使用患者来源类器官的中通量药物与放射治疗筛选实验

摘要

我们详细描述了利用患者来源的类器官进行中等通量治疗敏感性筛选的实验方案。所测试的治疗方法包括化疗、放疗以及放化疗联合治疗。以三磷酸腺苷水平作为功能检测指标。

摘要

患者来源的类器官（PDO）模型能够实现原代上皮细胞在三维条件下、接近天然状态下的长期扩增与维持。当类器官来源于切除或活检获得的肿瘤组织时，可高度模拟 体内 肿瘤形态学，并可用于研究治疗反应 体外 肿瘤类器官生物样本库反映了临床肿瘤和患者的广泛多样性，因此在临床前和临床应用中具有巨大潜力。本文介绍了一种利用头颈部鳞状细胞癌和结直肠腺癌类器官进行中通量药物筛选的方法。该方法可轻松适用于任何来源于组织的类器官模型，包括正常和疾病状态的类器官。文中描述了以下方法 体外 类器官暴露于化疗和放疗（可单独或联合治疗）。药物暴露5天后，通过检测三磷酸腺苷（ATP）水平评估细胞存活率。药物敏感性通过半数抑制浓度（IC₅₀）、曲线下面积（AUC）和生长速率（GR）等指标。这些参数有助于判断类器官培养物对特定处理是否敏感或耐药。

引言

由成体干细胞建立并在三维（3D）细胞外基质（ECM）及特定生长因子混合物中培养的类器官模型（也称为HUB类器官），正日益成为临床前肿瘤学筛选的重要平台。患者来源的类器官（PDO）培养物可在1至2周内从正常或病变组织活检样本中建立，并可连续扩增至少1至2个月，甚至无限期传代。通过冷冻保存，可实现对特征明确的类器官培养物的长期使用。与传统二维、克隆来源的细胞系模型不同，PDO模型在表型和基因型上均能高度还原原始肿瘤组织，并保留肿瘤异质性。针对PDO进行的中通量药物筛选，可测试多种治疗方案，为个体化医学提供了独特的研究平台。

既往研究已描述了类器官模型在治疗筛选中的应用，特别是针对不同肿瘤类型建立的模型中进行药物和放射治疗的筛选，并展示了类器官在指导临床决策方面的预测潜力^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}。本文介绍了利用患者来源的类器官（PDOs）进行肿瘤治疗筛选的方法，具备中等通量的能力（图1A）。该方案采用384孔板格式并结合半自动化操作，可同时对最多8个类器官模型、16种化合物以及最多8块384孔板进行治疗测试。除了化合物药物筛选外，本文还介绍了检测放射治疗敏感性及增敏效应的方法。此外，还讨论了使用高通量机器人系统将药物筛选升级为全自动化操作的可行性。需要特别注意的是，来自不同组织的类器官可能需要不同的培养基和不同的操作条件。

本文描述了一种通用的药物筛选实验方案，该方案可能需要根据所研究的类器官类型进行适当调整。文中讨论部分包含了优化的起始条件和建议，以及有关实验设计和类器官操作的一般性推荐。示例采用头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）类器官和结直肠癌（CRC）类器官，前者通常具有致密的形态，后者则可能表现为囊状或致密形态。请注意，本方案不涉及原代类器官的建立与扩增培养方法；关于类器官的基本技术，读者可参考其他相关方案（例如，¹²）。本可视化方案将有助于理解利用类器官模型进行中通量药物筛选的完整流程。

方案

注意：在使用本方案之前，请确保遵守所在机构人类研究伦理委员会的指导原则。本方案中所述的患者组织和数据收集均遵循EUREC指南以及欧洲、国家和地方相关法律。所有类器官均来源于知情同意的患者，且患者可随时撤销同意。

1. 筛选前准备

1. 确认新建立模型的身份（例如通过组织学和/或DNA测序^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}）以排除正常细胞过度生长的可能性，并确保药物筛选在肿瘤类器官培养物上进行（参见示例 图 2D).
2. 设计实验板布局，参考讨论部分提供的通用建议（参见示例） 补充图 S1).
3. 计算所需类器官的数量，并在第0天准备好足够数量的待传代类器官（使用 表1 作为参考）。
   注意：根据类器官类型和模型的生长速率（GR），每个完整的384孔筛选板大约需要1-2个完整的6孔板。一般而言，一个6孔板的完整孔中含有约±20,000个囊状类器官或多达50,000个致密/葡萄状类器官。
4. 使用报告染料检测细胞分配器是否已校准，必要时根据制造商方案进行校准。

