脱 DNA。

6. 仅针对限制性内切酶 DNA 的文库前超声处理步骤

注意：DRIP 会导致回收的 RE 片段通常长达数千个碱基对，因此不适合直接进行文库构建。

  1. 为缩小文库构建所需材料的片段大小，在0.5 mL微量离心管中对免疫沉淀的DNA进行超声处理。在超声仪上执行12个循环，每个循环为15秒开启、60秒关闭（每完成6个循环后离心一次，以确保超声处理均匀）。随后进行第7步。
    注意：免疫沉淀的材料仍含有三链R-loop结构，其对超声处理的响应与侧翼的双链DNA不同。
  2. 可选步骤：为使DRIP图谱更加均一，可在超声处理前，将免疫沉淀的材料在1×RNase H缓冲液中加入1 µL RNase H，在37 °C孵育1小时。

7. 文库构建

  1. 进行末端修复：向步骤 4.12（限制性内切酶片段化）或步骤 5.3（超声剪切）得到的 40 µL 产物中加入 5 µL 10x 末端修复模块缓冲液、2.5 µL 10 mM ATP 和 2.5 µL 末端修复模块酶（总体积为 50 µL）。充分混匀，室温孵育 30 分钟。加入 1 µg 经限制性内切酶消化并超声处理（DRIP）或仅超声处理（sDRIP）的输入 DNA，以构建对应于输入 DNA 的对照测序文库。
  2. 使用磁性磁珠（1.6 倍体积比）纯化反应产物，并用 34 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8）洗脱。
  3. 进行 A 尾添加：加入 5 µL 缓冲液 2、10 µL 1 mM dATP 和 1 µL Klenow exo- 酶（总体积为 50 µL）。充分混匀后，37 °C 孵育 30 分钟。
  4. 使用磁性磁珠（1.6 倍体积比）纯化反应产物，并用 12 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8）洗脱。
  5. 连接接头：加入 15 µL 2x 快速连接缓冲液、1 µL 15 µM 接头和 2 µL 快速连接酶（总体积为 30 µL）。充分混匀，室温孵育 20 分钟。
  6. 使用磁性磁珠（1 倍体积比）纯化反应产物，并用 20 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8）洗脱。
  7. 若进行了超声剪切且在步骤 5.1 中使用了 dUTP，则加入 1.5 µL（1.5 U）尿嘧啶 N-糖基化酶，37 °C 孵育 30 分钟，以获得链特异性 DRIP 文库。
  8. 取步骤 6.6 或 6.7 得到的文库 10 µL 进行 PCR 扩增。加入 1 µL PCR 引物 1.0 P5（见材料表）、1 µL PCR 引物 2.0 P7（见材料表）、15 µL 预混液和 3 µL 水。充分混匀。
  9. 在热循环仪中运行表 1所示程序。
  10. 对文库进行两步磁性磁珠纯化。首先使用 0.65 倍体积比去除大于 500 bp 的片段，保留上清液；随后对上清液使用 1 倍体积比磁珠去除小于 200 bp 的片段。最后用 12 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8）洗脱。

8. 质量控制

  1. 使用Pfaffl方法，通过qPCR检测两个阴性位点和三个阳性位点的R-loop富集情况，取自步骤6.10纯化后的文库1 µL。将1 µL文库稀释于10 µL水中，每个位点使用2 µL进行检测。
  2. 使用高灵敏度DNA试剂盒检测步骤6.10中纯化后文库的片段大小分布。

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结果

DRIP 和 sDRIP 均可通过 qPCR（图 2A）和/或测序（图 2B）进行分析。免疫沉淀步骤完成后，必须首先通过针对阳性与阴性对照位点的 qPCR，以及经 RNase H 处理的对照样本来确认实验质量。多个常用人源细胞系中常见位点所对应的引物列于表 2中。qPCR 结果应以输入量（input）的百分比形式展示，该数值对应于裂解时特定基因座上存在 R-loop 的细胞所占的比例。在成功的 DRIP 实验中，阴性位点的回收率应低于 0.1%，而阳性位点的回收率则可从 1% 到高度转录位点（如 RPL13A）超过 10% 不等（图 2A）。对于 sDRIP，其回收率通常较低（约为 DRIP 的 20%–50%），但据 DRIP-qPCR 判断，这种降低是均匀的，因此不会对某一特定亚群的 R-loop 造成更显著的影响。因此，由 DRIP、sDRIP 和 DRIPc 获得的图谱具有良好的一致性（

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讨论

本文介绍了两种利用 S9.6 抗体在几乎所有生物体中绘制 R-loop 结构的实验方案。DRIP-seq 是首个开发出的全基因组范围 R-loop 定位技术，操作简便、稳健且可重复，可用于绘制 R-loop 在任意基因组中的分布情况。第二种技术称为 sDRIP-seq，同样具有良好的稳健性和可重复性，但由于引入了超声处理步骤以及链特异性测序文库构建流程，因而实现了更高的分辨率和链特异性。两种技术在免疫沉淀前均对 RNase H 处理高度敏感，证实所检测信号主要来源于真实的 RNA:DNA 杂交体。最后，在比较 R-loop 阳性位点与 R-loop 阴性位点的免疫沉淀富集效率时，这两种方法在多种人源细胞系中均可达到最高达 100 倍的差异，从而实现高特异性、低背景的精确作图。

在考虑采用何种方法时，有必要评估它们各自的优势与局限性。如前所述，DRIP-seq 产生的图谱分辨率较低，且无法提供 R-loop 形成的链特异性信息。分辨率较低主要源于使用限制性内切酶（REs）对基因组进行片段化。这种温和的方法最有利于 R-loop 的保存，从而实现对这些结构无与伦比的富集效率，使 DRI...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

Chedin 实验室的工作由美国国立卫生研究院（R01 GM120607）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 管 高密度 Maxtract 相锁凝胶Qiagen129065
2 mL 管 相锁凝胶轻型VWR10847-800
琼脂糖 A/G 珠ThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP 珠Beckman CoulterA63881
AmpErase 尿嘧啶 N-糖基化酶ThermoFisher ScientificN8080096
Index 接头Illumina对应 TrueSeq 单端索引
Klenow 片段（3’ 到 5’ 外切酶缺陷型）New England BioLabsM0212S
NEBNext 末端修复模块New England BioLabsE6050
文库扩增用 PCR 引物引物 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
文库扩增用 PCR 引物PCR 引物 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
苯酚/氯仿/异戊醇 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash 高保真 PCR 预混液ThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation 试剂盒New England BioLabsM2200S
核糖核酸酶 HNew England BioLabsM0297S
S9.6 抗体KerafastENH001这三个来源等效
S9.6 抗体Millipore/SigmaMABE1095
S9.6 抗体Abcamab234957

参考文献

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