人诱导多能干细胞分化的小胶质细胞与皮层神经元共培养

摘要

本方案描述了一种从人iPSCs分化出小胶质细胞并将其与iPSC来源的皮层神经元共培养的方法，旨在利用人源神经元和小胶质细胞研究神经免疫相互作用的机制基础。

摘要

利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成小胶质细胞的能力，为研究小胶质细胞在健康和疾病中的作用提供了新的工具和途径。此外，iPSC来源的小胶质细胞可与iPSC来源的皮层神经元进行共培养，从而能够研究小胶质细胞与神经元之间的相互作用，而这种相互作用被认为在多种神经精神疾病中出现失调。本研究采用经改良的Fossati研究组所建立的方案，将人iPSCs分化为小胶质细胞，并通过标志物分析和实时PCR对iPSC来源的小胶质细胞进行了验证。使用该方案生成的人小胶质细胞对CD11C、IBA1、P2RY12和TMEM119等标志物呈阳性，并表达小胶质细胞相关基因AIF1、CX3CR1、ITGAM、ITGAX、P2RY12和TMEM119。将已分化30天的人iPSC来源皮层神经元与小胶质细胞共同接种，并维持共培养至第60天后进行实验。在基础状态以及存在促炎性细胞因子的条件下，定量分析了与小胶质细胞共培养的皮层神经元中树突棘的密度。为了探究小胶质细胞如何调节神经元功能，使用钙离子指示剂Fluo-4 AM对皮层神经元进行了钙成像实验。通过共聚焦显微镜获取皮层神经元的活细胞钙活动信号，并使用ImageJ软件定量分析荧光强度。本报告描述了人iPSC来源的小胶质细胞与皮层神经元共培养体系如何为研究小胶质细胞对皮层神经元的影响提供新的方法。

引言

在人类大脑中，小胶质细胞是主要的先天免疫细胞¹。小胶质细胞通过两种途径调控大脑发育：释放可扩散因子和吞噬作用¹。小胶质细胞释放的可扩散因子有助于支持髓鞘形成、神经发生、突触形成、成熟、细胞死亡和细胞存活¹。小胶质细胞还吞噬大脑突触、轴突以及活细胞和死细胞中的多种成分^{2,3,4,5,6,7,8}。小胶质细胞上的受体可识别钙网蛋白、ATP和唾液酸等标记物，并调控细胞吞噬作用^9,10。在海马体中，小胶质细胞通过其吞噬功能维持神经发生的稳态¹¹。

啮齿类动物脑部背外侧膝状体核（dLGN）中的突触吞噬作用已被证实受小胶质细胞....

方案

本研究中使用的人类诱导多能干细胞（iPSCs）系由健康对照受试者经知情同意后提供的成纤维细胞重编程而来，并已获得机构审查委员会（IRB）的批准。本研究中所用iPSCs系（ML15、ML27、ML40、ML56、ML141、ML250、ML292）的重编程及鉴定方法已在先前的研究中描述⁵¹。

1. iPSC 的培养与维持

1. 在解冻细胞储备液前，将无LDEV的低生长因子基底膜基质用不含酚红的DMEM/F12培养基按1:50稀释，并用1 mL稀释液预包被6孔板，于37 °C孵育至少2小时。
2. 将冻存的iPSC细胞储备液在37 °C水浴中解冻2分钟。将细胞加入含有5 mL DMEM/F12培养基的15 mL离心管中，以300 x g离心5分钟。
3. 移除预包被的无LDEV低生长因子基底膜基质板中的包被液，每孔加入含10 µM Rock抑制剂（Y-27632）的干细胞培养基（SCM）1 mL。
4. 用含10 µM Y-27632的SCM重悬细胞沉淀，并接种至预包被的孔板中，最终体积为2 mL SCM加Y-27632。将iPSC细胞培养物置于37 °C培养箱中维持24小时。
5. 解冻24小时后，更换为2 mL不含Y-27632的新鲜SCM。
6. 当iPSC细胞融合度达到80–90%时，将其传代至经无LDEV低生长因子基底....

