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人诱导多能干细胞分化的小胶质细胞与皮层神经元共培养

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DOI：

10.3791/62480

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2021年9月21日

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

本文内容

摘要

本方案描述了一种从人iPSCs分化出小胶质细胞并将其与iPSC来源的皮层神经元共培养的方法，旨在利用人源神经元和小胶质细胞研究神经免疫相互作用的机制基础。

摘要

利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成小胶质细胞的能力，为研究小胶质细胞在健康和疾病中的作用提供了新的工具和途径。此外，iPSC来源的小胶质细胞可与iPSC来源的皮层神经元进行共培养，从而能够研究小胶质细胞与神经元之间的相互作用，而这种相互作用被认为在多种神经精神疾病中出现失调。本研究采用经改良的Fossati研究组所建立的方案，将人iPSCs分化为小胶质细胞，并通过标志物分析和实时PCR对iPSC来源的小胶质细胞进行了验证。使用该方案生成的人小胶质细胞对CD11C、IBA1、P2RY12和TMEM119等标志物呈阳性，并表达小胶质细胞相关基因AIF1、CX3CR1、ITGAM、ITGAX、P2RY12和TMEM119。将已分化30天的人iPSC来源皮层神经元与小胶质细胞共同接种，并维持共培养至第60天后进行实验。在基础状态以及存在促炎性细胞因子的条件下，定量分析了与小胶质细胞共培养的皮层神经元中树突棘的密度。为了探究小胶质细胞如何调节神经元功能，使用钙离子指示剂Fluo-4 AM对皮层神经元进行了钙成像实验。通过共聚焦显微镜获取皮层神经元的活细胞钙活动信号，并使用ImageJ软件定量分析荧光强度。本报告描述了人iPSC来源的小胶质细胞与皮层神经元共培养体系如何为研究小胶质细胞对皮层神经元的影响提供新的方法。

引言

在人类大脑中，小胶质细胞是主要的先天免疫细胞1。小胶质细胞通过两种途径调控大脑发育：释放可扩散因子和吞噬作用1。小胶质细胞释放的可扩散因子有助于支持髓鞘形成、神经发生、突触形成、成熟、细胞死亡和细胞存活1。小胶质细胞还吞噬大脑突触、轴突以及活细胞和死细胞中的多种成分2,3,4,5,6,7,8。小胶质细胞上的受体可识别钙网蛋白、ATP和唾液酸等标记物，并调控细胞吞噬作用9,10。在海马体中，小胶质细胞通过其吞噬功能维持神经发生的稳态11。

啮齿类动物脑部背外侧膝状体核（dLGN）中的突触吞噬作用已被证实受小胶质细胞调控1在啮齿类动物中，研究发现发育过程中存在两个微胶质细胞突触吞噬作用显著增强的时期。第一个时期发生在突触初始形成阶段，第二个时期则发生在神经连接进行精细调节与修剪的阶段。12. 参与突触修剪的其他因素包括炎性蛋白以及主要组织相容性复合体I类分子（MHC1，H2-Kb 和 Db)13,14有研究表明，小胶质细胞上的C1q（补体成分1q）与MHC I共定位，从而触发突触修剪15此外，小鼠研究表明，星形胶质细胞分泌的白细胞介素-33（IL-33）可通过作用于小胶质细胞，调节丘脑和脊髓中的突触稳态，但该机制在人类中尚未得到研究。13小胶质细胞分泌多种有助于维持神经元健康的细胞因子，如肿瘤坏死因子α（TNFα）、IL-1β、IL-6、IL-10和干扰素γ（IFN-γ），这些细胞因子可调节树突棘和突触的形成16,17,18人类大脑发育过程中神经元与小胶质细胞相互作用的研究仍存在显著的知识空白。目前大部分认知来源于啮齿类动物模型的研究，而关于人类大脑皮层突触修剪在时间进程和作用机制方面的信息仍然十分有限。小胶质细胞支持新皮层中神经元的存活，其他细胞类型也共同参与这一过程。1目前尚不清楚小胶质细胞如何参与这一保护过程，也不清楚小胶质细胞与其他细胞类型之间的相互作用机制。小胶质细胞会释放多种影响神经元和突触发育的细胞因子，但这些细胞因子对神经元作用的分子机制在很大程度上仍不清楚。19,20为了更全面地理解小胶质细胞在人脑中的功能，深入探究其与人脑中不同细胞类型之间的相互作用至关重要。本报告描述了一种共培养源自同一个人的诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元与小胶质细胞的方法。建立该技术方法将有助于开展定义明确的研究，以深入解析小胶质细胞与神经元之间相互作用的本质，并推动建立可靠的 体外 用于研究不同神经发育和神经精神疾病背景下神经免疫功能障碍的细胞模型。