2. 试剂准备

1. 配制基础培养基：高级DMEM/F12+++（aDF+++）。向500 mL高级DMEM/F12培养基中分别加入5 mL 1× L-谷氨酰胺替代物（v/v）、1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和100 U/mL青霉素/链霉素。aDF+++可在4 °C保存最多1个月。
2. 根据所用类器官类型配制相应的类器官扩增（即，生长）培养基^9,10。
3. 配制筛选培养基，该培养基可能因实验设计不同而与扩增培养基有所差异。为促进类器官接种后的恢复，在筛选培养基中加入5 µM Rho激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632）。
4. 在aDF+++中配制100 mg/mL的中性蛋白酶II（Dispase II）溶液。
   ​注意：中性蛋白酶的100×溶液在-20 °C可稳定保存2个月。

3. 第0天：类器官的制备

注意：以下所示体积基于一个完全长满的6孔板类器官，相当于1200 µL类器官/细胞外基质（每孔200 µL类器官/细胞外基质）。

1. 使用明场显微镜检查类器官是否存在可能的污染、密度及总体形态；传代前对所有模型拍照以作参考。
2. 按照以下步骤进行类器官传代和接种。所有操作在室温下进行，以减少类器官的温度波动。处理类器官悬液时，使用低吸附枪头或预先润湿的移液器及塑料器皿，防止类器官损失。
   1. 当使用较大体积的细胞外基质/类器官（>1200 µL ECM）时，可考虑使用dispase消化ECM，以利于类器官从基质中释放。
      注意：dispase可分解细胞外基质，但不影响类器官本身。
      1. 可选：每孔加入1 mg/mL dispase，在37 °C培养箱中孵育30分钟，然后按常规方法进行传代。
         注意：由于培养基成分不能使dispase失活，需用aDF+++洗涤去除dispase，洗涤液体积至少为所加dispase体积的20倍。
   2. 将类器官收集至三个15 mL离心管中（每管最多400 µL ECM），用aDF+++补至12 mL，室温下85 × g离心5分钟。若类器官已充分沉淀，则吸除上清液；若沉淀不明显，则以更高转速（最高可达450 × g，具体取决于类器官类型和大小）继续离心5分钟。重悬沉淀后重复洗涤一次。
      注意：沉淀上方出现玻璃样层表明存在ECM。使用明场显微镜检查是否有类器官被困在ECM中（少量被困可接受），并用p1000移液器小心去除残留ECM。若ECM中存在（过多）类器官，应重复dispase解离步骤，或洗涤沉淀后以更高转速离心（最高450 × g）。
   3. 对每个15 mL离心管中的类器官沉淀，用1 mL aDF+++重悬，并小心解离类器官至合适大小。根据类器官类型和形态选择常规传代所用的解离方法（表1）。
      1. 对于囊状或葡萄状类器官，通过使用装有p2枪头的p1000移液器反复吹打，或使用火焰拉细并预先润湿的玻璃塞巴斯德移液管，机械剪切为小片段（<100 µm）。
         注意：每吹打5次后，使用明场显微镜确认类器官解离情况，目标是使类器官大小小于或处于筛网尺寸范围内（表1）。
      2. 对于致密型类器官，加入1 mL含50% v/v TrypLE的aDF+++溶液重悬细胞沉淀，在37 °C孵育至少2分钟。随后剧烈上下震荡试管并在明场显微镜下观察。采用与上述相同的方法，用移液器机械解离类器官，并在整个过程中持续在显微镜下检查。对于头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）类器官，使用100% TrypLE溶液孵育5分钟。
         注意：根据培养类型，目标应为获得小细胞团（例如，结直肠癌类器官，>20 µm）或单个细胞（例如，HNSCC类器官）。确保蛋白酶解孵育时间不超过15分钟，以免影响类器官活力。
   4. 用10 mL aDF+++洗涤类器官。85 × g离心5分钟；若类器官已充分沉淀，则吸除上清液。若类器官难以沉淀，可选择以最高450 × g离心5分钟。
   5. 以高密度将类器官接种于50%扩增培养基/50% ECM中（便于后续第4节中从ECM中轻松取出）。接种密度约为常规传代的两倍，通常相当于1:1传代（参见图1中的示例）。将类器官接种于预热的6孔板中，每滴10 µL（每孔共200 µL）。
      注意：为确保ECM快速凝固、防止扩散并形成适当的半球形穹顶结构，应将预热的培养板在37 °C培养箱中过夜，或在60 °C烘箱中至少放置1小时。
   6. 将培养板倒置，放回37 °C培养箱中孵育30分钟，使ECM凝固。30–60分钟后，轻柔地向各孔中加入扩增培养基（室温）。

