方法文章

通过流式细胞术分析人髓系U937细胞中SAMHD1的限制作用

DOI：

10.3791/62502

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2021年6月13日

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1Retrovirus-Host Interactions Laboratory, The Francis Crick Institute, 2Retroviral Replication Laboratory, The Francis Crick Institute, 3Sidney Sussex College, Department of Medicine, University of Cambridge

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种已建立的方法，用于测定细胞抑制蛋白SAMHD1对HIV-1的限制程度。将表达SAMHD1并同时表达YFP的慢病毒载体转导至人髓系U937细胞，诱导其分化后，用HIV-RFP进行感染。通过流式细胞术分析来确定限制水平。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

含 sterile α-基序/组氨酸-天冬氨酸结构域的蛋白 1（SAMHD1）可抑制静息髓系细胞中 HIV-1 的复制。U937 细胞由于 SAMHD1 RNA 表达水平较低，导致内源性蛋白表达无法检测，因此被广泛用作分析 SAMHD1 活性的便捷细胞体系。基于 Stoye 实验室开发的用于表征其他逆转录病毒限制因子的类似检测方法，Bishop 实验室建立了一种双色限制性检测法，用于在 U937 细胞中分析 SAMHD1。该方法利用表达 SAMHD1 的小鼠白血病病毒样颗粒，以及通过 IRES 表达的 YFP，对 U937 细胞进行转导。随后用佛波酯肉豆蔻酸酯处理细胞，诱导其分化为静息表型。分化完成后，用表达荧光报告基因的 HIV-1 病毒样颗粒感染细胞。48 小时后，收集细胞并进行流式细胞术分析。通过比较表达 SAMHD1 的细胞群体中 HIV 感染细胞的比例与内部对照（不表达 SAMHD1）细胞中的比例，可得出限制性比率。SAMHD1 的表达使 HIV 感染率降低五倍，对应限制性比率为 0.2。我们近期将 HIV 感染报告基因由原始的 GFP 替换为 RFP，进一步优化了流式细胞术的分析效果。

该实验已成功用于表征氨基酸替换对SAMHD1限制活性的影响，方法是使用编码经定点突变表达载体衍生的突变SAMHD1蛋白的病毒进行转导。例如，催化位点突变HD206-7AA的限制表型值为1，表明其限制活性丧失。同样，也可测定不同测试病毒的敏感性。本实验还可进一步改进，以纳入细胞分化状态、代谢状态以及SAMHD1调节因子的影响，从而更深入地理解SAMHD1、细胞代谢状态与病毒限制之间的关系。

引言

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含无菌α基序/组氨酸-天冬氨酸结构域蛋白1（SAMHD1）可抑制髓系谱系静息细胞中人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的复制。SAMHD1通过其作为脱氧核苷三磷酸三磷酸水解酶的酶活性，降低细胞内脱氧核苷三磷酸（dNTP）水平，从而阻断病毒复制。因此，HIV-1无法有效进行逆转录过程。自最初发现以来的几年中，该领域已取得显著进展，特别是在明确SAMHD1抗病毒活性中特定结构域和氨基酸残基的作用方面。这些研究进展得益于生化实验以及模拟生理相关静息髓系环境的细胞模型。U937细胞1被广泛用作研究SAMHD1活性的便捷髓系细胞模型，因其内源性SAMHD1表达缺失，推测是由于与表达SAMHD1的细胞相比其RNA水平较低（此为持续研究领域）。本文所述方案描述了利用共表达SAMHD1和黄色荧光蛋白（YFP）报告基因的类病毒颗粒对U937细胞进行瞬时转导，以研究SAMHD1对HIV-1复制的限制机制。此类用于研究逆转录病毒限制作用的瞬时双色流式细胞术检测方法最初由Stoye实验室建立2，并已被进一步应用于研究其他限制因子，包括三联基序（TRIM）蛋白3。受此启发，Bishop实验室开发了一种双色检测法，用于分析SAMHD1在U937细胞中的限制功能。

实验流程如图1所示。使用含有双顺反子mRNA的鼠白血病病毒（MLV）样颗粒转导U937细胞，该mRNA通过IRES共表达SAMHD1和黄色荧光蛋白（YFP）。随后用佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）处理细胞，诱导其分化为静息表型。接着用表达红色荧光蛋白（RFP）的HIV-1病毒样颗粒感染细胞。48小时后，收集细胞并进行双色流式细胞术分析。该检测方法也可使用YFP和绿色荧光蛋白（GFP），此时流式细胞术分析所需的常规滤光组合更少。采用HIV-RFP可实现更简便的补偿调节，因此该方法对流式细胞术操作经验较少的研究人员更为友好，且大多数流式细胞仪均可完成该实验。