小胶质细胞在精神分裂症中的作用
突触修剪是青少年大脑中发生的主要神经发育过程21,22。大量证据表明，在这一关键时期，精神分裂症（SCZ）患者的突触修剪过程存在异常23,24,25,26。SCZ 是一种慢性、致残性的精神障碍，其特征为幻觉、妄想、思维紊乱以及认知缺陷23,24。小胶质细胞是脑内的常驻巨噬细胞，在突触修剪过程中发挥核心作用25,26。尸检研究和正电子发射断层扫描（PET）研究均显示 SCZ 患者存在小胶质细胞功能障碍的证据25,26,27,28,29,30,31,32。SCZ 患者的尸检脑组织显示出虽细微但可重复验证的脑部差异——皮层第 III 层的锥体神经元表现出树突棘密度降低以及突触数量减少33,34,35。突触修剪是一种由小胶质细胞在青春期清除多余兴奋性突触连接的过程，而 SCZ 患者通常在此阶段首次出现精神病性发作22,36。尸检研究表明 SCZ 与小胶质细胞活化之间存在关联，SCZ 脑组织中小胶质细胞密度增加，且促炎基因表达水平升高27。此外，使用针对小胶质细胞活化的放射性配体进行的人脑 PET 研究显示，皮层中活化的小胶质细胞水平升高25,26,27,28 。最近的全基因组关联研究（GWAS）表明，SCZ 最强的遗传关联位于主要组织相容性复合体（MHC）位点，而该关联源于补体成分 4（C4）基因的等位基因，这些基因在啮齿类动物出生后的突触修剪过程中起介导作用37。这一发现进一步支持了如下假说：小胶质细胞异常的修剪可能导致 SCZ 尸检脑组织中观察到的树突棘密度降低。目前对 SCZ 中小胶质细胞参与突触修剪的研究仍局限于通过 PET 成像进行的间接研究，或基于尸检脑组织研究的推论。

在实验室中生成人类小胶质细胞
原代培养的小鼠小胶质细胞已被广泛用于小胶质细胞的研究，但有若干证据表明啮齿类动物的小胶质细胞在解剖结构和基因表达方面可能无法代表人类小胶质细胞表1)38多项研究还通过转分化方式直接将血液单核细胞分化为小胶质细胞。39,40,41,42血液单核细胞来源的小胶质细胞样细胞在基因和蛋白质表达谱、促炎反应方面与人小胶质细胞存在显著差异，其生物学特性更类似于巨噬细胞43近年来的方法学进展使得能够从人iPSCs生成小胶质细胞，这为研究更准确地模拟人脑中小胶质细胞生物学特性的活体小胶质细胞提供了机会（表2这些由iPSC分化而来的微胶质细胞已被证实能够重现原代人微胶质细胞的表型、基因表达谱及功能特性44,45,46,47,48本文提供了一种共培养源自同一供体的人诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元与小胶质细胞的方法，以构建个性化的 体外 神经元-小胶质细胞相互作用模型。为此 体外 共培养模型，采用Fossati团队建立的小胶质细胞分化方案（表3）并结合Livesey团队开发的皮层神经元生成方案的改进版本（表4)49,50.

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方案

本研究中使用的人类诱导多能干细胞（iPSCs）系由健康对照受试者经知情同意后提供的成纤维细胞重编程而来，并已获得机构审查委员会（IRB）的批准。本研究中所用iPSCs系（ML15、ML27、ML40、ML56、ML141、ML250、ML292）的重编程及鉴定方法已在先前的研究中描述51。