4. 第2天（范围：第1-3天）：类器官分装

注意：根据类器官的生长速率（GR），该步骤也可能在第1天或第3天进行。在整个药物筛选过程中，类器官均保持在悬浮状态。为此，将类器官以低浓度细胞外基质（ECM，5–10%）进行分装，该浓度可维持类器官生长，同时避免ECM发生凝固。此方法有利于自动化分液、优化类器官与化合物的相互作用，并实现可重复的细胞裂解，但同时也限制了更换培养基的机会。

1. 计算药物筛选所需的类器官悬液浓度和用量。
   1. 根据所使用的细胞分配器，在计算时需考虑死体积。
      ​注意：每孔分配 40 µL 类器官悬液时，一块 384 孔板总共需要 15.4 mL。平均每根 Multidrop 细胞分配管的死体积约为 1 mL，使用全部喷嘴时死体积总计达 8 mL。因此，每个类器官模型在整块 384 孔板上的总体积需求为 23.4 mL。制备 25 mL 类器官悬液可确保有足够的类器官用于分配，以及可选的后续单核苷酸多态性（SNP）分析（见 4.4.7）。
2. 类器官采集前的准备
   1. 配制洗涤缓冲液时，将ROCK抑制剂（Y-27632）加入aDF+++中，使其终浓度为10 µM。（每株待筛选的类器官培养物约需±100 mL）。
   2. 使用明场显微镜检查所有孔中的类器官，以评估传代后的类器官恢复情况，并排除潜在污染。通过显微成像并利用数字比例尺测量类器官大小，判断其是否处于合适尺寸范围表1).
      注意：如果类器官大小不正确（过大或过小），在过滤过程中可能会丢失，导致药物筛选所需的材料不足。若出现此情况，建议推迟药物筛选。
   3. 向每孔中加入1 mg/mL dispase，在37 °C培养箱中孵育30–60分钟（最长不超过120分钟），以消化细胞外基质（ECM）。在显微镜下观察ECM解离的进展情况，检查ECM液滴是否已悬浮。若未悬浮，可用移液器反复吹打孔内液体以冲洗ECM液滴，当消化完成时，液滴应易于脱落。
3. 按照以下步骤准备类器官，以便分装至384孔板中。所有步骤均在室温下进行（包括离心），以减少类器官的温度波动。
   1. 使用 P1000 移液器从培养板中收集类器官悬液。
   2. 根据所需的过滤步骤（取决于类器官类型，参见 表1），请执行相应的步骤。
      注意：用洗涤缓冲液预润湿滤膜对于防止类器官黏附于滤膜上至关重要。
      1. 在包含所有小片段和单细胞时，进行单次过滤， 例如，用于头颈部鳞状细胞癌肿瘤类器官，筛选类器官 < 70 µm。将收获的类器官收集到15 mL离心管中，用12 mL洗涤缓冲液洗涤两次。将类器官通过预湿润的70 µm滤膜过滤至50 mL离心管中，用3 × 4 mL aDF+++洗涤滤膜，并将滤过物转移至15 mL离心管中。若体积过大，于85 × g 5分钟，将沉淀转移至含有12 mL aDF+++的15 mL离心管中；继续进行4.3.3步骤。
      2. 进行双层过滤以去除碎片和大型类器官， 例如，对于结直肠癌肿瘤类器官，过滤掉 >100 µm 和 <20 µm 类器官。立即将收获的类器官通过预先润湿的 100/70/40 µm 滤网过滤（表1) 转移至50 mL离心管中，用2 × 10 mL洗涤缓冲液冲洗滤膜。每处理6孔板中3个孔的类器官，使用一个预先润湿的20 µm滤膜。过滤 <100 µm类器官置于20 µm滤膜上，用2 × 10 mL洗涤缓冲液冲洗滤膜。将滤膜倒置在干净的50 mL离心管上，用3 × 4 mL aDF+++冲洗，从而从滤膜上回收类器官。将类器官悬液转移至15 mL离心管中；若体积过大 >15 mL（可能需要更多的滤器清洗），在85 × g 5 分钟后，将沉淀物转移至含有 12 mL aDF+++ 的 15 mL 离心管中。
         注意：滞留在滤膜上的类器官可回收用于后续传代培养；类器官 < 100 µm 的滤器用于下一步。穿过滤器的细胞和碎片将被弃去，滞留在滤器中的类器官（>20 µm, <100 µm）用于筛选。
