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建立来自口腔的共生糖杆菌稳定二元培养物

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DOI：

10.3791/62484

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2021年4月13日

 ,  , 
1The Forsyth Institute, 2Harvard School of Dental Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们展示了一种通过过滤牙菌斑并与宿主细菌共培养来分离难以培养的新型细菌门——糖杆菌门（Saccharibacteria）成员的方法。

摘要

许多细菌物种无法使用标准方法在实验室中培养，这为研究地球上大多数微生物多样性带来了重大障碍。为了有效利用实验室中强大的工具来研究这些未培养细菌的生理特性和生活方式，亟需开发新的培养方法。候选门类辐射群（Candidate Phyla Radiation, CPR）是最大的未培养细菌类群之一，约占地球生命多样性的15%。该类群中首个被分离的菌株属于糖杆菌门（Saccharibacteria），即“Nanosynbacter lyticus”菌株TM7x。TM7x是一种异常微小的细菌，以共生方式直接与宿主细菌——Schaalia odontolytica菌株XH001——密切接触并生存。利用其细胞尺寸极小以及共生生活方式的特点，我们开发了一种从牙菌斑中快速培养糖杆菌的实验方案。本方案将介绍如何将牙菌斑悬液通过0.2 µm滤膜过滤，随后浓缩收集到的糖杆菌细胞，并用于感染宿主菌培养物。所获得的共培养体系可像普通细菌培养物一样传代，感染情况可通过PCR进行确认。该二元培养体系可在实验室中长期维持，并用于后续实验。尽管存在污染的可能性，但可通过进一步过滤后重新感染宿主，或通过平板划线筛选感染菌落的方式对二元培养物进行纯化。我们希望本方案能够拓展至其他样本类型和环境，从而实现更多CPR类群细菌的培养。

引言

培养细菌的新物种并将其引入实验室，有助于开展强有力的研究实验，以更深入地理解其生理特性及其在微生物群落中的广泛相互作用。尽管存在无需培养即可探究这些问题的方法（例如"宏组学"），但由于复杂多样的微生物种群之间存在复杂的相互作用，难以分离单一变量并得出有意义的结论。虽然细菌培养具有诸多优势，但在分离细菌并实现纯培养的过程中仍存在许多潜在障碍。潜在的特定生长需求包括pH、氧张力、维生素、生长因子、信号分子，甚至需要直接的细胞接触才能诱导生长1。然而，人们普遍认为，特定的营养缺陷型是阻碍新细菌物种培养的主要因素。标准培养基配方缺乏许多未培养细菌所需的营养物质，例如特定维生素或碳源。这些缺失的分子可能是未培养细菌生理功能的关键，通常由微生物群落中的其他生物或宿主生物提供。例如，动物宿主可提供黏蛋白等复杂碳水化合物。将这些成分添加至培养基中，已成功实现了多种动物肠道细菌的培养，包括Akkermansia muciniphila和Mucinivorans hirudinis2,3,4。许多致病菌已进化出利用动物细胞中血红素结合铁的能力，例如口腔致病菌Porphyromonas gingivalis5。在实验室条件下，添加血红素可促进Porphyromonas及其他微生物的生长6。

近年来，通过共培养技术，利用"饲养"生物为尚未培养的细菌提供其生长所必需的特定因子，已在分离培养新型细菌方面取得多项突破。Vartoukian 及其同事的一项精巧研究表明，细菌产生的铁载体（即结合铁的分子）能够促进多种新型口腔分离菌的生长。研究发现，假单胞菌属（Pseudomonad）产生的铁载体——绿脓菌素（pyoverdines），可显著促进一种新型Prevotella物种的生长7。在同一项研究中，研究者还成功培养出首个口腔来源的绿弯菌门（Chloroflexi）细菌，该培养过程同样使用了F. nucleatum作为辅助菌，以提供某种尚未明确的化合物7。更近的一项研究中，利用Bacteroides fragilis作为辅助菌，成功分离出一种属于Ruminococcaceae属的细菌8。后续研究证实，该菌在实验室培养基上的生长依赖于γ-氨基丁酸（GABA）——一种抑制性神经递质。使用饲养菌已被证明是一种关键策略，可有效模拟未培养细菌所处的特定微环境，相比不断以不同浓度添加各种成分来反复优化培养基的方法，该策略效率更高。

