使用[18F]FDG微正电子发射断层扫描/磁共振成像对小鼠棕色和米色脂肪组织进行可视化与定量分析

摘要

利用微型PET/MR成像方法对小鼠产热性脂肪组织库进行功能成像与定量分析。

摘要

棕色和米色脂肪细胞现已被认为是治疗肥胖症和代谢综合征的潜在靶点。无创分子成像方法对于深入了解这些产热型脂肪组织库至关重要。本文所述方案介绍了一种基于正电子发射断层扫描/磁共振成像（PET/MR）的技术，用于评估小鼠肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）和腹股沟皮下白色脂肪组织（iWAT）中棕色及米色脂肪细胞的活性。通过将不可代谢的葡萄糖类似物放射性示踪剂[¹⁸F]FDG与磁共振成像提供的精确解剖学信息相结合，实现了对产热型脂肪组织库的可视化与定量分析。PET/MR成像在冷适应7天后进行，并对不同脂肪组织库中[¹⁸F]FDG信号进行定量，以评估产热型脂肪组织的相对动员水平。去除iBAT后，小鼠iWAT中由寒冷诱导的[¹⁸F]FDG摄取显著增加。

引言

为应对不断变化的营养需求，脂肪组织作为能量储备库，可在脂质储存或动员模式之间转换，以满足机体需求¹。此外，脂肪组织还通过一种称为非颤抖性产热（也称兼性产热）的过程，在体温调节中发挥关键作用。这一过程通常由棕色脂肪组织（BAT）实现，其表达大量线粒体膜蛋白解偶联蛋白1（UCP1）。作为质子转运体，UCP1通过解偶联质子转运与ATP生成来产生热量²。在寒冷刺激下，棕色脂肪组织的产热作用由交感神经系统（SNS）激活启动，随后释放去甲肾上腺素（NE）。NE与β3肾上腺素能受体结合，导致细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平升高。由此，cAMP/PKA依赖性激活CREB（cAMP反应元件结合蛋白），并通过直接结合CREB反应元件（CRE）促进Ucp1基因的转录²。除BAT外，白色脂肪组织中也存在类似棕色脂肪的细胞，因此被称为米色或brite（白色脂肪中的棕色样）细胞^1,3。在特定刺激（如寒冷）作用下，这些原本静息状态的米色细胞被重塑，表现出多种类似棕色脂肪的特征，包括多房性脂滴、致密排列的线粒体以及UCP1表达的增强^3,4,5。

动物研究表明，棕色和米色脂肪细胞除了具有减少脂肪的作用外，还具备多种代谢益处，包括提高胰岛素敏感性、降低血脂、抗炎以及抗动脉粥样硬化^6,7。在人体中，米色/棕色脂肪的含量与年龄、胰岛素抵抗指数及心脏代谢性疾病呈负相关⁸。此外，通过冷适应或β3肾上腺素受体激动剂激活人体内的米色/棕色脂肪细胞，可对一系列代谢紊乱起到保护作用^4,9,10。这些证据共同表明，诱导棕色和米色脂肪组织生成是一种潜在的治疗肥胖及其相关医学并发症的策略⁸。

有趣的是，尽管米色脂肪细胞和经典的棕色脂肪细胞功能相似，但它们来源于不同的前体细胞，并通过部分重叠却 distinct 的机制被激活。¹因此， 体内 对棕色和米色脂肪细胞进行成像与定量，对于深入理解这些脂肪组织的分子调控机制至关重要。目前 ¹⁸F-氟脱氧葡萄糖（[¹⁸F]FDG 正电子发射断层扫描（PET）联合计算机断层扫描（CT）仍是临床研究中鉴定产热型棕色和米色细胞的金标准⁸磁共振成像（MRI）利用强磁场和射频脉冲生成详细的解剖结构图像。与CT扫描相比，MRI在生成器官和软组织图像时具有更高的分辨率。本文提供了一种在小鼠模型中经寒冷暴露适应后，对功能性棕色和米色脂肪进行可视化与定量分析的实验方案，寒冷暴露是诱导脂肪褐变最常用且最可靠的方法。该方法可用于高精度表征小型动物模型中的产热性脂肪组织。

