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方法文章

细胞迁移与细胞黏附实验用于研究Leishmania与宿主细胞的相互作用

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DOI：

10.3791/62461

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2021年8月4日

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1Laboratory of Host - Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文通过研究Leishmania感染的树突状细胞的迁移，探讨Leishmania与宿主相互作用的影响。文中描述了树突状细胞的分化与感染、迁移分析，以及黏附复合体和肌动蛋白动态的评估。该方法也可应用于其他被Leishmania或其它胞内寄生虫物种感染的宿主细胞迁移研究。

摘要

利什曼原虫 是一种胞内原生动物寄生虫，可引起多种临床表现，从可自愈的局限性皮肤损害到致死率极高的内脏型疾病不等。全球约有1200万人感染，另有3.5亿人面临感染风险。已知被该寄生虫感染的宿主细胞 利什曼原虫 寄生虫（如巨噬细胞或树突状细胞）可迁移至不同宿主组织，但迁移在寄生虫扩散与归巢过程中的作用仍不甚清楚。因此，评估这些寄生虫调节宿主细胞反应、黏附及迁移能力，将有助于揭示疾病扩散与内脏化涉及的机制。细胞迁移是一个复杂过程，细胞通过极化和突起形成实现移动。该过程由肌动蛋白和微管蛋白介导的微管动态调控，并涉及多种因素，包括细胞与基质间黏附的调节。目前已有多种模型用于研究细胞黏附与迁移过程。本文描述一种用于表征宿主细胞迁移特性的方法 利什曼原虫 感染。本详细方案介绍了树突状细胞的分化与感染、宿主细胞运动性与迁移的分析，以及黏附复合体的形成和肌动蛋白动态变化的研究。 体外 该方案旨在进一步阐明所涉及的机制 利什曼原虫 在脊椎动物宿主组织中的扩散，也可经修改后应用于其他细胞迁移研究.

引言

利什曼病，一种由属于利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起的被忽视的热带病 利什曼原虫， 导致一系列广泛的临床表现，从可自愈的局限性皮肤损害到致命的内脏型疾病。据估计，每年新增利什曼病病例高达100万例，目前全球报告的感染者约为1200万人。1内脏利什曼病（VL）若不及时治疗，95%以上的病例可导致死亡，每年造成超过5万例死亡，在南美洲、东非、南亚和地中海地区影响数百万人2新大陆VL的主要致病因子， Leishmania infantum通过受感染的雌性沙蝇在吸血过程中传播给人类3这些寄生虫可被吞噬细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）识别并内化3,4,5在这些细胞内，寄生虫分化为称为无鞭毛体的胞内形式，随后进行增殖并被转运 通过 淋巴系统和血液系统向不同宿主组织的扩散6,7然而，其机制 利什曼原虫 寄生虫在脊椎动物宿主内的扩散机制，以及宿主细胞迁移在该过程中所起的作用，目前仍不明确。

细胞迁移是一种由所有有核细胞执行的复杂过程，包括白细胞8。根据经典的细胞迁移循环模型，该过程涉及多个相互关联的分子事件，可分为五个步骤：前缘突出；前缘与基质接触点的黏附；细胞胞质的收缩；细胞后缘从接触位点解离；以及膜受体从细胞后部向前部的再循环9。

细胞迁移的发生需要先形成细胞突起，再通过与细胞外基质的黏附来实现稳定。在参与促进细胞迁移的多种受体类型中，整合素尤为突出。整合素的活化可引发与迁移相关的信号传导，进而通过黏着斑激酶（FAK）和Src家族激酶，以及talin、vinculin和paxillin分子介导胞内信号转导10,11,12。活化的激酶（包括FAK）对paxillin的磷酸化可招募效应分子，从而转导启动细胞迁移的外部信号。研究表明，paxillin是一种关键的胞内分子，在细胞黏附、肌动蛋白聚合以及细胞迁移过程中发挥重要作用13,14,15。

