本文展示了一种对悬浮状态下的癌细胞施加流体剪切应力的方法，用于模拟血流动力学应力对循环肿瘤细胞的影响。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
在转移过程中，来自实体组织（包括上皮组织）的癌细胞进入淋巴系统和血行循环，在此过程中因血流动力学流动而暴露于机械应力之下。循环肿瘤细胞（CTCs）所经历的应力之一便是流体剪切应力（FSS）。尽管癌细胞在肿瘤内部可能因间质液流动而经历较低水平的FSS，但CTCs在缺乏细胞外基质附着的情况下，会暴露于显著更高的FSS水平中。生理状态下，FSS的范围跨越3至4个数量级：淋巴系统中FSS水平较低（<1 dyne/cm2），而当细胞流经心脏及心脏瓣膜时，FSS可短暂达到最高水平（>500 dynes/cm2）。目前已开发出少数几种in vitro模型，用于模拟不同时间尺度下生理范围内的剪切应力。本文介绍一种利用简单的注射器-针头系统，研究高强度FSS的短暂（毫秒级）脉冲对癌细胞生物学影响的模型。
引言
转移，即癌症从原发肿瘤部位扩散至其他组织，是导致癌症死亡的主要因素1在转移过程中，癌细胞利用循环系统作为通道，扩散至全身各处的远端部位。2,3。尽管 途中 与这些位点相比，循环肿瘤细胞（CTCs）存在于一种动态的流体微环境中，不同于其原始原发性肿瘤的微环境3,4,5有研究提出，这种液体微环境是阻碍转移的多重屏障之一4关于转移效率低下的概念存在广泛共识，即大多数进入循环系统的循环肿瘤细胞（CTCs）会死亡或无法形成有效的转移性病灶。6,7,8然而，从单个循环肿瘤细胞（CTC）的角度来看，转移效率低下的原因尚不明确，仍是当前研究的活跃领域。CTC脱离了细胞外基质，缺乏原发肿瘤中可能存在的可溶性生长和存活因子，并且与原发肿瘤中的情况相比，其暴露于免疫系统和血流动力学作用的方式也大不相同。4上述....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 细胞准备
- 当细胞融合度达到70-90%时，按照所用细胞系的推荐方案从组织培养皿中释放细胞。
- 例如，吸除PC-3细胞的生长培养基，并用5 mL无钙、无镁的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗10 cm培养皿中的细胞。
- 根据生产商的操作说明，在加入1 mL 0.25%胰蛋白酶前，先吸除PBS。
- 在倒置显微镜下观察到细胞脱落之后，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM:F12培养基以抑制胰蛋白酶活性。
- 将细胞悬液转移至锥形离心管中。
- 测定细胞浓度及总细胞数。
- 通过离心（300 × g，3分钟）沉淀细胞，吸除上清液，并将细胞重悬于无血清的组织培养基中，调整细胞密度至5 × 105 个细胞/mL。
注意：检测培养基中必须至少含有1.17 mM Ca++，因为已有研究表明细胞外Ca++是细胞抵抗流体剪切应力（FSS）所必需的15。
2. 流体剪切应力处理
- 在将细胞暴露于流体剪切应力（FSS）之前，沿14 mL聚苯乙烯圆底管的7 mL刻度线处剪断。混匀细胞悬液，取5 mL悬液加入剪断后的试管中，收集静态对照样品。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
先前的研究表明，与未转化的上皮细胞对照相比，多种癌细胞系以及直接从肿瘤组织中新鲜分离的癌细胞对流体剪切力（FSS）诱导的机械破坏具有增强的抗性，这一表型在多种癌症中具有保守性15,24。本研究进一步检测了来源于不同组织的其他癌细胞系（表2），结果显示其中大多数细胞在250 µL/s流体剪切力下经受10次脉冲处理后，存活率仍可达≥20%。唯一的例外是MiaPaCa2细胞，其对FSS引起的机械破坏相对敏感（存活率≤10%）。为准确描述一个细胞系的FSS抗性特征，建议至少进行n ≥ 3次生物学重复实验。
作为对比，所有检测的非转化上皮细胞均具有活力 < 10% 在这些条件下15,24因此，尽管观察到不同细胞系对流体剪切应力（FSS）的抵抗能力存在差异，但大多数受试的癌细胞系表现出比非转化细胞更强的FSS抵抗能力。癌细.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文演示了使用注射器和针头将流体剪切应力（FSS）应用于悬浮状态的癌细胞。利用该模型，已证明癌细胞对短暂的高强度FSS的耐受性高于未转化的上皮细胞15,22,24。此外，使用该模型暴露于FSS可导致细胞刚度迅速增加，RhoA活化，以及基于皮层F-肌动蛋白和肌球蛋白II的收缩力增强24,27。快速的机械适应（循环肿瘤细胞（CTC）根据环境条件变得更硬或更软的能力）可能防止CTC的机械性破坏，并促进转移定植的其他方面24,28。事实上，使用该体外（in vitro）模型获得的研究结果已在动物模型的实验性CTC中得到验证24。这种快速的机械适应很可能解释了在此模.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
MDH 是 SynderBio 公司的联合创始人、总裁兼股东。DLM 是 SynderBio 公司的顾问。
致谢
本模型的开发得到了美国国防部资助项目W81XWH-12-1-0163、美国国立卫生研究院资助项目R21 CA179981和R21 CA196202以及Sato转移研究基金的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL 圆底管 | Falcon - Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" 针头 | BD | 305106 | |
| 5 mL 注射器 | BD | 309646 | |
| 96 孔黑底板 | Costar - Corning | 3915 | |
| 生物发光检测仪 | AMI | AMI HTX | |
| 牛血清白蛋白，第五组分（BSA, Fraction V） | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| 结晶紫 | Sigma | C0775 | |
| D-荧光素 | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 胎牛血清（FBS） | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| 酶标仪 | BioTek | Synergy HT | |
| 叠氮化钠（NaN3） | Sigma | S2002 | |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 70-3005 |
参考文献
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Strilic, B., Offermanns, S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