   3. 450 × g 离心 g 孵育3分钟，小心吸除上清液。用1 mL筛选培养基重悬沉淀物，根据沉淀物大小再补充1-9 mL培养基（目标浓度约为每10 µL含75-150个类器官），使用预先润湿的血清移液管反复吹打混匀。
      注意：建议在筛选培养基中添加 5 µM 的 ROCK 抑制剂。
   4. 用预润湿的血清移液管将类器官悬液上下吹打5次，充分混匀，然后吸取10 µL悬液在培养皿中划线，于显微镜下计数类器官数量。对于较小的类器官（<70 µm），将10 µL类器官悬液加入带有血细胞计数板网格的10孔载玻片中，计数类器官数量。根据制造商说明书计算每毫升类器官数量。
   5. 通过将5%（v/v）ECM加入预冷的筛选培养基中，制备所需体积的分装培养基（例如对于25 mL分装培养基，将1.25 mL细胞外基质（ECM）加入23.75 mL预冷的筛选培养基中。仅将ECM加入预冷培养基中，以防止ECM凝固。当同时筛选多个类器官模型时，应批量配制分装培养基，以确保所有模型间ECM百分比的一致性。
   6. 加入所需数量的类器官（参见 表1 将上清液（参见注释中的指南和说明）转移至新的15 mL离心管中，在450 × g 孵育3分钟。小心吸除上清液，避免扰动沉淀物，并用p200移液器将沉淀物充分重悬于100 µL筛选培养基中。确保沉淀物均匀且完全重悬，无类器官团块。随后加入所需体积的冰冻分装培养基补足悬液，并自此将类器官悬液置于冰上保存。
4. 使用细胞分配器（例如 Multidrop）将类器官分装至384孔板中。
   1. 将细胞分配器设置为每孔分配 40 µL 细胞悬液。
      1. 主菜单 | 选择 板型 | OK | 384 标准 | OK
      2. 盒式类型 标准管式盒 （右侧）| 选择 体积 使用上下箭头（40 µL).
      3. 选择 满孔板 或 柱，取决于板的布局。
   2. 用70%乙醇（EtOH）冲洗管路，随后用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗；使用 >每次洗涤使用 15 mL 液体。每次洗涤之间保留少量空气，以便观察每次洗涤的开始和结束。检查所有分配头是否呈“直线” dispensing，若不符合则需重新洗涤。
   3. 在 设置 菜单，选择 预分配，并设置为 60 µL 在启动后、分装前，预先分配类器官悬液。
   4. 将类器官悬液置于冰上，同时用移液器对分配器进行预冲洗。使用1000 μL移液枪反复吹打，使悬液充分重悬。注意避免溶液中产生气泡。完成预冲洗并确认培养板已就位后，通过按压将类器官分配至孔板 开始.
      注意：此步骤由两人协作完成更为简便：一人负责重悬，另一人操作分配器。
   5. 如有需要，针对筛选中包含的每种类器官模型，在额外的筛选板中至少再分配5个孔。
      注意：这将允许当天晚些时候进行 T=0 读数（见第 7 节和讨论部分）。如果需要，也可手动完成此分液操作。
   6. 立即盖上平板盖子，以避免孔内污染。在显微镜下确认所有孔均已正确加样，并检查类器官是否在平板内均匀分布。
   7. 如果需要，在完成铺板后，从管路中回收类器官悬液（点击 空），离心收集剩余类器官。转移至1.5 mL离心管中，速冻保存，用于后续SNP分析。
      ​注意：如果在分配过程中空气进入管路，导致部分孔未正确填充，则需手动向每孔添加 40 µL 以补足。
   8. 若需分配多个类器官模型，每次更换模型前均须用 PBS、乙醇和 PBS 冲洗管路，并重复步骤 4.4.4–4.4.8。
   9. 将培养皿转移至5% CO₂培养箱中₂ 在37 °C培养箱中孵育，直至准备进行药物分配。为消除不同培养板之间空气交换的差异，请勿将培养板在培养箱中叠放。
   10. 尽快用 PBS 和乙醇清洁管路。通过系统通入空气，确保管路完全干燥。