未培养细菌中最大的类群之一属于 "候选门类辐射" （心肺复苏术，CPR），一个包含多个候选细菌门的单系群9,10截至目前，候选门级辐射群（CPR）中仅有糖杆菌门（Saccharibacteria）的成员在实验室中成功实现培养。首个分离株为'Nanosynbacter lyticus 菌株 TM7x 是通过使用抗生素链霉素分离得到的，此前预测该抗生素可富集未培养的 TM7 菌11,12本研究的一个关键发现是，该新分离株以寄生方式生长，并与细菌宿主直接接触。 Schaalia odontolytica，显微镜观察显示这些寄生虫为超小型细菌。

基于这些线索，我们设计了一种快速建立共生牙杆菌（Saccharibacteria）与其宿主伙伴二元共培养体系的方法：将牙菌斑及其他口腔样本通过0.2 µm滤膜过滤，离心收集滤液中的细胞，并用这些细胞感染候选宿主细菌的培养物。该方法的优势在于避免了富集培养，因为富集培养可能被生长迅速的生物体所主导；同时避免了抗生素的使用，而抗生素可能会抑制目标共生牙杆菌物种或其宿主的生长。通过本视频中展示的方法，我们已成功培养出32株属于共生牙杆菌门（Saccharibacteria phylum）的分离株。

方案

在制定本方案时，已获得机构审查委员会（IRB）的批准（批准编号：#14-10），并从所有受试者处获取了知情同意书。

1. 准备

  1. 涉及人类受试者的研究，须获得必要的机构审查委员会（IRB）批准及知情同意。
  2. 提前开始宿主细菌的培养，确保有足够时间生长至早期稳定期。例如，接种 2–5 mL 添加 0.1% 酵母提取物的胰蛋白胨大豆肉汤（TSBY） ，并接种 Arachnia propionica，于 37 °C 培养 24 小时。
  3. 将核孔径为 0.2 µm 的滤膜安装至滤器支架中。用铝箔包裹组件，并通过高压灭菌进行灭菌。
  4. 对离心管及管盖组件进行灭菌。

2. 获取口腔细菌样本

注意：尽管许多口腔样本中含有共生菌门（如唾液、扁桃体拭子、舌刮取物），但牙菌斑通常是分离该菌最成功的来源。

  1. 使用无菌纸尖、Gracey刮治器采集牙菌斑样本；若为自行采样，可使用无菌牙签或移液器吸头。将牙菌斑转移至适当的缓冲液中，例如最大回收稀释液（MRD，0.85% NaCl，0.1%蛋白胨）或PBS。若不能立即处理，需将样本置于冰上保存，直至准备进行后续操作。
  2. 使用小号移液器吸头，结合涡旋振荡和吹打，充分重悬牙菌斑于MRD缓冲液中。
  3. 将重悬后的牙菌斑样本加入额外的9 mL MRD缓冲液中。

3. 制备口腔样本的滤液

  1. 采用无菌操作技术，打开无菌滤器组件的包装。将滤器 holder 轻轻旋转四分之一圈再重新拧紧，以确保螺纹正确啮合且装置已正确闭合。使用注射器，通过装置泵入 10 mL MRD 缓冲液以润洗滤膜。若组装不当，此步骤将出现液体从滤器 holder 泄漏。若发生泄漏，应另取一套新的无菌滤器组件，并重复润洗步骤。
  2. 将样品施加至已润洗的滤膜上。从注射器上取下活塞，将其连接至滤器装置。将已分散于 10 mL MRD 缓冲液中的牙科样品倒入注射器中，并加载至滤器上。
  3. 在滤器装置下方放置一支无菌离心管，用于收集滤液，然后轻轻施加压力于活塞，推动样品通过滤膜。
  4. 重复上述操作，再用 10 mL MRD 缓冲液润洗滤膜，并将洗脱液收集至与滤过样品相同的离心管中。无菌条件下盖紧管盖。