肌动蛋白细胞骨架在吞噬细胞的极化和迁移过程中起着核心作用16。在细胞迁移过程中，由肌动蛋白聚合形成的突起通过细胞与细胞外基质的黏附而得以稳定。该过程可能受到与肌动蛋白细胞骨架相关的整合素受体的调控17,18,19。多种肌动蛋白结合蛋白可调节细胞突起中肌动蛋白聚合的速率和组织方式20。研究表明，RhoA、Rac和Cdc42在细胞外因子刺激黏附细胞后，调控肌动蛋白的重排21,22。在迁移过程中，Rac1和Cdc42分别定位于细胞的前缘，调控片状伪足和丝状伪足的延伸，而位于细胞后部的RhoA则调控肌球蛋白-肌动蛋白细胞骨架的收缩15,23,24,25。

研究表明，Leishmania 感染可调节宿主细胞功能，例如细胞与基质的黏附以及细胞迁移26,27,28,29,30,31。未成熟树突状细胞（DCs）存在于外周组织中；当其与病原体相关分子模式（PAMPS）相互作用后，这些细胞被激活并迁移至引流淋巴结，从而启动向T细胞呈递抗原的过程。先前一项利用小鼠模型的研究表明，L. amazonensis 感染会导致DCs向引流淋巴结迁移减少29。另有研究证实，在L. major感染后，黏附过程受到抑制会进一步降低DCs的迁移能力30。然而，DCs迁移对寄生虫在宿主体内扩散的影响及其所涉及的机制仍不清楚。

在此，我们提供了一套完整的分步操作方案，用于执行一项 体外 涉及感染人树突状细胞的黏附与迁移实验 利什曼原虫该方法不仅包括树突状细胞的分化与感染，还能够分析宿主细胞的运动性与迁移、黏附复合物的形成以及肌动蛋白动态变化。本文所述 体外 该方案使研究人员能够进一步探究所涉及的机制 利什曼原虫 在脊椎动物宿主组织中的扩散，并可被改造并应用于其他细胞迁移研究。

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方案

本研究所述操作程序已获贡萨洛·莫尼兹研究所伦理审查委员会（IGM-FIOCRUZ，方案编号 2.751.345）批准。血液样本来自健康的志愿捐献者。动物实验操作严格遵循巴西法律11.784/2008所采纳的动物研究伦理原则，并已获贡萨洛·莫尼兹研究所动物研究伦理委员会（IGM-FIOCRUZ，方案编号 014/2019）的批准与许可。

