鉴定与长链非编码RNA直接发生RNA-RNA相互作用的RNA分子

摘要

本实验设计了一种简便易用的RNA下拉实验方案，用于鉴定与长链非编码RNA直接发生RNA/RNA相互作用的RNA分子。该方案采用补骨脂素作为交联剂，特异性地固定RNA/RNA相互作用，当与RNA测序技术联用时，可全面获得长链非编码RNA的直接RNA相互作用组。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）在生理学和病理生理学中的作用日益重要，因此通过鉴定其分子伴侣（包括DNA、蛋白质和/或RNA）来表征其相互作用组变得至关重要。这些分子伴侣可通过蛋白质介导的网络与lncRNA相互作用，但也可能直接参与RNA/RNA相互作用。为此，我们开发了一种简便的RNA下拉实验方法，利用补骨脂素（psoralen）——一种仅交联RNA/RNA相互作用的分子——来鉴定与lncRNA直接发生RNA/RNA相互作用的RNA。通过对lncRNA二级结构进行生物信息学建模，我们筛选出多个特异性反义DNA寡核苷酸探针，这些探针对内部碱基配对概率较低的区域具有高亲和力。由于所设计的特异性探针靶向覆盖lncRNA全长范围内可及的区域，因此可在lncRNA序列中界定出RNA相互作用区域。当与高通量RNA测序技术联用时，该实验方案可用于全面研究特定lncRNA的直接RNA相互作用组。

引言

长链非编码RNA（lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的转录本。其数量持续增长，在人类中已超过58,000种。此外，lncRNAs在生理和病理生理过程中发挥关键作用，因此明确其分子互作伙伴以揭示其调控功能的实现机制显得尤为重要。实际上，一种理解 lncRNA功能研究的关键在于检测每种lncRNA相互作用的分子伴侣。

长链非编码RNA（lncRNA）的分子靶点可以是DNA、蛋白质或RNA，目前已开发出多种技术用于鉴定这些靶点。其中，鉴定与lncRNA相互作用的蛋白质是多种实验方案的目标，包括不同的RNA免疫沉淀（RIP）方法，这些方法利用针对目标蛋白质的抗体特异性地富集与该蛋白质结合的lncRNA（综述见¹）。其他技术如RNA靶标捕获杂交分析²（CHART）或通过RNA纯化进行染色质分离³（ChIRP），能够将lncRNA及其关联的蛋白质复合物共同富集下来。在后两类技术中，lncRNA被用作“诱饵”。CHART和ChIRP也是识别lncRNA在基因组上占据位点图谱的有力工具^2,3。此外，这些RNA富集方法还可用于鉴定与特定lncRNA相互作用的RNA伙伴分子。已有研究描述了一种可捕获被ln....

方案

1. 探针设计

1. 使用专用的免费网络服务器软件 RNAstructure 生成lncRNA的二级结构⁷ 或维也纳RNA网络套件⁸选择内部碱基配对概率较低的区域，并针对该lncRNA的不同区域设计长度为25个碱基的反义寡核苷酸探针。
2. 使用免费的学术软件 AmplifX（https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr）对所有设计的寡核苷酸进行检测，以获取这些探针的不同信息，并从中选择参数最优的探针。
   注意：请在软件中按以下参数检查最佳条件：GC 含量：40% 至 60% 之间，3' 端稳定性，复杂度，自身末端二聚体： "良好"熔解温度（T_M）并不重要，因为亲和反应在室温下进行。
3. 使用比对搜索工具（例如 Blast 等），确保所选的反义寡核苷酸探针不会识别在目标细胞中表达的任何其他 RNA 的核苷酸序列。
   1. 设计一条长度为25个碱基的非特异性DNA寡核苷酸探针。确保该探针对目标长链非编码RNA（lncRNA）以及目标基因组中任何其他RNA序列均无结合亲和力。
4. 所有探针均需在3'端添加生物素修饰，并连接三乙二醇间隔基（TEG）。该间隔基可增加寡核苷酸与生物....

结果

阐明长链非编码RNA（lncRNA）相互作用组，即与lncRNA相互作用的细胞组分，包括蛋白质、RNA和DNA，对于理解lncRNA的功能至关重要。目前已开发出多种用于表征lncRNA相互作用组的技术，包括RIP、CHART、ChIRP和RNA pull-down。尽管后者在鉴定lncRNA的RNA靶标方面已被证明非常有效，但这些方法无法判断RNA伙伴分子是通过蛋白质网络间接相互作用，还是通过直接的RNA/RNA相互作用。然而，目前普遍认为，许多lncRNA发挥功能的机制依赖于与其他RNA（通常是mRNA）的RNA/RNA相互作用，因此迫切需要发展能够在全基因组范围内发现这些直接RNA靶标的方法。此外，这类由碱基配对介导的RNA/RNA相互作用可通过补骨脂素衍生物进行交联^6,5。因此，本文提出一种方法，用于鉴定与特定lncRNA发生直接RNA/RNA相互作用的RNA（工作流程见图1），该方法基于细胞内补骨脂素交联联合RNA pull-down实验流程。

.......

讨论

许多长链非编码RNA通过与mRNA的互补碱基配对来发挥其功能。因此，开发能够表征lncRNA直接RNA相互作用组的研究方法显得尤为重要。为此，已建立一种结合使用补骨脂素作为交联试剂与RNA下拉技术的实验方法。

在所述的RNA下拉实验方案中，反义DNA生物素化寡核苷酸探针的设计与筛选基于lncRNA二级结构的生物信息学建模，并进一步选择能够与目标lncRNA中内部碱基配对概率较低区域杂交的探针。鉴于目前可用的不同算法所预测的二级结构存在差异，最佳探针应是在尽可能多的预测二级结构中均满足上述标准的探针。此外，探针筛选还需考虑其他多个参数，如GC含量百分比、3'端稳定性、序列复杂性以及自身末端二聚体的形成倾向。正如我们先前在一篇论文中所讨论的⁴，与已发表方法中使用的其他策略（如CHART³或ChIRP²）相比，该探针设计策略仍具有成本更低、耗时更少的优势。

本文所述方法结合了补骨脂素作为交联.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4′-氨基甲基三氧沙林盐酸盐	Sigma	A4330	交联试剂
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	超声波破碎仪
生物素标记探针	IDT		寡核苷酸探针
CFX96 实时系统	BioRad	4351107	qPCR 仪器
DNA 寡核苷酸	IDT		qPCR 引物
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	磁性链霉亲和素 beads
甲酰胺	Thermo-Fisher	15515-026	甲酰胺
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR 试剂
蛋白酶 K	Sigma	P2308	蛋白酶 K
RNA 转 DNA	Thermo-Fisher	4387405	反转录试剂盒
RNA XS 纯化试剂盒	Macherey-Nagel	740902	RNA 纯化试剂盒
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNase 抑制剂
试管旋转仪	Stuart	SB2	Eppendorf 管旋转仪
UV Stratalinker 1800	Stratagene	#400072	UV 交联仪