分析过程中，比较同一孔细胞中表达SAMHD1的细胞与不表达SAMHD1的细胞中HIV感染细胞的比例。这种方法在单个孔/流式细胞术管中提供了内部对照，是本实验的关键特征。通过比较转导细胞与未转导细胞中的感染水平，可得出限制性比值。比值为1.0表明转导因子对感染性无影响。在本实验中，野生型SAMHD1的表达可使HIV感染水平降低五倍，对应的限制性比值为0.2。尽管与TRIM5等更经典的限制因子相比，该效应较为温和，但结果具有可重复性，且能够将经修饰的SAMHD1表达体分类为：与野生型蛋白具有相当限制能力的、无限制能力的，以及具有中间表型的三类。

该检测方法已成功用于通过转导编码突变型 SAMHD1 序列的病毒，来表征 SAMHD1 结构域及氨基酸突变体的限制表型。例如，在此检测中，催化位点取代突变 HD206-7AA 无法发挥限制作用。同样，也可确定不同测试病毒的敏感性。例如，HIV-1 逆转录酶突变体对 SAMHD1 介导的限制作用更为敏感（如 151V4）。本方案详细说明了病毒样颗粒（VLP）的制备、用 SAMHD1 表达载体转导 U937 细胞、感染携带荧光报告基因的 HIV 以及随后通过流式细胞术进行分析的步骤。本文讨论了预期获得的数据类型以及如何避免结果不理想的情况。最后，本文还概述了该检测的其他应用，除了研究不同的 SAMHD1 变异体外，还可更深入地理解 SAMHD1、dNTP 水平与病毒感染之间的相互作用。鉴于 SAMHD1 在细胞代谢中的核心作用及其与癌症的额外关联，该领域仍具有高度研究价值。

方案

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本方案不涉及任何作者所进行的动物或人类参与者研究。本方案的所有步骤均按照实施机构的指南和操作规范进行。

1. 用于VLP生产的293T细胞转染（包括SAMHD1表达载体和测试用HIV颗粒）

注意：病毒颗粒成功制备的最关键因素包括生产用293T细胞的健康状态、转染时的融合度以及收获时间。各实验室通常有其偏好的逆转录病毒颗粒制备转染试剂和操作方案。以下方案可获得高质量的感染性病毒颗粒，但其他等效方案也适用于本应用。为维持293T细胞的良好质量，应至少每周传代三次，以保持恒定的生长速率。为实现高效转染，细胞应在对数生长期进行接种。

  1. 第1天：将接近汇合的293T细胞培养皿按1/4比例传代，接种至所需数量的10 cm培养皿中，使次日细胞汇合度约为60%（约5 × 105 个细胞/mL）。当使用新的细胞株时，可能需要接种多个不同密度的培养皿，以确保次日转染时达到合适的细胞密度。
  2. 第2天（上午）：通过显微镜检查确认细胞汇合度约为60%，并轻轻将培养基更换为10 mL新鲜的DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）。
  3. 第2天（下午，换液后至少4小时）：进行VLP生产转染。
    1. 在600 µL无血清DMEM中配制DNA稀释液，其中包含gag-pol表达质粒、长末端重复序列（LTR）驱动的报告基因质粒以及水疱性口炎病毒G蛋白（VSV-G）表达质粒各3 µg（总计9 µg，见注释）。涡旋混匀后短暂离心（15秒，>500 × g）。
    2. 加入20 µL转染试剂（参见材料表），涡旋混匀（勿离心），于20 °C孵育15–20分钟。将转染混合物逐滴加入培养皿中，轻轻摇晃混匀，然后放回培养箱中孵育。
      注释：对于表达SAMHD1的MLV VLP，使用KB45,6（gag-pol表达质粒）、pLGatewaySAMHD1IeYFP1（LTR驱动的报告基因质粒）和pczVSV-G7；对于HIV-RFP VLP，使用p8.918,9（gag-pol表达质粒）、SCRPSY10（LTR驱动的报告基因质粒）和pczVSV-G。其他可选方案见材料表。不同质粒/转染系统可能需要优化质粒比例。
  4. 第3天（接近中午）：小心用移液器吸除细胞培养基，用5 mL新鲜DMEM洗涤一次，再更换为5 mL新鲜DMEM。
  5. 第4天（上午）：收集细胞上清液以收获病毒，并更换为5 mL新鲜DMEM。将含有VLP的上清液通过0.45 nm滤器过滤，分装后转移至-70 °C保存。确保分装体积适合后续实验（建议250 µL），避免反复冻融导致病毒滴度下降。
  6. 第5天（上午）：按步骤1.5的方法收获病毒，但在收集上清液后弃去培养皿。