1. 人树突状细胞的分离与分化

  1. 用移液器将10 mL密度梯度介质加入50 mL离心管中。
  2. 根据每位供体的样本标记50 mL离心管。
  3. 从健康供体采集约50 mL静脉血，采集后立即在生物安全柜中进行以下操作。
  4. 小心地将采集的血液转移至离心管中，并在室温下以1:1比例加入生理盐水溶液（0.9%氯化钠）进行稀释。
  5. 缓慢地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质的上层。
  6. 将含有血液和密度梯度介质的离心管在室温下以400 × g离心30分钟。
    注意：离心前关闭刹车，以防止梯度层混合。第一次离心后，将离心机温度降至4 °C。
  7. 小心地从离心机中取出离心管。
  8. 识别样本中外周血单个核细胞（PBMC）形成的环状层（即血沉棕黄层）；用移液器轻轻移除残留的血浆。
    注意：离心后，样本中将形成以下梯度层：红细胞、密度梯度介质、PBMC环状层和血浆。PBMC环位于密度梯度介质与血浆层之间。
  9. 将云雾状的PBMC层转移至新离心管中，并用生理盐水溶液补至30 mL。
  10. 将含有细胞悬液的离心管在4 °C下以250 × g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL生理盐水溶液中。
  11. 取一份细胞悬液用于台盼蓝排斥法细胞计数。首先以1:1,000比例稀释，然后取10 µL稀释后的细胞进行台盼蓝染色，使用血球计数板（Neubauer chamber）计数细胞并测定细胞活力。
  12. 再次在4 °C下以200 × g离心10分钟。
  13. 将沉淀重悬于MACS缓冲液中。每1 × 107个细胞使用80 µL缓冲液。
    注意：MACS缓冲液组成：配制含磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA的溶液。使用冲洗液将该缓冲液以1:20比例稀释。保持缓冲液低温，并储存于2–8 °C。
  14. 向步骤1.13制备的细胞悬液中加入CD14磁珠。每1 × 107个细胞使用20 µL CD14磁珠。
    注意：CD14磁珠用于从PBMC中正向筛选人单核细胞，因为磁珠可结合大多数单核细胞表面表达的CD14阳性细胞。
  15. 用移液器混匀含有沉淀和磁珠的溶液，并在冰上孵育15分钟。
  16. 在4 °C下以300 × g离心10分钟。
  17. 将细胞重悬于MACS缓冲液中。每1 × 107个细胞在细胞-磁珠混合物中使用1–2 mL缓冲液。
  18. 在4 °C下以300 × g离心10分钟。
  19. 吸除上清液，并将沉淀重悬于500 µL MACS缓冲液中。
    注意：此为单个层析柱可处理的细胞悬液最大体积。
  20. 组装磁性分离柱。
  21. 加入500 µL MACS缓冲液清洗层析柱一次，让缓冲液依靠重力自然流过柱体。
    注意：切勿让柱体干燥，任何进入的空气都可能堵塞柱体。
  22. 每根柱子加入500 µL步骤1.19所得的细胞样品溶液，让细胞样品溶液依靠重力自然流过柱体。
  23. 用500 µL MACS缓冲液洗涤柱体两次。仅当柱体储液腔排空后才加入新鲜缓冲液。避免柱体干燥。
  24. 向柱体中加入1 mL MACS缓冲液，并将柱体置于下方新的收集管中。立即用力推动柱塞，将磁性标记的细胞快速冲洗出来。
  25. 将CD14富集的细胞在4 °C下以300 × g离心10分钟。
  26. 使用血球计数板（Neubauer chamber）进行细胞计数。
  27. 将细胞重悬于1 mL完全RPMI培养基中，加入白细胞介素-4（IL-4）（100 µL/mL）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（50 ng/mL）。
    注意：GM-CSF是一种由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌的细胞因子，可诱导骨髓中髓系前体细胞的分化与增殖。GM-CSF与IL-4联合使用可诱导树突状细胞分化32。
  28. 将细胞以每孔2 × 105个细胞的浓度接种于24孔板中，每孔含500 μL完全RPMI培养基，在细胞培养箱中37 °C孵育7天。

2. Leishmania infantum  培养

注意：Leishmania infantum（MCAN/BR/89/BA262）寄生虫用于本实验。通过静脉注射将含有1 × 106 L. infantum前鞭毛体的20 µL无菌生理盐水溶液注入仓鼠体内。感染后1至2个月，处死动物，从其脾脏中回收Leishmania无鞭毛体，并将其转化为前鞭毛体33。

  1. 培养 L. infantum 从先前感染的仓鼠脾脏中分离出的前鞭毛体，在倾斜的25 cm2 含有3 mL Novy-Nicolle-MacNeal培养基（NNN）和5 mL添加物补充的最低必需培养基（MEM）的细胞培养瓶
    注意：本实验中，MEM 培养基添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 24.5 nM 牛血红素。
  2. 在BOD（生化需氧量）培养箱中于24 °C培养7天。
  3. 用移液器将100 µL前鞭毛体培养物转移至新的25 cm²培养瓶中2 含5 mL添加物的MEM培养基的细胞培养瓶
  4. 在BOD培养箱中于24 °C培养前鞭毛体，直至前鞭毛体进入稳定期。定期取寄生虫悬浮液的等分试样，用生理盐水稀释后转移至血细胞计数板（即Neubauer计数室），进行细胞计数，以确定其生长的稳定期。
    注意：不建议使用在NNN培养基中培养后的第一代寄生虫，以避免残留的兔血痕迹。
  5. 转移 1 × 105 静止生长期培养物的 L. infantum 前鞭毛体转移到一个新的25 cm²培养瓶中2 细胞培养瓶中加入5 mL添加了补充物的MEM培养基。
  6. 定期使用血细胞计数板监测培养物的生长情况，持续约7天，直至达到稳定期。此时，寄生虫已可用于实验性感染操作。
    ​注意：前鞭毛体培养物在传代7次内可视为具有感染活性 体外 额外的传代可能导致毒力减弱。