1. iPSC 的培养与维持

  1. 在解冻细胞储备液前，将无LDEV的低生长因子基底膜基质用不含酚红的DMEM/F12培养基按1:50稀释，并用1 mL稀释液预包被6孔板，于37 °C孵育至少2小时。
  2. 将冻存的iPSC细胞储备液在37 °C水浴中解冻2分钟。将细胞加入含有5 mL DMEM/F12培养基的15 mL离心管中，以300 x g离心5分钟。
  3. 移除预包被的无LDEV低生长因子基底膜基质板中的包被液，每孔加入含10 µM Rock抑制剂（Y-27632）的干细胞培养基（SCM）1 mL。
  4. 用含10 µM Y-27632的SCM重悬细胞沉淀，并接种至预包被的孔板中，最终体积为2 mL SCM加Y-27632。将iPSC细胞培养物置于37 °C培养箱中维持24小时。
  5. 解冻24小时后，更换为2 mL不含Y-27632的新鲜SCM。
  6. 当iPSC细胞融合度达到80–90%时，将其传代至经无LDEV低生长因子基底膜基质包被的75 cm²培养瓶中。
    1. 传代时，先用HBSS洗涤细胞，静置30秒后吸除。加入1 mL非酶细胞解离试剂，于37 °C孵育4分钟。同时准备含有10 µM Y-27632的SCM培养基的培养板。
    2. 吸除非酶细胞解离试剂，每孔加入1 mL含10 µM Y-27632的SCM。用细胞刮轻轻刮取细胞，并用1000 µL移液器收集细胞悬液。
    3. 将细胞悬液接种至经无LDEV低生长因子基底膜基质包被的75 cm²培养瓶中，总体积为8 mL含Y-27632的SCM。

2. 小胶质细胞分化

注意：图示展示了小胶质细胞分化方案的示意图。 图1A使用前将培养基预热至室温。

  1. 第0天：使用添加了80 ng/mL BMP-4的SCM培养基进行完全换液。在第1至3天期间，每天使用相同的培养基进行换液，换液之间无需洗涤。
  2. 第4天：制备第4-5天培养基：造血培养基（HM），添加25 ng/mL FGF、100 ng/mL SCF和80 ng/mL VEGF。吸除原有培养基，更换为含5 µM Y-27632的第4-5天培养基。
    注意：此时细胞开始漂浮，约一半细胞处于悬浮状态，另一半仍贴壁。
  3. 第6天：配制第6–13天培养基：在HM培养基中添加50 ng/mL SCF、50 ng/mL IL-3、5 ng/mL TPO、50 ng/mL m-CSF和50 ng/mL Flt3-L。收集上清液，加入15 mL锥形管中，以300 × g离心8分钟 g将沉淀物用8 mL添加了5 µM Y-27632的第6-13天培养基重悬于烧瓶中。
  4. 第10天：在原有培养基上添加8 mL第6-13天培养基。
  5. 第14天：制备第14天及以上培养基：在HM培养基中添加50 ng/mL m-CSF、50 ng/mL Flt3-L和50 ng/mL GM-CSF。收集上清液，加入50 mL锥形管中，以300 × g离心8分钟 g将沉淀重悬于8 mL含5 µM Y-27632的第14天后培养基中，并继续在此培养基中培养。
  6. 第18天：加入8 mL Day14+培养基。
  7. 第22天：不更换原有培养基，直接加入8 mL新鲜的Day14+培养基。
  8. 第25天：将细胞转移至步骤2.9，或继续在第14天后培养基中维持培养至分化第50天。
  9. 第25天后，收集上清液至50 mL锥形管中，以300 x g离心8分钟 g.
    1. 制备贴壁培养基：在RPMI培养基中添加1%的200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl溶液），25 ng/mL GM-CSF和100 ng/mL IL-34。
    2. 将沉淀物重悬于含有5 µM Y-27632的贴壁培养基中。
    3. 以每平方厘米50,000个细胞的密度接种细胞2 用于不同实验的24孔板：用于小胶质细胞单培养的无LDEV、低生长因子基底膜基质包被板，以及用于成像实验的每毫升含10 µg多聚-L-鸟氨酸和10 µg层粘连蛋白的玻璃成像板。
    4. 用DPBS稀释多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白，每孔加入250 µL至24孔成像板中。
      注意：培养中的细胞现在具有贴壁生长的特性（图1C).
  10. 将细胞培养至少14天，每两周更换一次培养基。接种后第14天，细胞已达到成熟状态，可用于实验。