4. 通过离心浓缩Saccharibacteria细胞

  1. 在离心管和管盖上做好方向标记，并将离心管放入高速离心机中，使标记朝上。离心后形成的沉淀通常不可见。该标记有助于在离心完成后取出离心管时确定Saccharibacteria细胞沉淀的位置。
  2. 在 4 °C 条件下，以 60,000 × g 离心 1 小时。
    注意：此离心力和时间足以沉淀所有Saccharibacteria细胞。然而，Saccharibacteria细胞在 20,000 × g 条件下离心仅 20 分钟也可实现至少部分沉淀。
  3. 小心地从离心机中取出离心管，倾倒出管内液体，同时保持沉淀位于离心管的上侧。
  4. 通过剧烈涡旋，将通常不可见的沉淀重悬于 1–2 mL MRD 缓冲液中。

5. 用富集的糖杆菌门细菌滤液感染宿主培养物

  1. 将适量的培养基（如 TSBY、BHI 等）分装至培养管中，每管 2 mL。
  2. 向每管中加入 200 µL 宿主生物的过夜培养物。再向每管中加入 100–200 µL 重悬并过滤后的样品。
  3. 根据宿主生物的培养条件孵育混合样品（例如，A. propionica 在 37 °C、有氧环境中培养）。
  4. 每两到三天传代一次，将 200 µL 共培养物转移至新管中含 2 mL 新鲜培养基的管中。若发现传代后的培养物无明显生长（即传代至新鲜培养基后培养液浊度/光密度未增加），则可能 Saccharibacteria 过度增殖或已杀死全部宿主生物。此时可在传代时加入 200 µL 未感染的宿主培养物以缓解该情况。至少连续传代 5 次。

6. 通过 PCR 确认感染

  1. 经过5次传代后，通过PCR确认感染。5次传代可确保任何不生长的Saccharibacteria细胞已被耗尽至低于PCR检测限（采用25个PCR循环）。
  2. 配制PCR预混液。建议配方如下：每需要的PCR管，配制12.5 µL 2x PCR缓冲液、0.75 µL 10 µM 正向引物（580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C）、0.75 µL 10 µM 反向引物（1177R13 - GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC）、1 µL 25 mM MgCl2 和9 µL 水。通过涡旋充分混匀。
  3. 将24 µL预混液分装至0.2 mL PCR管中。向PCR反应体系中加入1 µL Saccharibacteria感染的培养物。将PCR管放入热循环仪中，执行以下程序：95 °C 初始变性5分钟；25个循环：95 °C 变性30秒，60 °C 退火30秒，72 °C 延伸30秒；72 °C 最终延伸2分钟，随后4 °C 保存。
  4. 将PCR产物上样并在1%琼脂糖凝胶中电泳。约600个碱基的条带表明存在Saccharibacteria。

7. 检测纯度并去除污染生物体

  1. 通过将Saccharibacteria共培养物接种于适合宿主生物生长的营养琼脂平板上，确认阳性培养物的纯度。用无菌缓冲液（如MRD或PBS）对培养物进行10倍系列稀释，并取100 µL涂布于琼脂平板上。进行适当稀释，使平板上生长的菌落数约为20–200个。
  2. 将平板置于适宜的生长条件下培养，并观察是否存在污染生物。
    注意：从未观察到纯培养的Saccharibacteria菌落，因此这些平板上仅可见宿主生物生长。若出现不止一种类型的菌落，通常表明存在污染。一旦发生污染，应对培养物重新过滤以去除不需要的污染物，并重新接种至新鲜宿主中。
  3. 偶尔会发生双重感染，即两种Saccharibacteria物种同时感染同一宿主。为分离不同的Saccharibacteria物种，将单个菌落重悬于20 µL无菌PBS中，取1 µL悬液进行PCR反应，以检测含有Saccharibacteria感染的菌落。
  4. 将PCR结果呈阳性的悬液转移至培养基中，建立二元培养物。分离成功率取决于每种Saccharibacteria物种在培养物中的滴度。可能需要筛选超过50个菌落，才能找到可用于扩增的感染菌落。