3. 人类树突状细胞感染

  1. 在生物安全柜内，将寄生虫培养瓶中的所有内容物转移至50 mL离心管中。
  2. 加入冷生理盐水，使终体积达到40 mL。
  3. 在4 °C条件下，以1,600 ×g离心10分钟。
  4. 离心后弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL冷生理盐水中（重复步骤3.3–3.4三次）。
  5. 洗涤细胞以去除所有非活性寄生虫后，将沉淀重悬于1 mL冷生理盐水中。
  6. 将悬液缓慢通过装有16 G针头的1 mL注射器5次，以分离寄生虫聚集体。
  7. 取适量样品，用血细胞计数板测定寄生虫浓度（计算4个象限内寄生虫平均数 × 稀释倍数 × 104）。
  8. 加入1 mL生理盐水洗涤树突状细胞，并在室温下以300 × g离心10分钟（重复3次）。
  9. 计算实验感染所需的L. infantum数量；感染比例：每个细胞20个寄生虫。
  10. 将所需体积的L. infantum加入细胞培养板的每个孔中。
  11. 将树突状细胞与寄生虫在37 °C、5% CO2的培养箱中共同孵育4小时。
  12. 完成步骤3.11后，在4 °C条件下以300 × g离心培养板10分钟。

4. 使用细胞培养小室进行迁移实验

  1. 感染后，用 1 mL 室温生理盐水洗涤树突状细胞（无论是否感染）3 次，以去除未被内化的寄生虫。每次洗涤后，在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。
  2. 去除未被内化的寄生虫后，每孔加入 200 µL 细胞解离试剂，孵育 15 分钟以使细胞脱落。将细胞置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育。
  3. 使用 1,000 µL 移液枪头吹打混悬细胞，使细胞充分解离。
  4. 将解离后的细胞转移至 50 mL 离心管中。
  5. 在 4 °C 条件下以 300 × g 离心 10 分钟。
  6. 用 1 mL 添加 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基重悬细胞沉淀。
  7. 将每根离心管中的液体缓慢通过装有 25 G 针头的 1 mL 注射器吹打 5 次，以分散细胞。
  8. 取少量细胞悬液，用台盼蓝稀释后，使用血细胞计数板测定细胞浓度（取四个象限活细胞数的平均值 × 稀释倍数 × 104）。
  9. 细胞培养小室插件的准备：
    注：建议使用细胞培养插件（孔径为 5.0 µM 的聚碳酸酯膜），用于树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞的迁移实验，因为此类插件允许吞噬细胞穿过膜。
    1. 用无菌镊子取出插件并放入空孔中。
    2. 每孔加入 600 µL 添加 10% FBS 的 RPMI 培养基；并加入趋化因子（C-C 基序）配体 3（CCL3）（每 1 mL 培养基加入 1 µL）。
      注：CCL3 是一种调控树突状细胞迁移的趋化因子34。
    3. 用无菌镊子将插件放入含有培养基的孔中。
  10. 每孔插件中加入含 100 µL 培养基的 2 × 105 个树突状细胞（无论是否感染）。
  11. 孵育 4 小时，使细胞发生迁移。
  12. 4 小时后取出培养板，吸除培养基，每孔加入 100 µL 4% 多聚甲醛，孵育 15 分钟。
  13. 去除多聚甲醛，每孔加入 100 µL 生理盐水。
    注：培养板可在 4 °C 保存，以备后续组装。
  14. 收集插件或孔中的上清液，分别用于计数未迁移的细胞或已穿过膜的细胞。加入 4% 多聚甲醛孵育 15 分钟。
  15. 采用细胞离心涂片技术（cytocentrifugation）浓缩细胞35。
  16. 在膜上加入 10 µL 含 DAPI 的封片剂，并在孔上加盖盖玻片。
  17. 插件膜的组装。
    注：此步骤可在生物安全柜外进行。
    1. 从孔中取出插件膜。
    2. 用棉签刮擦插件表面，去除未迁移的细胞。
    3. 使用手术刀将膜从插件上切下。
    4. 将膜放置在载玻片上，细胞面朝上。
    5. 在每张膜上加入 10 µL 含 DAPI 的封片剂，然后加盖盖玻片。
    6. 用铝箔包裹载玻片。
    7. 室温孵育 30 分钟后，于 -20 °C 保存
  18. 分析细胞迁移时，使用荧光显微镜在 405 nm 激光激发波长下，计数每个视野中的细胞数量（不少于 10 个视野）。

