本实验设计了一种简便易用的RNA下拉实验方案，用于鉴定与长链非编码RNA直接发生RNA/RNA相互作用的RNA分子。该方案采用补骨脂素作为交联剂，特异性地固定RNA/RNA相互作用，当与RNA测序技术联用时，可全面获得长链非编码RNA的直接RNA相互作用组。
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鉴定与长链非编码RNA直接发生RNA-RNA相互作用的RNA分子
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
长链非编码RNA（lncRNA）在生理学和病理生理学中的作用日益重要，因此通过鉴定其分子伴侣（包括DNA、蛋白质和/或RNA）来表征其相互作用组变得至关重要。这些分子伴侣可通过蛋白质介导的网络与lncRNA相互作用，但也可能直接参与RNA/RNA相互作用。为此，我们开发了一种简便的RNA下拉实验方法，利用补骨脂素（psoralen）——一种仅交联RNA/RNA相互作用的分子——来鉴定与lncRNA直接发生RNA/RNA相互作用的RNA。通过对lncRNA二级结构进行生物信息学建模，我们筛选出多个特异性反义DNA寡核苷酸探针，这些探针对内部碱基配对概率较低的区域具有高亲和力。由于所设计的特异性探针靶向覆盖lncRNA全长范围内可及的区域，因此可在lncRNA序列中界定出RNA相互作用区域。当与高通量RNA测序技术联用时，该实验方案可用于全面研究特定lncRNA的直接RNA相互作用组。
引言
长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的转录本。其数量持续增长，在人类中已超过58,000种。此外，lncRNAs在生理和病理生理过程中发挥关键作用，因此明确其分子互作伙伴以揭示其调控功能的实现机制显得尤为重要。实际上，一种理解 lncRNA功能研究的关键在于检测每种lncRNA相互作用的分子伴侣。
长链非编码RNA（lncRNA）的分子靶点可以是DNA、蛋白质或RNA，目前已开发出多种技术用于鉴定这些靶点。其中，鉴定与lncRNA相互作用的蛋白质是多种实验方案的目标，包括不同的RNA免疫沉淀（RIP）方法，这些方法利用针对目标蛋白质的抗体特异性地富集与该蛋白质结合的lncRNA（综述见1）。其他技术如RNA靶标捕获杂交分析2（CHART）或通过RNA纯化进行染色质分离3（ChIRP），能够将lncRNA及其关联的蛋白质复合物共同富集下来。在后两类技术中，lncRNA被用作“诱饵”。CHART和ChIRP也是识别lncRNA在基因组上占据位点图谱的有力工具2,3。此外，这些RNA富集方法还可用于鉴定与特定lncRNA相互作用的RNA伙伴分子。已有研究描述了一种可捕获被lncRNA靶向的RNA的方法：根据生物信息学对lncRNA二级结构的建模结果，选择内部碱基配对概率较低的区域，设计针对这些区域的生物素标记的反义DNA寡核苷酸探针4。然而，该方法无法区分RNA伙伴分子是通过蛋白质网络间接相互作用，还是与lncRNA直接发生RNA/RNA相互作用。研究表明，使用补骨脂素衍生物进行交联是筛选由碱基配对介导的直接RNA/RNA相互作用的首选方法5。补骨脂素衍生物能够插入双链DNA或RNA中，并在365 nm紫外光照射后共价交联嘧啶碱基6。将基于生物素化寡核苷酸探针的RNA富集技术与补骨脂素交联相结合，是一种操作简便的方法，本文即提出该方法用于鉴定与lncRNA发生直接RNA/RNA相互作用的RNA。 此外，若沿lncRNA全长设计多个不同的寡核苷酸探针，该方法还可用于界定lncRNA序列中参与RNA相互作用的功能区域。
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方案
1. 探针设计
- 使用专用的免费网络服务器软件 RNAstructure 生成lncRNA的二级结构7 或维也纳RNA网络套件8选择内部碱基配对概率较低的区域，并针对该lncRNA的不同区域设计长度为25个碱基的反义寡核苷酸探针。
- 使用免费的学术软件 AmplifX（https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr）对所有设计的寡核苷酸进行检测，以获取这些探针的不同信息，并从中选择参数最优的探针。
注意：请在软件中按以下参数检查最佳条件：GC 含量：40% 至 60% 之间，3' 端稳定性，复杂度，自身末端二聚体： "良好"熔解温度（TM）并不重要，因为亲和反应在室温下进行。 - 使用比对搜索工具（例如 Blast 等），确保所选的反义寡核苷酸探针不会识别在目标细胞中表达的任何其他 RNA 的核苷酸序列。