8. 培养物的保存

  1. 培养足够体积（10–50 mL）的双菌共培养物，过夜生长。
  2. 通过离心收集细胞（4,000 × g，10 分钟）。
    注意：此处无需高速离心，因为Saccharibacteria细胞会附着在较大且较重的宿主细胞上，并随宿主细胞一同沉淀。
  3. 将细胞重悬于冷冻保护剂中。通常在培养基中添加5% DMSO或20%甘油即可。需确保宿主生物与冷冻保护剂兼容（例如，甘油会抑制A. propionica的生长，可能导致冻存菌株无法复苏）。应先用未感染的宿主菌在含冷冻保护剂的培养基中测试其存活能力，以确认菌株可耐受冷冻过程。
  4. 将细胞沉淀重悬于等体积的培养液（10–50 mL）中，分装0.5 mL至标记好的冻存管中，于-80 °C冷冻保存细胞培养物。

结果

在初始感染培养物中，由于Saccharibacteria共生菌数量较少，检测Saccharibacteria的PCR结果可能呈阴性（即未观察到扩增产物）。然而，经过数次传代后，应出现明显的PCR扩增条带，表明已建立稳定的感染（图1A）。相反，某些感染在初次PCR检测中呈阳性，但在传代1–4次后信号减弱至无法检测（未展示）。这表明初始滤液中含有大量Saccharibacteria细胞，但在传代过程中被稀释，且未能与宿主培养物建立稳定的共生关系。使用来自口腔的同一Saccharibacteria滤液对多种宿主物种进行感染测试时，通常成功率较低（图1B），因为共生菌与宿主之间的相互作用具有高度特异性。研究人员也可使用同一种宿主，测试来自多个不同供体的滤液。若选用合适的宿主菌株（如 Arachnia propionica 或 Schaalia odontolytica），预期成功率可达50%。

PCR检测至关重要。有经验的研究人员曾尝试通过显微镜检查来确认感染，但结果却报告了假阳性。Saccharibacteria细胞体积微小，难以与囊泡或细胞膜不规则膨出区分开来。通过多次传代后仍保持稳定的PCR信号，是确认成功感染的关键。

随着感染培养物的生长，应出现正常的浑浊生长。当共生关系建立后，感染培养物的浑浊度会低于未感染宿主生物的培养物（图2A）。在某些情况下，感染培养物可能看起来完全停止生长，且完全不产生浑浊。这可能是由于感染过程中Saccharibacteria细胞过度增殖，导致宿主生物受到严重抑制。向这些培养物中添加“新鲜”（未感染）的宿主，可提供足够数量的宿主细胞，以支持Saccharibacteria寄生菌的持续生长。

过度生长或培养物过于浑浊，可能表明存在污染，污染源可能是实验室污染物，也可能是能够通过0.2 µm滤膜的其他小型口腔细菌。Campylobacter和Capnocytophaga spp. 是此类实验中常见的口腔污染物。可通过将培养物划线接种平板，观察是否出现与宿主微生物不符的异常菌落，并结合16S rRNA测序来确认污染。一旦发现污染，通常只需将这些培养物再次通过0.2 µm滤膜过滤即可去除污染物。滤液中的Saccharibacteria细胞可通过离心浓缩，并用于重新感染纯化的宿主培养物。