5. 第2天（范围：第1至第3天）：使用药物分配器（e.g.，D300e）进行药物分配

注意：根据研究问题的不同，药物打印也可在接种后一天进行。

1. 设置药物分配器
   1. 启动分配器软件，通过选中Plate 1并点击铅笔工具打开板式编辑器，选择筛选实验所用的板型格式。
   2. 选择板类型，并设置每孔的额外体积（即板中已存在的液体（类器官悬浮液）体积）。对于384孔板格式，每孔使用40 µL。
   3. 在左侧栏中，使用+符号添加筛选实验中将使用的所有药物溶液。
   4. 通过点击铅笔工具编辑每种液体，修改药物名称、药物类别（例如，基于DMSO或水相（例如，水、PBS）），以及药物的储备浓度。
      注意：每种药物的储备浓度不得超过10 mM。理想情况下，溶剂的最高浓度应为DMSO不超过0.8%，PBS不超过3%或含0.3%去污剂（例如，Tween）（参见下文归一化说明及讨论部分）。
   5. 在程序中添加所有药物后，通过在板布局中选中一个孔并拖动来选择添加药物的孔位。右键单击所选孔，添加浓度。
      1. 设置每种药物所需浓度的数值（µM）。
      2. 对于梯度稀释，定义每种药物的最高和最低浓度（µM）、分布方式（对数或线性）、每个浓度水平的重复数（例如，3）以及滴定模式。
      3. 对于靶向滴定，定义每种药物的最高和最低浓度、分布方式（对数或线性）、目标浓度（µM）、目标区域（水平）、目标范围（对数）、每个水平的重复数（例如，3）以及滴定模式。
   6. 将所有药物孔归一化至相应的溶剂（例如，DMSO或含Tween-20的水相）。对于溶解于水相溶液中的药物，需加入Tween-20（药物储备液中终浓度为0.3%），以确保使用D300e进行分配时药物溶液具有适当的表面张力（见5.2.6节）。选中所有孔（包括无药物的阴性对照孔），右键单击，选择归一化，然后选择归一化。选择合适的溶剂，并选择归一化至最高类别体积，以使所有孔归一化至所选药物的最高浓度。
      注意：此时每个孔的左下角会出现黑色三角形，表示归一化已完成。每种药物溶剂应至少设置6个（理想情况下>9个）阴性对照孔。
   7. 选择至少3个孔（理想情况下>6个），加入已知的细胞毒性试剂（如staurosporine，1–5 µM）作为阳性对照，具体浓度根据培养条件而定。若阳性对照的细胞毒性浓度未知，可选择高浓度以确保阳性对照孔中所有类器官死亡。
      注意：也可使用Navitoclax（20 µM）以确保在药物筛选过程中类器官完全死亡。
   8. 完成板布局后，若仪器已开启，则点击左上角的运行按钮。保存协议以继续操作。
      注意：程序现已计算出每种药物分配所需的体积。该体积已包含移液误差，因此即为整个协议所需的确切药物量。可选：点击模拟可对整个协议进行模拟（不实际添加药物），以观察协议运行过程。在运行和模拟模式下，系统均会生成一份报告，记录每孔添加药物的时间、顺序和体积。该报告可用于确认协议正确性，并在实验开始前确定所需的确切体积及盒帽数量。
2. 准备并打印药物
   1. 向水相药物储备液（例如，水或PBS）中加入0.3%（v/v）Tween-20，以确保使用D300e分配时药物溶液具有适当的表面张力。确保Tween-20浓度不超过3% PBS/0.3% Tween-20（v/v），且Tween-20的终浓度低于0.01%。
      注意：仅在将药物加入药物打印盒前立即添加Tween-20，因为储备液中高浓度的Tween-20可能使基于蛋白质的药物（例如，抗体类药物）失活。DMSO溶解的药物无需此步骤；但需确保每孔中DMSO的终浓度不超过0.8–1%。
   2. 准备好D8+低容量和D4+高容量盒带。当使用大量归一化液体时，在程序中勾选使用高容量盒带选项。
   3. 运行协议以开始药物分配。
      注意：程序将逐步执行协议，并提示每种化合物的添加时机和体积。处理高浓度药物时应使用滤芯吸头。请按照生物安全指南妥善处理化学废液和使用过的吸头。
   4. 协议完成后，使用透气防蒸发粘性密封膜（例如，医用级聚氨酯板密封膜；材料表）覆盖板孔，并将板放回37 °C、5% CO₂培养箱中。
      注意：使用此类密封膜可防止"边缘效应"导致的蒸发（见讨论部分）。若不使用密封膜，则不应在药物筛选中使用板的外周孔。切勿将板叠放，并确保将板放置在培养箱后部，或使用不常开启的培养箱，以避免温度波动。
   5. 若需将放射治疗与打印药物联合使用，请进入第6节。否则，将板在培养箱中继续培养5天。
      ​注意：根据类器官类型和药物类型的不同，部分实验可能需要超过5天。对于持续时间>7天的实验，应在实验中途小心更换培养基和化合物（例如，更换50%培养基为新鲜筛选培养基），以避免阴性对照孔中出现大量细胞死亡。

