细胞迁移与细胞黏附实验用于研究Leishmania与宿主细胞的相互作用

摘要

本文通过研究Leishmania感染的树突状细胞的迁移，探讨Leishmania与宿主相互作用的影响。文中描述了树突状细胞的分化与感染、迁移分析，以及黏附复合体和肌动蛋白动态的评估。该方法也可应用于其他被Leishmania或其它胞内寄生虫物种感染的宿主细胞迁移研究。

摘要

利什曼原虫 是一种胞内原生动物寄生虫，可引起多种临床表现，从可自愈的局限性皮肤损害到致死率极高的内脏型疾病不等。全球约有1200万人感染，另有3.5亿人面临感染风险。已知被该寄生虫感染的宿主细胞 利什曼原虫 寄生虫（如巨噬细胞或树突状细胞）可迁移至不同宿主组织，但迁移在寄生虫扩散与归巢过程中的作用仍不甚清楚。因此，评估这些寄生虫调节宿主细胞反应、黏附及迁移能力，将有助于揭示疾病扩散与内脏化涉及的机制。细胞迁移是一个复杂过程，细胞通过极化和突起形成实现移动。该过程由肌动蛋白和微管蛋白介导的微管动态调控，并涉及多种因素，包括细胞与基质间黏附的调节。目前已有多种模型用于研究细胞黏附与迁移过程。本文描述一种用于表征宿主细胞迁移特性的方法 利什曼原虫 感染。本详细方案介绍了树突状细胞的分化与感染、宿主细胞运动性与迁移的分析，以及黏附复合体的形成和肌动蛋白动态变化的研究。 体外 该方案旨在进一步阐明所涉及的机制 利什曼原虫 在脊椎动物宿主组织中的扩散，也可经修改后应用于其他细胞迁移研究.

引言

利什曼病，一种由属于利什曼原虫属的原生动物寄生虫引起的被忽视的热带病 利什曼原虫， 导致一系列广泛的临床表现，从可自愈的局限性皮肤损害到致命的内脏型疾病。据估计，每年新增利什曼病病例高达100万例，目前全球报告的感染者约为1200万人。¹内脏利什曼病（VL）若不及时治疗，95%以上的病例可导致死亡，每年造成超过5万例死亡，在南美洲、东非、南亚和地中海地区影响数百万人²新大陆VL的主要致病因子， Leishmania infantum通过受感染的雌性沙蝇在吸血过程中传播给人类³这些寄生虫可被吞噬细胞（如巨噬细胞和树突状细胞）识别并内化^3,4,5在这些细胞内，寄生虫分化为称为无鞭毛体的胞内形式，随后进行增殖并被转运 通过 淋巴系统和血液系统向不同宿主组织的扩散^6,7然而，其机制 利什曼原虫 寄生虫在脊椎动物宿主内的扩散机制，以及宿主细胞迁移在该过程中所起的作用，目前仍不明确。

方案

本研究所述操作程序已获贡萨洛·莫尼兹研究所伦理审查委员会（IGM-FIOCRUZ，方案编号 2.751.345）批准。血液样本来自健康的志愿捐献者。动物实验操作严格遵循巴西法律11.784/2008所采纳的动物研究伦理原则，并已获贡萨洛·莫尼兹研究所动物研究伦理委员会（IGM-FIOCRUZ，方案编号 014/2019）的批准与许可。

1. 人树突状细胞的分离与分化

1. 用移液器将10 mL密度梯度介质加入50 mL离心管中。
2. 根据每位供体的样本标记50 mL离心管。
3. 从健康供体采集约50 mL静脉血，采集后立即在生物安全柜中进行以下操作。
4. 小心地将采集的血液转移至离心管中，并在室温下以1:1比例加入生理盐水溶液（0.9%氯化钠）进行稀释。
5. 缓慢地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质的上层。
6. 将含有血液和密度梯度介质的离心管在室温下以400 × g离心30分钟。
   注意：离心前关闭刹车，以防止梯度层混合。第一次离心后，将离心机温度降至4 °C。
7. 小心地从离心机中取出离心管。
8. 识别样本中外周血单个核细胞（PBMC）形成的环状层（即血沉棕黄层）；用移液器轻轻移除残留的血浆。
   注意：离心后，样本中将形成以下梯度层：红细胞、密度梯度介质、PBMC环状层和血浆。PBMC环位于密度梯度介质与....