结果

方案验证
iPSC来源的微胶质细胞由七个人诱导多能干细胞（iPSC）系在三轮不同的分化过程中生成。实验使用了对照iPSC系ML27、ML56、ML292和ML364，以及精神分裂症iPSC系ML40、ML141和ML250。这些iPSC系的特征表征已在先前研究中描述⁵¹。通过免疫细胞化学（ICC）和定量PCR（qPCR）对这些iPSC来源的微胶质细胞进行了验证。采用优化后方案生成的微胶质细胞表现出典型的分支状微胶质细胞形态（图1C），并通过免疫细胞化学检测到表达微胶质细胞标志物CD11c、TMEM119和IBA1（图1D、E）。对细胞核表达微胶质细胞标志物CD11c、P2RY12和IBA1的细胞进行了定量分析。分别有63%、60%、65%和44%的细胞表达CD11c、P2RY12、IBA1和TMEM119，该结果与原始分化方案论文中报道的数据一致⁴⁹.......

讨论

多能干细胞沿不同谱系分化方法的发展为研究脑功能及疾病过程开辟了诸多途径^53,54,55早期研究主要集中在特定神经元细胞类型的发育上，这些细胞类型被认为在特定脑部疾病中具有重要作用^56,57近年来，脑类器官还为利用患者特异性的三维模型研究疾病生物学提供了新途径^51,58二维和三维细胞模型在解决不同科学问题时具有特定优势⁵⁹早期研究主要集中在神经元谱系的细胞上，而近期的进展使得大脑中其他细胞类型的生成成为可能，例如小胶质细胞和脑微血管内皮细胞^60,61在研究这些.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964
B-27 添加剂	Gibco	17504044
b-FGF	Peprotech	100-18B
BMP-4	Peprotech	120-05ET
Brainphys	StemCell Technologies	5790
CD11C 抗体	Biolegend	337207	稀释比例 1:200
Costar 平底细胞培养板	Corning	07-200-83
Ctip2 抗体	Abcam	ab18465
CUTL1 单克隆抗体	Abnova	H00001523-M01
DMEM/F-12，无酚红	Gibco	21041025
dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499
DPBS，无钙、无镁	Gibco	14190144
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D6421
EasYFlask 细胞培养瓶	Nunc	156499
Fisherbrand 细胞刮刀	Fisher Scientific	08-100-240
Flt3-配体	Peprotech	300-19
Fluo4-AM	Life Technologies	F-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 mL	ThermoFisher Scientific	A1413201
Glutamax	ThermoFisher Scientific	35050061
GM-CSF	Peprotech	300-03
羊抗鸡 IgG H&L（Alexa Fluor 488）	Abcam	ab150169	稀释比例 1:1000
羊抗小鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 568）	Invitrogen	A-11004	稀释比例 1:1000
羊抗大鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）	Abcam	ab175670	稀释比例 1:1000
羊抗豚鼠 IgG H&L（Alexa Fluor 405）	Abcam	ab175678	稀释比例 1:1000
山羊血清	Sigma-Aldrich	G9023
HBSS	Invitrogen	14170120
IBA1 抗体	Abcam	ab5076	稀释比例 1:500
IL-34	Peprotech	200-34
INF-γ	Peprotech	300-02
KiCqStart SYBR Green 引物	Sigma-Aldrich	KSPQ12012
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0599
活细胞成像溶液	Invitrogen	A14291DJ
MAP2 抗体	Synaptic Systems	188 004
M-CSF	Peprotech	300-25
N-2 添加剂	Gibco	17502001
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103049
NutriStem hPSC XF 培养基	Biological Industries	01-0005
P2RY12 抗体	Biolegend	848002
16% 多聚甲醛	Fisher Scientific	50-980-488
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P3655
SATB2 抗体	Abcam	ab51502
SB431542	Sigma-Aldrich	S4317
SCF	Stemcell Technologies	78062
SensoPlate 24 孔玻璃底板	Greiner-Bio	662892
StemPro-34 SFM (1X)	Gibco	10639011
TMEM119 抗体	Abcam	ab185333	稀释比例 1:1000
TPO	Peprotech	300-18
Triton-X	Sigma-Aldrich	9002-93-1
VEGF	Peprotech	100-20
Versene	ThermoFisher Scientific	15040066
Y-27632 二盐酸盐（ROCK 抑制剂）	Tocris	1254