5. 黏附实验及通过免疫荧光评估肌动蛋白聚合

注意：本实验请使用带盖玻片的24孔板。

  1. 感染细胞4小时后，用室温的无菌生理盐水洗涤每个孔3次，以去除未被内化的寄生虫。
  2. 在4°C条件下，以300 × g离心10分钟。向每个孔中加入500 µL 4%多聚甲醛，作用15分钟。
  3. 去除多聚甲醛，加入1 mL生理盐水。
  4. 按照表1所述配制溶液。
主要溶液化学化合物稀释剂
氯化铵溶液0.134 g NH4Cl50 ml PBS 1X
15% 皂苷溶液150 mg 皂苷1 mL PBS 1X
10% 牛血清白蛋白（ABS）1 g ABS10 mL PBS 1X
次级溶液组分 1组分 2组分 3
0.15% 皂苷溶液1 mL 15% 皂苷溶液100 mL PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / 0.15% 皂苷13.8 mL PBS 1X6 mL 10% ABS200 µL 15% 皂苷
PBS 1X / ABS 0.3% / 0.15% 皂苷19.2 mL PBS 1X0.6 mL 10% ABS200 µL 15% 皂苷
PBS 1X / ABS 1% / 0.15% 皂苷17.8 mL PBS 1X2 mL 10% ABS200 µL 15% 皂苷

表1：缓冲液配方。

  1. 免疫染色
    ​注意：以下步骤必须在振荡条件下进行。
    1. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
    2. 每孔加入 500 µL 氯化铵溶液，孵育 10 分钟。
    3. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
    4. 用 0.15% 皂苷处理 15 分钟以通透细胞膜。
    5. 用封闭液（1× PBS / 3% ABS / 0.15% 皂苷）在室温下孵育细胞 1 小时。
    6. 用 1× PBS / 0.15% 皂苷洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
    7. 将一抗用 1× PBS / 1% ABS / 0.15% 皂苷稀释，具体如下：Rabbit anti-FAK (pTyr397)：1:500 稀释；Rabbit anti-paxillin (pTyr118)：1:100 稀释；Mouse Anti-Rac1：1:100 稀释；Rabbit Anti-Cdc42：1:200 稀释；Rabbit Anti-RhoA：1:200 稀释。
    8. 加入稀释后的一抗（溶于 1× PBS / 1% ABS / 0.15% 皂苷），孵育细胞 1 小时。
      注意：FAK 和 paxillin 是参与黏附复合体形成的关键分子13,14,15。Rho GTPase 家族负责调控肌动蛋白细胞骨架的组织结构。RAC1 和 Cdc42 定位于细胞前缘，分别调控片状伪足和丝状伪足的形成；RhoA 定位于细胞后部，参与细胞骨架的收缩过程15, 23,24,25。
    9. 用 1× PBS / 0.15% 皂苷洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
    10. 将二抗或鬼笔环肽按以下比例稀释：Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568：1:500 稀释；Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488：1:500 稀释；Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594：1:500 稀释；Phalloidin Alexa Fluor 488：1:1200 稀释。
    11. 加入稀释后的二抗或鬼笔环肽（溶于 1× PBS / 0.3% ABS / 0.15% 皂苷），孵育 45 分钟。
      注意：二抗或鬼笔环肽的孵育应在避光条件下进行。后续步骤中请用铝箔包裹培养板以避光。
    12. 用 1× PBS 洗涤盖玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
    13. 从孔板中取出盖玻片。
    14. 在避光条件下，将 10 µL 含 DAPI 的封片剂滴加至洁净的显微镜载玻片上。
    15. 将带有细胞的盖玻片细胞面朝下放置，使其与含 DAPI 的溶液接触。
      注意：请用铝箔覆盖载玻片以避光。
    16. 室温孵育 30 分钟。
    17. 于 -20 °C 保存。