3. 皮层神经元分化

注意：皮层神经元分化方案的示意图见图1G。

  1. 第0天：
    1. 当iPSCs在无LDEV的低生长因子修饰的基底膜基质包被的培养板上达到融合状态时，将培养基从SCM更换为N2/B27培养基的50/50混合液，并添加10 µM SB431542、1 µM dorsomorphin和100 nM LDN193189。
      注：N2培养基由基础培养基添加1% N-2补充剂、1% 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl溶液）、1% 青霉素/链霉素组成；B27培养基由DMEM/F12添加2% B-27补充剂、1% 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl溶液）、1% 青霉素/链霉素组成。
    2. 每日更换添加上述补充剂的新鲜培养基，持续7天。
  2. 第7天：
    1. 用无LDEV的低生长因子修饰的基底膜基质对培养板进行预包被，孵育至少2小时。
    2. 按1:1比例传代细胞至预包被的培养板中。每孔加入1 mL HBSS清洗细胞，静置30秒后吸除。每孔加入1 mL细胞解离试剂（如Accutase），于37 °C孵育4–5分钟。孵育期间，提前在15 mL锥形管中加入5 mL DMEM备用。
    3. 使用P1000移液器轻轻吹打，使细胞脱离培养板，并将细胞与解离试剂的混合液收集至含有5 mL DMEM的15 mL锥形管中。
    4. 将细胞悬液在300 × g 条件下离心5分钟。弃上清后，用1 mL含10 µM Y-27632的N2/B27培养基重悬细胞沉淀。此后继续每日更换不含任何补充剂的N2/B27培养基。
  3. 第12天：按照3.2.2中所述方法以1:1比例传代细胞。继续每日更换N2/B27培养基。
  4. 第15/16天：按照3.2.2中所述方法以1:2比例传代细胞。继续每日更换N2/B27培养基。
  5. 第18/19天：按照3.2.2中所述方法以1:3比例传代细胞。继续每日更换N2/B27培养基，直至第25天。
  6. 第25天：使用添加10 µM DAPT的N2/B27培养基喂养细胞。
  7. 第28天：使用新鲜的、未添加补充剂的N2/B27培养基喂养细胞。
  8. 第30天：按照3.2中所述方法将细胞传代至小胶质细胞培养板中，并在添加1% B-27补充剂的BrainPhys培养基中维持培养。

4. 小胶质细胞/神经元共培养

  1. 将第30天的皮层神经元以每平方厘米50,000个细胞的密度接种于小胶质细胞培养物上2在培养基中添加1 µg/mL层粘连蛋白以增强细胞贴壁。
  2. 在含1% B-27添加剂的50%贴壁培养基与50% Brainohys培养基混合液中培养细胞。每两周进行半量换液，直至开展实验。
  3. 在神经元培养至第60天后进行实验。

5. 干扰素-γ 处理

  1. 配制新鲜培养基，添加 100 ng/mL IFN-γ。加入培养基，37°C 孵育 24 小时。移除培养基后，进行后续实验。

6. 免疫细胞化学

  1. 在室温下用 100 μL 的 4% 多聚甲醛固定培养皿中的细胞，持续 20 分钟。
  2. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  3. 加入 1 mL PBST（PBS + 0.1% Triton X），作用 10 分钟。
  4. 加入封闭缓冲液：1 mL PBS 加 5% 山羊血清，孵育 1 小时。
  5. 加入用 100 μL PBS + 1% 山羊血清稀释的一抗，于 4 °C 过夜孵育。所有一抗均需根据实际情况进行优化。
  6. 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，每次 5 分钟。
  7. 加入用 100 μL PBS 加 1% 山羊血清稀释的二抗，在室温下孵育 1 小时。

7. 脊柱分析

  1. 在共聚焦显微镜下以 60 倍放大倍数获取图像。
  2. 使用 ImageJ 的 NeuronJ52 功能分析图像。
  3. 通过 NeuronJ 测量神经突长度、树突棘长度和树突棘数量。

8. 钙成像

  1. 配制含有 3 µM Fluo-4AM 染料的新鲜培养基。将共培养细胞在 37 °C 条件下孵育 30 分钟。随后用 PBS 洗涤细胞，加入活细胞成像溶液，并立即进行成像。
  2. 使用配备活细胞成像功能的共聚焦显微镜，以 40 倍物镜采集持续 2 分钟的时间序列图像。可记录基础状态下的细胞活动，或在加入 15 mM 谷氨酸，或在 5 mM 氯化钾诱导去极化的条件下进行记录。
  3. 使用 ImageJ 软件测量单个细胞体随时间变化的荧光强度。利用选择工具，围绕每个细胞体选定独立的兴趣区域（ROI）。打开 ROI Manager，点击 Add 添加选区。继续将新的选区添加至 ROI 管理器中。
  4. 使用 Set Measurements 工具测量 Mean Gray Area。当所需数量的细胞体均已被添加至 ROI 管理器后，全选所有区域，然后使用 Multi-Measure 工具。该操作将输出视频文件时间序列中每个兴趣区域的平均灰度值。导出的数据将提供每一帧图像中兴趣区域的平均荧光强度。
  5. 计算荧光强度比值 F/F0，其中 F 为某一时间点的荧光强度，F0 为初始荧光强度。可通过绘制 F/F0 随时间变化的曲线来分析神经元的自发活动，或在刺激条件下分析其最大荧光强度的变化。