方案

下述方案遵循香港大学的动物护理指南。研究中使用的动物为8周龄的C57BL/6J小鼠。

1. 动物手术操作与冷暴露实验

1. 进行肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）解剖。
   1. 通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮100 mg/kg体重，赛拉嗪10 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。麻醉后，剃除小鼠从颈部至肩胛骨下方区域的毛发。
   2. 消毒后将小鼠置于加热垫上，沿背部中线做一条长约2 cm的切口。
   3. 切除双侧iBAT脂肪垫。假手术组小鼠进行相同切口操作，但保留iBAT脂肪垫完整。
   4. 待出血停止后，使用7 mm不锈钢伤口夹闭合切口。
   5. 术后给予小鼠美洛昔康（5 mg/kg，溶于饮用水）连续6天，并将小鼠饲养于重症监护单元（ICU）中14天。伤口愈合后（7–10天）及时拆除伤口夹。
2. 小鼠冷刺激实验：将小鼠置于热中性环境（30 °C）中饲养14天。第13天，将动物笼具预先置于低温（6 °C）环境中过夜。第14天，将小鼠转移至环境控制舱内，于6 °C条件下持续暴露7天，每笼放置两只小鼠。

2. 微型PET/MR校准与工作流程设置

注意：微正电子发射断层扫描/磁共振成像（Micro-PET/MR）采用顺序式 PET/MR 系统进行（参见材料表）。每只小鼠被放置于成像床后，首先进行磁共振扫描以获取解剖定位参考图像（定位像），随后移至 PET 视野（FOV）中心进行静态 [¹⁸F]FDG PET 采集，接着再次进行磁共振成像以获取解剖参考。在扫描仪操作软件中（参见材料表）预先创建成像工作流程，以便在成像开始前实现自动化的顺序 PET/MR 扫描。

1. 在操作软件中创建一个成像工作流程，包括静态PET采集、用于衰减校正的MRI采集，以及分别使用T1加权3D成像和T2加权2D成像进行解剖参考。
2. 进行PET采集时，设置400–600 keV能级判别、F-18同位素模式、1–5符合模式，并进行20分钟扫描。
3. 进行T1加权MR采集（用于衰减校正）时，设置梯度回波3D序列（TE = 4.3 ms，TR = 16 ms，视野FOV = 90 × 60 mm，激发次数NEX = 3，28层，层厚0.9 mm，体素大小 = 0.375 × 0.375 × 0.9 mm）。
4. 进行T2加权MR采集（用于解剖参考）时，设置快速自旋回波2D序列（TE = 71.8 ms，TR = 3000 ms，视野FOV = 90 × 60 mm，NEX = 5，32层，层厚0.9 mm，体素大小 = 0.265 × 0.268 × 0.9 mm³）。
5. 进行PET图像重建时，采用Tera-Tomo 3D（TT3D）算法（8次迭代，6个子集），使用1–3符合模式，并结合衰变、死时间、随机符合、衰减和散射校正，生成总体体素大小为0.3 mm³的图像。
6. 在开始成像研究前一天，对micro-PET/MR扫描仪执行一次PET活度测试，以检查PET定量的准确性。
   1. 按照制造商指南准备一支5 mL注射器，内含[¹⁸F]FDG（水中或生理盐水中，活度为140–220 μCi/5–8 MBq）。
   2. 使用活度计（见材料表）记录注射器的活度，并记录测量时间。
   3. 选择插值椭圆感兴趣区域（ROI），在重建图像上绘制感兴趣体积（VOI），将恢复的活度值与上述实测值进行比较。经过良好校准的扫描仪，其恢复活度的准确度应在±5%以内。