- 设计一条长度为25个碱基的非特异性DNA寡核苷酸探针。确保该探针对目标长链非编码RNA（lncRNA）以及目标基因组中任何其他RNA序列均无结合亲和力。
- 所有探针均需在3'端添加生物素修饰，并连接三乙二醇间隔基（TEG）。该间隔基可增加寡核苷酸与生物素之间的距离，以避免空间位阻。
注意：为了获得最佳结果并评估拉下实验结果的特异性，应在同一区域设计至少两个不同的反义寡核苷酸探针，并通过实验比较它们的效率。
2. 交联
- 将细胞（例如本实验中使用的 GH4C1 细胞）在 78.5 cm2 的细胞培养皿中培养至汇合。去除细胞培养基后，用 5 mL 含 Ca2+ 和 Mg2+ 的冷磷酸盐缓冲液（PBS+）冲洗细胞层，并加入 3 mL 用 PBS+ 配制的补骨脂素衍生物分子（4′氨基甲基三氧沙林盐酸盐）溶液，终浓度为 0.1 mg/mL。
- 将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的哺乳动物细胞培养箱中孵育 30 分钟。30 分钟后，打开皿盖，将培养皿放置于冰上，距离紫外交联仪中 365 nm 紫外灯管 2.5 cm 处照射 10 分钟。轻轻振荡培养皿，再继续暴露于紫外光下额外照射 10 分钟。
- 吸除培养基，加入 1 mL PBS+，用细胞刮刀收集细胞并转移至微量离心管中。在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。尽可能彻底去除上清液，将细胞沉淀保存于 -80 °C。
3. 细胞裂解
- 通过添加 100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl（pH 7.0）、1 mM EDTA、0.5% SDS 和 5 µL/mL RNase 抑制剂，配制蛋白酶 K 缓冲液。
- 用该缓冲液重悬细胞沉淀（每 1 × 107 个细胞约 200 µL）。加入蛋白酶 K 至终浓度为 0.1 µg/µL，于 50 °C 孵育 45 分钟。随后在 95 °C 孵育 10 分钟以灭活蛋白酶 K。
4. 超声处理
- 将100 µL该裂解液（相当于5.106个细胞）分装至两个微量离心管中，每管加入200 µL杂交缓冲液（700 mM NaCl，70 mM Tris-HCl，pH 7.0，1 mM EDTA，1.25% SDS，5 µL/mL RN酶抑制剂溶液和15%甲酰胺）。
- 将离心管置于超声破碎仪的4 °C水浴中，开始超声处理，设置为两轮30秒脉冲（高强度），每轮间隔30秒暂停。
- 取20 µL样品作为输入对照样本，保存于-80 °C。
注：该超声处理程序此前已针对GH4C1细胞系进行优化，以获得长度约为2,000个核苷酸的RNA片段9。对于其他细胞系，需优化超声条件。当本技术用于研究极长链非编码RNA（lncRNA）的RNA互作伙伴时，超声步骤对于充分回收lncRNA至关重要。在此情况下，应设计多个探针，其结合位点沿lncRNA全长每隔不超过4,000个核苷酸分布。为回收全长lncRNA，应使用一组多种特异性探针的混合物。然而，若目的是鉴定lncRNA中参与RNA-RNA结合的具体区域，则应分别使用各个特异性探针。此外，若研究对象为较短的lncRNA，应通过实验确定是否需要进行超声处理步骤。
5. RNA 拉下实验
- 第1天 - 杂交步骤
- 向每个样品管中加入150 pmol（1.5 µL的100 µM储备溶液）生物素标记的特异性或非特异性探针。在室温（RT）下于管式旋转仪上振荡孵育4小时（约30 rpm）。
- 取所需体积的磁珠（即每150 pmol探针杂交反应使用40 µL磁珠）。使用磁力架将磁珠与商品化培养基分离，弃去上清液，并用900 µL杂交缓冲液洗涤磁珠。洗涤完成后，将磁珠重悬于相同体积的杂交缓冲液中。
- 向每个样品管中加入磁珠（每150 pmol探针杂交反应加入40 µL磁珠）。在室温（RT）下于旋转仪上振荡过夜孵育（约30 rpm）。
- 第2天 - RNA分离步骤
- 使用磁力架将磁珠与细胞裂解液分离（2–3分钟）。弃去上清液，并用900 µL洗涤缓冲液（0.5% SDS，2×SSC）在旋转仪上振荡孵育5分钟进行洗涤。重复此洗涤步骤5次。
- 最后一次洗涤结束后，向磁珠中加入95 µL蛋白酶K缓冲液。将输入样品解冻后，加入75 µL蛋白酶K缓冲液。向所有管（样品和输入样品）中各加入5 µL蛋白酶K，使其终浓度为1 µg/µL。先在45 °C孵育45分钟，然后在95 °C孵育10分钟。
- 将样品置于冰上。使用磁力架将磁珠与存在于上清液中的RNA分离。使用包含DNase消化步骤的RNA纯化试剂盒对RNA进行纯化。将纯化后的RNA储存在-80 °C。