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结果

方案验证
采用七个人诱导多能干细胞（iPSC）系，经过三轮不同的分化过程生成iPSC来源的小胶质细胞。实验使用了对照iPSC系ML27、ML56、ML292和ML364，以及精神分裂症iPSC系ML40、ML141和ML250。这些iPSC系的特征表征此前已有描述51。通过免疫细胞化学（ICC）和定量PCR（qPCR）对这些iPSC来源的小胶质细胞进行了验证。采用优化后方案生成的小胶质细胞表现出典型的小胶质细胞分支状形态（图1C），并通过免疫细胞化学检测发现其表达小胶质细胞标志物CD11c、TMEM119和IBA1（图1D、E）。对细胞核表达小胶质细胞标志物CD11c、P2RY12和IBA1的细胞进行了定量分析。结果显示，分别有63%、60%、65%和44%的细胞表达CD11c、P2RY12、IBA1和TMEM119，该结果与原始分化方案论文中报道的数据一致...

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讨论

多能干细胞沿不同谱系分化方法的发展为研究脑功能及疾病过程开辟了诸多途径53,54,55早期研究主要集中在特定神经元细胞类型的发育上，这些细胞类型被认为在特定脑部疾病中具有重要作用56,57近年来，脑类器官还为利用患者特异性的三维模型研究疾病生物学提供了新途径51,58二维和三维细胞模型在解决不同科学问题时具有特定优势59早期研究主要集中在神经元谱系的细胞上，而近期的进展使得大脑中其他细胞类型的生成成为可能，例如小胶质细胞和脑微血管内皮细胞60,61在研究这些...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国家心理健康研究所生物行为研究创新新科学家奖（BRAINS奖）R01MH113858 （授予R.K.）、美国国家心理健康研究所临床科学家发展奖K08MH086846（授予R.K.）、多丽丝·杜克慈善基金会临床科学家发展奖（授予R.K.）、Ryan Licht Sang双相障碍基金会（授予R.K.）、Jeanne Marie Lee-Osterhaus家族基金会以及脑与行为研究基金会（Brain & Behavior Research Foundation）的NARSAD青年研究者奖（授予A.K.）、Phyllis & Jerome Lyle Rappaport基金会（授予R.K.）、哈佛干细胞研究所（授予R.K.）以及Steve Willis和Elissa Freud（授予R.K.）的资助。我们感谢哈佛医学院和麦克莱恩医院的Bruce M. Cohen博士和Donna McPhie博士为我们提供了本研究中所用的成纤维细胞。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 添加剂Gibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C 抗体Biolegend337207稀释比例 1:200
Costar 平底细胞培养板Corning07-200-83
Ctip2 抗体Abcamab18465
CUTL1 单克隆抗体AbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12，无酚红Gibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS，无钙、无镁Gibco14190144
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Sigma-AldrichD6421
EasYFlask 细胞培养瓶Nunc156499
Fisherbrand 细胞刮刀Fisher Scientific08-100-240
Flt3-配体Peprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 mLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
羊抗鸡 IgG H&L（Alexa Fluor 488）Abcamab150169稀释比例 1:1000
羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 568）InvitrogenA-11004稀释比例 1:1000
羊抗大鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）Abcamab175670稀释比例 1:1000
羊抗豚鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）Abcamab175678稀释比例 1:1000
山羊血清Sigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 抗体Abcamab5076稀释比例 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-γPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green 引物Sigma-AldrichKSPQ12012
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
活细胞成像溶液InvitrogenA14291DJ
MAP2 抗体Synaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
N-2 添加剂Gibco17502001
Neurobasal 培养基Life Technologies21103049
NutriStem hPSC XF 培养基Biological Industries01-0005
P2RY12 抗体Biolegend848002
16% 多聚甲醛Fisher Scientific50-980-488
青霉素-链霉素Gibco15140122
多聚-L-鸟氨酸Sigma-AldrichP3655
SATB2 抗体Abcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24 孔玻璃底板Greiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 抗体Abcamab185333稀释比例 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）Tocris1254

参考文献

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