3. 注射[¹⁸F]FDG

1. 向供应商订购一次临床剂量的 [¹⁸F]FDG（10 mCi/370 MBq），确保其在首次预定注射时间前约 30 分钟送达影像实验室。接收含有放射性物质的包裹时，务必穿戴适当的个人防护装备（PPE），例如实验服、手套以及个人辐射剂量计（如手指剂量计和全身剂量计）。定期更换手套，以防止放射性交叉污染，并尽可能增大与放射源之间的距离。
2. 使用镊子小心地将 [¹⁸F]FDG 原液小瓶转移至 L 型屏蔽块后方的台面上。
3. 取一份 [¹⁸F]FDG 原液，用无菌生理盐水稀释，使其总体积为 100–150 μL，放射性活度浓度达到 200–250 μCi/7–9 MBq。
4. 使用带针头的 1 mL 注射器（见材料表）抽取 [¹⁸F]FDG 溶液，用设定为 F-18 的活度计测量放射性活度，并记录测量时间。
5. 在注射前记录小鼠体重。通过尾静脉注射已配制的 [¹⁸F]FDG 溶液。记录注射时间以及注射后注射器内残留的放射性活度，以便进行衰变校正。
6. 将小鼠放回笼中，在进行 PET 扫描前让其摄取 [¹⁸F]FDG 60 分钟。
7. 使用以下公式¹¹计算注入的 [¹⁸F]FDG 活度：
   注入活度（μCi/MBq）
   = 注射前注射器中的活度
   – 注射后注射器中的活度

4. 微型PET/MR采集

1. 打开小鼠加热床的空气加热器，使暖空气通过加热床。
2. 使用5%异氟烷（1 L/min医用O₂）对小鼠进行麻醉。麻醉诱导后，将小鼠转移至预热的加热床上，并通过鼻罩接头以2%-3%异氟烷维持麻醉。将小鼠头部俯卧固定于咬合杆上，确保小鼠身体不超出加热床直径范围。涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥和角膜溃疡形成。
3. 分别使用体温探针和呼吸监测垫监测小鼠体温和呼吸频率。通过调节异氟烷浓度，将体温维持在36–37 °C，呼吸频率维持在70–80次/分钟（bpm）。
4. 进行定位扫描以确定小鼠位置。调整小鼠床位置，确保包含整个小鼠身体，并使磁共振（MR）成像的中心视野（FOV）位于小鼠身体中心。
5. 在研究列表窗口中，于PET Acquisition下选择Scan Range on Previous Acquisition，以使用上述定位扫描所确定的位置。点击Prepare将动物床从MR移至PET。选择OK启动PET扫描。在Radiopharmaceutical Editor中记录注射剂量及[¹⁸F]FDG给药前后的时间。在Subject Information菜单下输入小鼠体重。
6. PET扫描完成后，选择Prepare将动物床移回MR，并完成研究列表窗口中的所有MR扫描序列。点击OK开始MR扫描。
7. 整个工作流程完成后，使用后处理软件（参见Table of Materials）初步评估所获取MR图像的质量。点击Home按钮，将小鼠床从MR移回原始位置。
8. 小心将小鼠从扫描仪中取出，并放回底部带有加热垫的清洁饲养笼中，使其在温暖环境中恢复。为小鼠提供食物和饮水。系统现已准备就绪，可进行下一只小鼠的扫描。
9. 进行数据重建时，在Raw Scan菜单下选择PET Acquisition以加载已完成的PET扫描数据。选择T1-weighted MR Acquisition用于生成组织图。按上述方法进行数据重建（参见步骤2.5）。
10. 遵循当地及所在机构关于PET成像后小鼠护理与处理的相关规定。所有使用过的注射器/针头、手套、垫料及粪便均应视为放射性废物，须依照当地法规进行特殊处理和处置。

5. 成像后分析

1. 打开图像分析软件（参见材料表），点击加载DICOM数据以获取相应的MR和PET图像。
2. 通过将MR和PET图像拖拽至显示窗口进行图像配准，然后点击自动配准功能。
   1. 在配准设置下拉菜单中选择刚性变换，在刚性/仿射菜单下勾选平移和旋转。
   2. 在全局角色选择菜单中，选择T1加权MR采集图像作为参考图像，选择PET采集图像作为重切图像。
   3. 在三个维度上检查配准结果，确保MR与PET图像完全对齐。如需手动调整，请点击手动配准。
3. 使用插值椭圆ROI工具，参考MR图像在感兴趣组织（即iBAT和腹股沟白色脂肪组织iWAT）上绘制VOI。使用画笔工具和橡皮擦工具定义VOI边界，从而准确反映组织解剖结构。利用PET图像确认无摄取重叠，避免邻近器官的溢出效应。逐层重复此操作，直至完成整个VOI的勾画。如有必要，对VOI进行编辑，以保持各小鼠之间VOI体积的一致性。
4. 使用椭球VOI工具在肺部绘制一个3 mm³的VOI作为参考器官，避免来自邻近心脏和肌肉的溢出干扰。
5. 完成操作后，点击显示ROI表格，为每个VOI重命名。将各VOI内的平均放射性活度及组织体积记录至电子表格中。将VOI勾画结果和影像数据归档至数据存储设备。
6. 使用以下公式¹¹计算所有VOI的标准摄取值（SUV）：
   SUV_mean = VOI内放射性活度（kBq）/（衰变校正后的注射剂量（kBq）/ 小鼠体重（kg）)，假设组织密度为1 g/mL。 