2. 使用前对新型病毒样颗粒进行滴定

  1. 第1天：将293T细胞以每孔2 × 105个细胞的密度接种于24孔板中，每种待滴定病毒接种4孔，包括每种骨架对应的已知感染活性的病毒作为对照。根据特定细胞库存优化接种密度。
  2. 第2天：观察细胞板以检查汇合度（理想情况下约为70%）。解冻步骤1.5和1.6中含病毒的上清液。向每孔分别加入0、10、25或100 µL病毒上清。
  3. 第4天（上午）：收集细胞用于流式细胞术分析。
    1. 通过小心移液或抽吸去除培养基。用250 µL磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞。用250 µL PBS反复吹打使细胞脱离培养板，并转移至微量离心管中。加入250 µL 4%多聚甲醛（终浓度为2%）。
      警告：多聚甲醛具有毒性，不得与含氯消毒剂混合使用。
    2. 在500 × g条件下离心5分钟使细胞沉淀，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL PBS或其他流式细胞术缓冲液中。根据需要通过流式细胞术检测RFP或YFP表达。将待测病毒库存的感染活性相对于已知感染活性的病毒库存进行归一化处理。
      ​注意：病毒样颗粒（VLP）也可通过p24酶联免疫吸附试验（ELISA）进行归一化；然而，这并不一定能够准确反映VLP的感染活性，尤其是在不同转染条件下制备的VLP库存之间比较时。已发表的半数组织培养感染剂量或感染复数（TCID50/MOI）方法11也可提供相对定量结果，但这些方法在MLV中尚未得到充分验证。相对荧光强度可作为商业逆转录酶ELISA方法的一种经济有效的替代方案。

3. 用表达 SAMHD1 和 YFP 的病毒样颗粒转导 U937 细胞

注意：步骤 3 至 6 构成限制性实验。天数编号便于规划。

  1. 第1天（下午）：解冻用于转导的病毒样颗粒（VLP），包括MLV-野生型SAMHD1-YFP（阳性对照）、MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP（阴性对照）以及变异型MLV-SAMHD1-YFP（实验样本）。在微量离心管中，用RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640）将标准化后的VLP稀释至终体积500 µL，加入0.5 µL聚凝胺（10 mg/mL），并通过轻弹混匀。
    1. 若无法预先滴定VLP，则初次使用100 µL。VLP与RPMI的最大比例为1:1，以限制VLP引起的细胞毒性。目标转导效率约为30%。
  2. 将每种转导条件所需的5 × 105个U937细胞分装至无菌微量离心管中，于500 × g离心5分钟形成细胞沉淀，弃去上清液（另设两管未转导样本作为流式细胞术的对照）。将细胞沉淀重悬于500 µL稀释后的VLP中（未转导对照使用RPMI），转移至24孔板中的一个孔。
  3. 在台式离心机中于20 °C、800 × g条件下离心接种90分钟。向孔中加入1 mL 37 °C预热的RPMI培养基，置于37 °C培养箱中恢复培养3天。

4. 转导U937细胞的分化

  1. 第4天（上午）：轻轻吹打重悬细胞，将350 µL转移至每个 12孔板中的4个孔，每孔加入700 µL含150 nM PMA的37 °C RPMI培养基，使PMA终浓度为100 nM，置于37 °C孵育箱中诱导分化3天。
    ​注意：PMA 以粉末形式购买，应用 DMSO 重悬至 1 mM，并避光保存。工作液浓度为 100 µM，可通过将 1 mM 储存液用 DMSO 1:10 稀释制备。

5. 用 HIV-RFP 感染已分化的、表达 SAMHD1 的 U937 细胞

  1. 第7天：在显微镜下观察细胞，确保细胞已贴壁。吸去所有孔中的培养基，向每组4个孔中的第1孔加入1 mL RPMI，作为未转导、未感染的对照以及单色对照。向其余各孔中重新加入0.5 mL RPMI，其中含有约10 µL的HIV-1-RFP（以p24约10 ng为参考）。感染率应控制在约50%。
  2. 第8天（上午）：向每个感染孔中加入0.5 mL RPMI。