6. 第2天（范围：第2-4天）：使用光子束辐射处理类器官

注意：以下步骤描述了类器官的照射过程。为了评估药物化合物的放射增敏效应，需在类器官暴露于化疗药物24小时后进行照射。若仅评估单独照射效应，则采用相同方案，即在类器官接种后24小时进行照射。具体操作可能需要根据研究假设和类器官培养条件进行一定优化。以下步骤描述了使用特定生成的6 MV光子束（材料表）照射类器官的操作流程。该设备专为临床应用优化，因此可反映真实的临床实践情况。不同设备可能需要不同的设置，且可能需要对剂量进行优化，因为其有效剂量可能与所选剂量存在差异。

1. 从37 °C培养箱中取出培养板，并将盖子放回每块板的密封膜上方；不要移除密封膜。在此过程中同时取回0 Gy的对照板，以确保对照组经历了完全相同的处理条件。
2. 将类器官转移至辐照仪。通过在塑料盒中加入温水，并固定好培养板支架，防止培养板漂浮，完成辐照装置的准备。
3. 将培养板浸入水中，使水位与培养板上表面齐平。使用不会让培养板漂浮的装置将其固定（如视频所示）。离开房间后，以递增剂量（例如，1、2、4、6、8和10 Gy）对培养板进行辐照。每次仅辐照一块板，因为堆叠的培养板会导致辐射分布不均。
   注意：应选择适当的辐照剂量，以获得剂量-效应曲线。
4. 辐照后用纸巾彻底擦干培养板表面，并换上硬质盖子。将培养板运回培养室。取下硬质盖子，用喷有少量乙醇的纸巾擦拭每块板的外表面。切勿移除透气密封膜。
5. 将培养板放置在培养箱后部，以避免因开关门引起的温度波动；切勿堆叠培养板。

7. 第2天。可选：CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测（CTG）测量板 T=0（GR分析必需）

1. 如果旨在计算 GR 指标（参见 11.3.5 节及讨论部分），请按照步骤 9.1–10.4 测定 T=0 平板中的 CTG 值。

8. 药物筛选读数前一日：准备工作

1. 计算所需CTG的总体积。对于384孔板，每孔使用40 µL CTG（根据制造商建议按1:1比例加入CTG）。需考虑多通道分液时的死体积（每管1 mL）。在4 °C避光条件下过夜解冻CTG。
2. 检测分液器是否需要校准。

9. 第7天（范围：第7至14天）：药物筛选检测：CTG检测

1. 将CTG恢复至室温。在读数前目视检查384孔板的所有孔，记录是否出现污染。
2. 在明场显微镜下对相关孔进行成像。包括阳性对照（staurosporine）、阴性对照（归一化孔）以及每种药物的最高浓度孔。
3. 按照第4.4节所述步骤清洗并预润多通道移液器。根据板布局向每孔加入40 µL CTG。使用多通道分液器的板式振荡器（振荡）振荡5分钟，并在室温下避光孵育25分钟。
   ​注意：CTG反应为酶促反应，因此受温度和孵育时间影响。信号理论上在30–60分钟内稳定；然而，为提高准确性，尤其是计算GR指标时，建议所有板采用相同的孵育时间。