6. 使用FIJI进行共聚焦显微镜观察、图像采集与定量分析

注意：为了获取免疫荧光图像，应使用共聚焦激光扫描显微镜。建议采用63倍油镜物镜以获得最佳分辨率。

  1. 在成像前至少30分钟，将盖玻片置于避光环境中，使其达到室温。
  2. 用吸水纸清洁盖玻片。
  3. 在物镜上滴加一滴浸油，并将每张玻片置于显微镜下。
  4. 移动物镜，直至油与玻片接触。
  5. 观察并调节显微镜焦距；选择63倍油镜。
  6. 开启波长为488 nm、552 nm和405 nm的激光器。
  7. 选择图像分辨率：1024 × 1024。
  8. 点击Live按钮，设置Z轴层扫，然后点击Begin。重复该过程后点击End。
  9. 在Tool菜单中选择Maximum Projection选项后，等待图像采集完成。
  10. 保存实验数据。
  11. 将图像以.lif格式导出至计算机。使用FIJI开源图像分析软件进行图像分析。
  12. 选择待分析的图像，并选择Duplicate Image。
  13. 为获得灰度图像，请选择Image | Adjust | Color Threshold。选择0和255（饱和度）。
  14. 选择阈值方法：Default。
  15. 选择阈值颜色：B and W（黑白）。
  16. 不要选择Dark background。
  17. 选择：Process | Binary | Options，然后选择需要测量的相关数据：Area、Min、Max、gray value、integrate density。
  18. 在Fiji工具栏中选择自由手绘工具，并手动仔细描记每个细胞。
  19. 从Analyze菜单中选择Set measurements。确保已选中面积、积分光密度和平均灰度值。对每个细胞重复此步骤。
  20. 在结果窗口中选择所有数据，并复制粘贴至电子表格文件中。
  21. 计算校正后的总细胞荧光强度（CTCF）：CTCF（积分密度）= 所选细胞面积 × 背景荧光读数的平均荧光强度。
  22. 使用统计分析软件打开包含数据的文件，进行统计分析。

7. 统计分析

  1. 当欢迎对话框出现时，打开一个 新项目。
  2. 选择带有标准差（SD）的图表类型和介质。
  3. 将实验结果中获得的数值填入表格。
  4. 选择 描述性统计，并选择选项列 统计[所有检验] 以分析数据分布。
  5. 如果数据符合正态分布，选择 t 检验通过比较两组样本进行分析；如果分布为非正态分布，则使用 Mann-Whitney 检验分析数据。
  6. 选择最佳的图表选项以实现最优的数据呈现。

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结果

本方案旨在评估细胞迁移及其相关机制（如肌动蛋白动态和黏附作用），从而为研究细胞迁移行为提供一种有效工具 利什曼原虫-脊椎动物宿主内受感染的宿主细胞。本文展示的结果表明，这一点 体外 该检测可在细胞黏附、迁移和肌动蛋白动态发生改变之前，快速且一致地提供相关变化的指示 体内 实验。