纯化污染培养物的另一种方法是从感染性培养物的平板上挑取被感染的菌落。与未感染的菌落相比，受感染宿主的菌落有时可通过不规则的菌落形态进行识别（图2B-D）。这些不规则菌落的出现依赖于共生菌Saccharibacteria在双元培养物中的滴度；若滴度较低，则仅有较少比例的菌落呈现不规则形态。这一特征有助于识别被感染的菌落，可将其挑取并用于建立纯净的双元培养物。若从Saccharibacteria感染的培养物平板上未观察到任何不规则菌落，则可能是因为共生菌滴度较低，或其本身不引起菌落形态改变。在此情况下，对形态正常的菌落进行PCR筛查仍可检测到Saccharibacteria感染，但感染率较低（占所有菌落的2–10%）。

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图1：Saccharibacteria 感染宿主培养物的典型 PCR 结果。（A）在初次感染时可能未检测到指示 Saccharibacteria 存在的 PCR 产物，但随着共培养体系的建立，在后续传代中该产物可能出现并增强。（B）大多数宿主因共生关系的特异性，无法支持 Saccharibacteria 的生长。在此示例中，仅有 A. propionica 成功被感染。请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：感染Saccharibacteria后共培养物的生长特征。（A）感染与未感染的A. propionica培养物的生长曲线，显示感染后的培养物无法达到未感染对照组的密度，且浊度较低。（B-D）共培养物在平板上可形成不规则菌落，这是由Saccharibacteria感染所致。不规则菌落所占比例随共培养物中Saccharibacteria滴度的升高而降低。（B）高浓度Saccharibacteria的宿主培养物。（C）10倍稀释的Saccharibacteria。（D）未感染的宿主培养物。白色箭头指示不规则菌落的示例。比例尺= 1 cm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

我们对菌斑进行过滤并将其应用于宿主生物纯培养物的方法，主要基于此前对首个成功培养的共生菌门微生物“Nanosynbacter lyticus”菌株TM7x11,14,15的观察。鉴于该生物细胞体积微小，我们推断可通过滤膜将其与牙菌斑中的其他成分分离，并利用离心法进行浓缩。其次，由于这类生物以寄生方式生存，为其提供宿主的纯培养物即可使其与宿主形成共生关系，进而实现共培养条件下的生长。

该方法的一个优点是无需进行富集培养或施加选择性压力。此前，“Nanosynbacter lyticus”菌株TM7x是通过使用链霉素作为选择性试剂的富集培养获得的，测序结果曾提示该方法可有效富集Saccharibacteria。巧合的是，其宿主“Nanosynbacter lyticus”的宿主菌Schaalia odontolytica已知对链霉素具有抗性16。使用抗生素作为选择性试剂可能会抑制宿主微生物的生长，从而间接阻碍Saccharibacteria的增殖。

使用富集培养的一个更大问题是，生长迅速的生物体会很快取代目标生物体。例如，在口腔中，Streptococcus 属物种可以快速生长，如果培养基中含有糖分，它们会产生足够的酸来酸化培养基，从而进一步抑制目标生物体的生长。通过避免使用富集培养和选择性抗生素，我们的方法提供了一种通用的策略，可应用于更广泛的Saccharibacteria及其潜在宿主，且不会受到其他方法带来的复杂性影响。

该方法存在一些局限性。首先，本方法假设 Saccharibacteria 生长于二元培养体系中。我们尚未测试三元或更高阶的共培养组合以评估其有效性，但可能存在某些 Saccharibacteria 需要单一宿主无法提供的生长因子。要测试大量可能支持 Saccharibacteria 生长的口腔细菌组合，将是一项艰巨的任务。其次，该方法假设所有 Saccharibacteria 的体积均足够小，能够通过 0.2 µm 滤膜。然而，可能存在比预期更大的 Saccharibacteria，导致滤膜对其产生筛选性排除。虽然可使用孔径更大的滤膜，但这会增加非目标口腔细菌进入感染性共培养体系的风险。最后，除已发表的宿主外，极难发现新的宿主物种。迄今为止，成功作为宿主的仅限于某些属的物种 放线菌属、 Schaalia、 Arachnia 和 纤维微菌属，均为放线菌门成员15,17,18然而，这些宿主仅能支持特定种类的共生菌门（Saccharibacteria）生长。要培养更多种类的共生菌门，必须探索更多的宿主。