10. CTG 生物发光检测

1. 开启具有 384 孔板容量的生物发光酶标仪及计算机。此处使用的是 Spark 酶标仪。
2. 打开 Spark 方法编辑软件（参见材料表）。选择板型：COS384fb-Corning 384 平底黑板 | 无盖 | 无湿度盒；选择需要检测的孔位。
3. 在左下角菜单中，选择 检测 | 发光，并将其拖至板位下方。类型：衰减，第二个菜单：无。设置积分时间 [ms]：500。
4. 放置酶标板，选择该板，然后点击开始运行方法。保存导出的电子表格。

11. 数据分析

1. 计算Z因子（Z'）以评估筛选质量。
   1. 计算阴性对照（Ctrl）的平均值（Av）和标准差（SD）^阴性, 例如，DMSO）和阳性（Ctrl^阳性, 例如，星形孢菌素（Staurosporine）对照。
   2. 计算Z因子 = 1 - (3 × SD[Ctnl^阴性] + 3 × SD[对照]^阳性]/mean[Ctrl^阴性] - 平均值[Ctrl^位置]).
      注意：Z' 值反映阳性与阴性对照组内及对照组间的比值差异，因此可作为检测方法动态范围的衡量指标¹³排除Z'值低于0.3的药物筛选结果；仅使用Z'值≥0.3的数据 > 建议 Z' 值为 0.5。平均 Z' 值通常在 0.5 至 0.7 之间（取决于所使用的类器官模型）。为了使 Z' 值具有信息意义，阳性对照孔中的所有类器官均应死亡。
2. 通过将对照组（Ctrl）设为基准，计算每个孔的类器官相对存活率^阴性 至100%并按Ctrl^位置 至0%存活率。
   1. 使用此公式计算类器官的存活率。
      ​类器官存活率 = 100% ×（实验孔数值 - 对照组平均值）^阳性) / (Av Ctrl^阴性 - 对照组^阳性)
      1. 对于经辐照的类器官，计算其百分比值。
         ​器官样体存活率（%）= 100% ×（实验孔 x Gy 值）/（对照组平均值）^阴性 0 Gy 的良好值
   2. 使用数据分析软件，将存活性数据复制到xy表格中，并为每个浓度选择适当数量的重复值，以可视化数据。
   3. 对于对数药物浓度，转换药物浓度，并将这些值复制到表格的第一列中。
   4. 格式化图表时，选择图表类型（XY），选择均值的标准误（SEM），并将原点设置在左下角。
3. 确定相对 IC₅₀曲线下面积（AUC）和GR指标。
   1. 对于非线性回归，在 分析 标签，选择 使用非线性回归拟合曲线. 选择该选项 抑制剂浓度对数值与归一化反应曲线 - 可变斜率 绘制杀灭曲线。
   2. 点击 结果 选项卡以显示相对 IC₅₀ 每种药物
      注意：此浓度指药物反应值处于曲线底部与顶部中间时的药物浓度。底部和顶部为 y 轴单位下的平台值。
   3. 曲线下面积（AUC），在 分析 标签，选择 曲线下面积，使用预设设置，并选择 好的.
   4. 点击 结果 按 Tab 键以显示每种药物的曲线下面积（总面积）。
      注意：AUC 是可测效应的积分度量，用作药物效应的累积测量指标。对于某些分子（如抗体），其剂量-反应曲线并非S形，因此IC₅₀ 数值难以解释。在这种情况下，AUC值可作为比较类器官系间差异的更有信息量的指标。
   5. 或者，如果在第2天进行CTG测量（可选步骤4.4.5和第7节），则计算GR指标。使用在线GR计算器分析GR指标¹⁴，考虑到类器官模型在药物筛选过程中增殖率的差异，以确保获得更可重复且更敏感的测量结果。

结果

本实验旨在研究头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）类器官对化疗和放疗单药治疗的敏感性。我们还通过间隔一周多次重复实验，以验证结果的可重复性，从而获得多个生物学重复（实验1-3）（图2）。根据实验方案，在第0天，从6孔板的6个孔中收获HNSCC患者来源的类器官（PDO），并通过酶消化和机械剪切将其解离为单细胞（或直径小于70 µm的小类器官< 70 µm），以1:2的传代比例重悬于80%（v/v）细胞外基质（ECM）中并重新接种。在第2天，使用dispase消化收获类器官，经滤网筛选保留直径小于70 µm的类器官< 70 µm，并使用试剂分配器的一根导管将其以每孔1000个类器官的密度接种至两排共七块384孔板中。其中一块板仅加入顺铂，作为未照射组（0 Gy）；其余六块板用于放疗处理（1–10 Gy）。

对于未照射的培养板，使用D300e数字分配器以三份重复的方式进行顺铂剂量梯度稀释，浓度范围为40至0.1 µM。由于顺铂可溶于水，归一化孔中加入含0.03% Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBS-Tween-20），...