首先，按照无菌技术和实验室规程成功培养了细胞。通过使用细胞培养膜插件进行迁移分析所获得的数据，使我们能够评估感染或未感染L. infantum的人树突状细胞的迁移能力。DAPI染色可方便地可视化迁移细胞，使我们能够区分感染与非感染细胞，因为染色过程同时标记了树突状细胞和寄生虫的细胞核。通过观察较大的巨噬细胞细胞核以及围绕每个巨噬细胞细胞核聚集的多个较小的无鞭毛体细胞核，可识别出感染细胞。接着，使用手动计数器对每个视野下的感染细胞（L. infantum 感染组）和未感染细胞（对照组）进行计数。最后，将迁移的感染细胞数量与迁移的未感染细胞（对照组）数量进行比较。我们的结果表明，与未感染对照组相比，L. infan...

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讨论

本文所述利用细胞培养膜插件系统评估细胞迁移的方法，可使研究人员在二维环境中研究细胞的迁移反应。该技术中某些步骤被认为是关键性的。首先，人树突状细胞（DC）的分化及其感染Leishmania的过程具有决定性作用，因为感染率依赖于供体个体。每次实验使用多名供体并采用健康的Leishmania培养物，有助于获得更一致的结果。同时至关重要的是，寄生虫需在宿主动物体内维持传代，这有利于毒力株的筛选与维持，并增强其定植宿主细胞的能力。在树突状细胞分化完成后，建议检测表面标志物CD80和CD11c的表达，以确认实验所用细胞确为树突状细胞。尽管感染率存在个体差异，但在所有实验中均观察到感染L. infantum后树突状细胞的迁移能力增强。

本文所采用的细胞培养膜插件系统实验，涉及细胞从细胞培养膜插件系统的上室穿过微孔聚碳酸酯膜迁移至下室。在每个孔的底部加入趋化因子，以在孵育期间引导细胞穿过微孔膜36。选择适合目标细胞类型的孔径大小至关重要。对于树突状细胞（DCs），我们使用孔径为5μm的细胞培养膜...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由巴伊亚州研究支持基金会（Fapesb）资助，资助编号为9092/2015。作者感谢CNPq、Capes和Fapesb通过奖学金提供的经济支持。作者谨此感谢Andris K. Walter在关键性分析、英文语言修改以及稿件编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16号针头Descarpack353101
24孔细胞培养板JET-BIOFILJ011024
25 号针头Descarpack353601
牛血清白蛋白Sigma AldrichA2153-100G
氯化铵Sigma AldrichA-0171
抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
抗兔IgG，Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Miltenyi Biotec130-050-201
25 cm细胞培养瓶2SPL70125
细胞刮刀康宁25-056-CI
共聚焦显微镜LeicaTCS SP8
13毫米盖玻片圆片Perfecta10210013CE
解剖镊VWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon管KASVIK19-0051
胎牛血清gibco16000044
荧光显微镜Olympus BX51
载玻片  25.4×76.2 mmPerfecta200
血红素牛血清白蛋白Sigma AldrichH2250
血细胞计数板Perfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS 缓冲液MACS Miltenyi Biotec130-091-221
最低必需培养基Gibco41090093
小鼠抗Rac1BD610650
多聚甲醛Sigma Aldrich158127
鬼笔环肽 Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
磷酸盐缓冲液赛默飞世尔科技AM9624
聚碳酸酯膜Transwell小室 - 孔径5.0 µm康宁3421
ProLong Gold DAPI 试剂盒InvitrogenP36931
兔抗 Cdc42InvitrogenPA1-092X
兔抗 FAK（pTyr397）InvitrogenRC222574
兔抗 Paxillin（pTyr118）InvitrogenQF221230
兔抗 RhoAInvitrogenOSR00266W
重组人CCL3R&D Systems270-LD-010
重组人 GM-CSFPeproTech300-03
重组人IL-4PeproTech200-04
重组人 M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640培养基Gibco21870076
皂苷Sigma Aldrich47036 – 50G – F
3 mL 注射器Descarpack324201
台盼蓝Gibco15250061

参考文献

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