我们希望本文介绍的方法将有助于未来对Saccharibacteria及其他CPR生物的研究。宏基因组测序表明，这些生物也具有较小的基因组，并被认为可能是共生体，或依赖局部微生物群落提供对其生存至关重要的代谢物及其他因子19。只要这些生物足够微小，且其宿主生物可被培养，类似的过滤策略即可用于分离这些生物。本文所述方法是将实验室培养的强大工具应用于这一庞大而多样化的细菌类群的第一步。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Anne Tanner、Bruce Paster、Heike Boisvert、Xuesong He 和 Batbileg Bor 提供有益的讨论以及细菌菌株。感谢 Susan Yost 和 Jessica Woods 在微生物实验技术方面的协助。本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国立牙科与颅面研究所，资助编号为 R37 DE016937（FED）、R01 DE024468（FED）和 T32 DE007327（AJC）。本研究内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Fisher ScientificBP160-100
AlphaimagerCell BiosciencesFluorChem HD2或具有等效功能的紫外凝胶成像系统
铝箔Fisher Scientific01-213-101
脑心浸出液肉汤（脱水粉末）Becton-Dickinson211059或其他适用于目标生物的培养基
70-Ti 离心转子Beckman Coulter337922
冻存管Fisher Scientific12-567-500
DMSOFisher ScientificBP231-100
电泳电源Bio-Rad1645052
电泳装置Bio-Rad1704467
滤膜镊子Millipore SigmaXX6200006P非必需，但有助于确保在操作过程中滤膜不被刺破
甘油Fisher ScientificG33-500
GoTaq Green MastermixPromegaM7122
Mastercycler Pro 温控循环仪Eppendorf950040025或具有等效功能的 PCR 温控循环仪
25 mM MgCl₂ 溶液PromegaA3513
分子生物学级水Fisher ScientificBP2819100
O₂ 控制 InVitro 手套箱Coy Laboratories031615如需培养微需氧生物时使用
Optima L-100 XP 高速离心机Beckman Coulter8043-30-1124
P-10 微量移液器GilsonF144802
P-1000 微量移液器GilsonF123601G
P-2 微量移液器GilsonF144801
P-20 微量移液器GilsonF123600
P-200 微量移液器GilsonF123602G
PBSFisher ScientificBP399500
PCR 管（0.2 mL）Fisher Scientific14-230-205
蛋白胨Fisher ScientificBP1420-500
移液器吸头 - 10 μLFisher Scientific02-717-157
移液器吸头 - 1000 μLFisher Scientific02-717-166
移液器吸头 - 20 μLFisher Scientific02-717-161
移液器吸头 - 200 μLFisher Scientific02-717-165
聚碳酸酯滤膜 - 47 mm，0.2 μm 孔径MilliporeGTTP04700
带螺帽的锥形离心管（15 mL）Falcon352096或其他适用于细菌培养的离心管
氯化钠Fisher ScientificBP358-1
Swin-Lok 滤器  - 47 mmWhatman4200400
SYBR Safe DNA 凝胶染料ThermoFisher ScientificS33102
注射器 - 20 mLFisher Scientific14-955-460
TAE 缓冲液（50×）浓缩液Fisher ScientificP1332500
厚壁聚碳酸酯离心管（25 × 89 mm，容量 26.3 mL），带盖Beckman Coulter355618
胰蛋白酶大豆血琼脂平板Northeast Laboratory ServicesP1100或其他足以支持宿主生物生长的琼脂平板
胰蛋白酶大豆肉汤（脱水粉末）Becton-Dickinson211825或其他适用于目标生物的培养基
乙烯基厌氧培养箱Coy Laboratories032714如需培养厌氧生物时使用
涡旋混合器Scientific IndustriesSI-0236
酵母提取物Fisher ScientificBP1422-500

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PCR

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