讨论

本文及视频介绍了如何利用患者来源的类器官（PDOs）进行中通量药物筛选。经过优化，该方案可适用于本文所述组织类型以外的其他类器官模型的筛选。在筛选前确定理想的传代时间至关重要，因为不同类器官培养体系的最佳时间可能不同，并取决于组织类型。每孔接种的类器官密度和大小是需要优化的重要因素，生长较快的模型需要更大的孔内空间，而大小差异可能导致实验变异性增加。为确保仅有待测化合物影响类器官的存活率，必须保证未处理组（阴性对照）类器官在整个实验过程中不受到任何营养或环境剥夺。由于未处理组类器官的体积增长不受抑制，而处理组则可能受到抑制，因此该检测方法可同时评估治疗诱导的细胞死亡以及细胞增殖的抑制效应。利用该方法，可将化合物或治疗手段（如放射治疗）应用于类器官模型，以开展相关研究。 体外 以三维形式呈现的响应。

在本实验方案中，我们采用CTG检测法，该方法利用ATP水平作为细胞活力的替代指标。尽管该检测法在大多数情况下能够可靠地反映实验结束时活细胞的数量，但需要注意的是，该检测结果也可能受到细胞代谢剧烈变化的影响。此外，还有其他一些依赖于不同原理的细胞活力检测方法可供选择， <...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>所需设备
384孔生物发光酶标仪；例如 Tecan Spark 10M 酶标仪	Tecan
具有大视野镜头（2.5倍）的明场显微镜
数字分配器；例如 Tecan D300e	Tecan		药物分发
6 MV 光子束辐照器	Elekta 型号 Synergy，Elekta 瑞典
带大口径喷嘴的液体处理仪（“标准管”) 盒式载体；
例如，Multidrop Combi 试剂分配器	赛默飞世尔科技
用于放射治疗的带托盘架插件的塑料容器	自制
火花控制方法编辑器软件
标准组织培养设备（LAF 柜、培养箱、离心机、水浴锅等）
<强>所需材料
1.5 mL 塑料管
15 mL 和 50 mL 塑料管
5、10 和 25 mL 无菌塑料移液管
6孔细胞培养板
黑色384孔超低吸附透明底板；例如，Corning 384平底黑色	康宁	4588
Breathe-Easy 封膜	默克		预切割医用级聚氨酯膜，带丙烯酸粘合剂
Glasstic 载玻片			带血细胞计数板网格的10室载玻片
Multidrop Combi 试剂分配器标准管分配卡带	赛默飞世尔科技
堵塞的巴斯德吸管’火焰拉制的细口移液管
可逆 20/40/70/100 µm 过滤器：PluriStrainer	Pluriselect	例如：43-50020-03
无菌 P1000、P200、P20 和 P2 吸头，以及低吸附滤芯吸头（例如 Sapphire 吸头）	格雷纳	750266
T8 Plus 和 D4 Plus 胶囊	HP/Tecan
<强>所需试剂
100 x 谷氨酰胺			L-谷氨酰胺替代物
1 M HEPES
PBS 中稀释的 30% (v/v) 吐温-20
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	赛默飞世尔科技	12634-010
CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测	Promega	G9681
待筛选测试的化合物，包括星形孢菌素或其他阳性对照
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
用于结直肠癌的细胞外基质：生长因子减少型Matrigel，无酚	康宁	356231
头颈部鳞状细胞癌患者来源类器官的细胞外基质：BME、Cultrex RGF 基底膜提取物，R1 型	R&D Systems	3433-005-R1
类器官扩增培养基（针对每种类器官类型特异性配置）
类器官生长因子（针对每种类器官类型特异性）
PBS
青霉素/链霉素（100 U/mL）
ROCK抑制剂：Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
<强>所需软件包：
GraphPad Prism
Microsoft Excel