结果

本方案旨在评估细胞迁移及其相关机制（如肌动蛋白动态和黏附作用），从而为研究细胞迁移行为提供一种有效工具 利什曼原虫-脊椎动物宿主内受感染的宿主细胞。本文展示的结果表明，这一点 体外 该检测可在细胞黏附、迁移和肌动蛋白动态发生改变之前，快速且一致地提供相关变化的指示 体内 实验。

首先，按照无菌技术和实验室规程成功培养了细胞。通过使用细胞培养膜插件进行迁移分析所获得的数据，使我们能够评估感染或未感染L. infantum的人树突状细胞的迁移能力。DAPI染色可方便地可视化迁移细胞，使我们能够区分感染与非感染细胞，因为染色过程同时标记了树突状细胞和寄生虫的细胞核。通过观察较大的巨噬细胞细胞核以及围绕每个巨噬细胞细胞核聚集的多个较小的无鞭毛体细胞核，可识别出感染细胞。接着，使用手动计数器对每个视野下的感染细胞（L. infantum 感染组）和未感染细胞（对照组）进行计数。最后，将迁移的感染细胞数量与迁移的未感染细胞（对照组）数量进行比较。我们的结果表明，与未感染对照组相比，L. infan.......

讨论

本文所述利用细胞培养膜插件系统评估细胞迁移的方法，可使研究人员在二维环境中研究细胞的迁移反应。该技术中某些步骤被认为是关键性的。首先，人树突状细胞（DC）的分化及其感染Leishmania的过程具有决定性作用，因为感染率依赖于供体个体。每次实验使用多名供体并采用健康的Leishmania培养物，有助于获得更一致的结果。同时至关重要的是，寄生虫需在宿主动物体内维持传代，这有利于毒力株的筛选与维持，并增强其定植宿主细胞的能力。在树突状细胞分化完成后，建议检测表面标志物CD80和CD11c的表达，以确认实验所用细胞确为树突状细胞。尽管感染率存在个体差异，但在所有实验中均观察到感染L. infantum后树突状细胞的迁移能力增强。

本文所采用的细胞培养膜插件系统实验，涉及细胞从细胞培养膜插件系统的上室穿过微孔聚碳酸酯膜迁移至下室。在每个孔的底部加入趋化因子，以在孵育期间引导细胞穿过微孔膜³⁶。选择适合目标细胞类型的孔径大小至关重要。对于树突状细胞（DCs），我们使用孔径为5μm的细胞培养膜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16号针头	Descarpack	353101
24孔细胞培养板	JET-BIOFIL	J011024
25 号针头	Descarpack	353601
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A2153-100G
氯化铵	Sigma Aldrich	A-0171
抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A32723
抗小鼠 IgG，Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032
抗兔IgG，Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11011
CD14 MicroBeads	MACS Miltenyi Biotec	130-050-201
25 cm细胞培养瓶2	SPL	70125
细胞刮刀	康宁	25-056-CI
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP8
13毫米盖玻片圆片	Perfecta	10210013CE
解剖镊	VWR	82027-406
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
Falcon管	KASVI	K19-0051
胎牛血清	gibco	16000044
荧光显微镜	Olympus	BX51
载玻片  25.4×76.2 mm	Perfecta	200
血红素牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	H2250
血细胞计数板	Perfecta	7302HD
Histopaque® 1077	Sigma Aldrich	10771
MACS 缓冲液	MACS Miltenyi Biotec	130-091-221
最低必需培养基	Gibco	41090093
小鼠抗Rac1	BD	610650
多聚甲醛	Sigma Aldrich	158127
鬼笔环肽 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A12379
磷酸盐缓冲液	赛默飞世尔科技	AM9624
聚碳酸酯膜Transwell小室 - 孔径5.0 µm	康宁	3421
ProLong Gold DAPI 试剂盒	Invitrogen	P36931
兔抗 Cdc42	Invitrogen	PA1-092X
兔抗 FAK（pTyr397）	Invitrogen	RC222574
兔抗 Paxillin（pTyr118）	Invitrogen	QF221230
兔抗 RhoA	Invitrogen	OSR00266W
重组人CCL3	R&D Systems	270-LD-010
重组人 GM-CSF	PeproTech	300-03
重组人IL-4	PeproTech	200-04
重组人 M-CSF	PeproTech	300-25
RPMI 1640培养基	Gibco	21870076
皂苷	Sigma Aldrich	47036 – 50G – F
3 mL 注射器	Descarpack	324201
台盼蓝	Gibco	15250061