注意：洗脱的RNA可用于RT-qPCR或高通量RNA测序以检测富集的转录本。对于RNA测序分析，可使用免费软件（如STAR10或HISAT211）将测序读段比对至目标基因组，并使用FeatureCounts12或HTSeq count13进行定量分析。
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结果
阐明长链非编码RNA（lncRNA）相互作用组，即与lncRNA相互作用的细胞组分，包括蛋白质、RNA和DNA，对于理解lncRNA的功能至关重要。目前已开发出多种用于表征lncRNA相互作用组的技术，包括RIP、CHART、ChIRP和RNA pull-down。尽管后者在鉴定lncRNA的RNA靶标方面已被证明非常有效，但这些方法无法判断RNA伙伴分子是通过蛋白质网络间接相互作用，还是通过直接的RNA/RNA相互作用。然而，目前普遍认为，许多lncRNA发挥功能的机制依赖于与其他RNA（通常是mRNA）的RNA/RNA相互作用，因此迫切需要发展能够在全基因组范围内发现这些直接RNA靶标的方法。此外，这类由碱基配对介导的RNA/RNA相互作用可通过补骨脂素衍生物进行交联6,5。因此，本文提出一种方法，用于鉴定与特定lncRNA发生直接RNA/RNA相互作用的RNA（工作流程见图1），该方法基于细胞内补骨脂素交联联合RNA pull-down实验流程。
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讨论
许多长链非编码RNA通过与mRNA的互补碱基配对来发挥其功能。因此，开发能够表征lncRNA直接RNA相互作用组的研究方法显得尤为重要。为此，已建立一种结合使用补骨脂素作为交联试剂与RNA下拉技术的实验方法。
在所述的RNA下拉实验方案中，反义DNA生物素化寡核苷酸探针的设计与筛选基于lncRNA二级结构的生物信息学建模，并进一步选择能够与目标lncRNA中内部碱基配对概率较低区域杂交的探针。鉴于目前可用的不同算法所预测的二级结构存在差异，最佳探针应是在尽可能多的预测二级结构中均满足上述标准的探针。此外，探针筛选还需考虑其他多个参数，如GC含量百分比、3'端稳定性、序列复杂性以及自身末端二聚体的形成倾向。正如我们先前在一篇论文中所讨论的4，与已发表方法中使用的其他策略（如CHART3或ChIRP2）相比，该探针设计策略仍具有成本更低、耗时更少的优势。
本文所述方法结合了补骨脂素作为交联...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由艾克斯-马赛大学、法国国家科学研究中心支持，并获得山德士实验室资助。
开放获取费用资助：艾克斯-马赛大学和法国国家科学研究中心
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4′-氨基甲基三氧沙林盐酸盐 | Sigma | A4330 | 交联试剂 |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | 超声波破碎仪 |
| 生物素标记探针 | IDT | 寡核苷酸探针 | |
| CFX96 实时系统 | BioRad | 4351107 | qPCR 仪器 |
| DNA 寡核苷酸 | IDT | qPCR 引物 | |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | 磁性链霉亲和素 beads |
| 甲酰胺 | Thermo-Fisher | 15515-026 | 甲酰胺 |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR 试剂 |
| 蛋白酶 K | Sigma | P2308 | 蛋白酶 K |
| RNA 转 DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | 反转录试剂盒 |
| RNA XS 纯化试剂盒 | Macherey-Nagel | 740902 | RNA 纯化试剂盒 |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNase 抑制剂 |
| 试管旋转仪 | Stuart | SB2 | Eppendorf 管旋转仪 |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | #400072 | UV 交联仪 |
参考文献
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