结果

本研究中，三组小鼠（每组 n = 3）接受了微型 PET/MR 成像，这些小鼠分别在热中性环境（30 °C）或寒冷环境（6 °C）中饲养 7 天。其中一组小鼠（n = 3）在寒冷处理前被切除肩胛间棕色脂肪组织（iBATx）（图 1A）。该方法导致所有三只小鼠的白色脂肪组织活性发生改变。特别是，通过微型 PET/MR 成像观察到，iWAT 中 [¹⁸F]FDG 摄取显著增加（图 1B-C）。该共配准成像数据以最大强度投影（MIP）形式展示，其中 iWAT 被清晰勾画，以便对 [¹⁸F]FDG 摄取进行定量分析。一致地，与假手术组相比，iBATx 小鼠的 iWAT 中出现更多具有多房脂滴特征的米色脂肪细胞（图 1D）。

为了验证在长期冷刺激下iBAT和iWAT活性的变化是否可通过微型PET/MR成像进行监测，对暴露于30 °C和6 ...

讨论

本研究描述了一种基于PET/MR的小动物功能性棕色和米色脂肪组织成像与定量方法。该方法采用不可代谢的葡萄糖类似物[¹⁸F]FDG作为成像生物标志物，以无创方式识别具有高葡萄糖需求的脂肪组织。MR具有良好的软组织对比度，能够更清晰地区分脂肪组织与邻近的软组织及肌肉。当与PET结合时，可准确地对因高葡萄糖利用而激活的脂肪细胞进行成像和定量。本文所述实验条件突出了使用[¹⁸F]FDG PET在活体（in vivo）条件下研究诱导型棕色脂肪组织（iBAT）和诱导型白色脂肪组织（iWAT）上调的可行性，有望用于评估新型候选药物的产热效应。此外，通过使用特制的动物床同时对多只小鼠进行成像，该方案可轻松改造为高通量模式，从而在降低成本和时间的同时，提高成像数据的统计效力和可靠性^12,13。

目前，[¹⁸F]FDG PET/CT 仍是可视化人类和啮齿类动物棕色脂肪组织（BAT）最常用的方法，且已有成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 无菌生理盐水	BBraun		0.9% 氯化钠静脉输注液，500 mL
5 mL 注射器	Terumo	SS05L	5 mL 鲁尔锁注射器
放射性活度计	Biodex		Atomlab 500
眼用润滑剂	Alcon Duratears		无菌眼用润滑软膏，3.5 g
胰岛素注射器	Terumo	10ME2913	1 mL 带针胰岛素注射器
InterView Fusion 软件	Mediso	Version 3.03	图像后处理与分析软件
异氟烷	Chanelle Pharma		Iso-Vet，吸入用麻醉剂，250 mL
氯胺酮	Alfasan International B.V.	HK-37715	10% 氯胺酮注射液，10 mL
医用氧气	Linde HKO	101-HR	压缩气体，纯度 99.5%
美达佳（Metacam）	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL 美洛昔康注射液（用于犬猫），10 mL
nanoScan PET/MR 扫描仪	Mediso		3 特斯拉磁共振
Nucline nanoScan 软件	Mediso	Version 3.0	扫描仪操作软件
伤口夹钉	Reflex 7	203-100	7 mm 不锈钢伤口夹钉，20 枚
赛拉嗪	Alfasan International B.V.	HK-56179	2% 赛拉嗪注射液，30 mL