6. 流式细胞术分析

注意：在流式细胞术流程中加入活死染色是良好的实验实践。然而，如果U937细胞状态良好，则可以省略此步骤，而不会对后续分析产生不利影响。对经胰酶消化的细胞进行轻柔吹打，应能轻松获得单细胞悬液。

  1. 第10天（上午）：吸除孔板中的培养基，用PBS洗涤一次。每孔加入300 µL细胞解离酶（或胰蛋白酶），孵育5–10分钟。再加入300 µL PBS，充分重悬细胞，确保所有细胞脱离培养板，然后转移至流式细胞分析管中。
  2. 加入300 µL 4%多聚甲醛（终浓度为2%）。在500 × g 条件下离心5分钟以收集细胞，弃上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL PBS或替代的流式细胞分析缓冲液中。进行流式细胞分析。
    ​注意：以下步骤适用于Fortessa分析仪，但使用任何能够检测RFP和YFP荧光的分析仪均可实现等效分析。在进行流式细胞分析前，请咨询本地流式细胞技术支持人员或其他有经验的研究人员。当需要同时筛选大量样本时，可考虑使用高通量进样器。此时建议使用较多的细胞数量和较大体积。

7. 流式细胞术分析

  1. 打开细胞仪，提前10分钟开机，并启动计算机。检查废液桶是否已清空，鞘液罐是否已加满。
  2. 登录设备并打开分析软件。
  3. 将手臂移至侧面，取下水管，调节流速至 高 并按压 启动等待指示灯熄灭后，重复此操作三次。
  4. 将水重新加入，调至高火加热3分钟，然后切换至 低 并按压 待机 在进行采集之前。
  5. 同时在软件中设置实验：
    1. 选择 实验 / 新实验 （根据当地指导原则命名）。在检测器中删除不需要的荧光染料，保留蓝色激光530/30和黄色激光610/20，或根据仪器推荐的用于YFP和RFP的激光与滤光片组合。
    2. 右键单击实验并选择 细胞仪设置/应用设置/创建工作表在工作表中，通过点击相应图标并点击坐标轴标签以更改坐标轴，创建前向散射面积（FSC-A）/侧向散射面积（SSC-A）散点图、YFP直方图、RFP直方图以及GFP/YFP散点图。
    3. 再次右键单击 实验 并添加 新样本根据需要重命名。点击加号以打开样本，显示新的试管。
  6. 从采集仪表板打开 查看，加载未感染、未转导的对照样本并按下 获取调整仪表板中的FSC和SSC电压，使细胞位于左下象限（轴上无细胞），并对该细胞群设门 P1右键单击其他图谱并选择显示 P1，以从后续分析中去除碎片。
  7. 加载YFP单色对照（仅野生型SAMHD1），并进行采集。在控制面板中调整YFP电压，使荧光最强的细胞位于检测器的检测范围内（不在坐标轴边缘）。对RFP单色对照重复相同操作。
  8. 使用未转导、未感染及单色对照样本运行自动补偿。
    1. 选择 实验 > 补偿设置 > 创建补偿对照 从菜单中切换至正常工作表。选择未染色正常工作表，按下 运行 并获取未染色对照样本。
    2. 在完整细胞（P1）周围圈选门控并记录。取出试管，将机器调至 待机. 右键单击 P1，点击 应用于所有补偿对照.
    3. 切换到RFP normal工作表，然后按 运行记录单色RFP对照，并启动仪器 待机。 软件应当 自动选择阳性群体。
    4. 对YFP单色对照重复上述操作。选择 实验 > 补偿设置 > 计算补偿 > 链接与保存.
  9. 切换到全局工作表。获取转导了野生型 SAMHD1 并感染了 HIV-RFP 的细胞，检查在 YFP 和 RFP 对应的垂直和水平象限的四个角上是否可见四个不同的细胞群。移除试管并按下 待机.
  10. 重新加载未转导、未感染的样本，按下 运行 和 记录 以 P1 作为停止门控，采集 30,000 个事件。对剩余样品（包括其他对照）重复此操作。在运行过程中或 事后检验导出后，文件无法重命名。
  11. 将数据导出为 .fcs 文件，并根据本地操作说明清洗流路系统。

8. 数据分析

注意：以下步骤对应于 FlowJo v10 中的分析；然而，其他分析软件中也可轻松执行相应的操作。

  1. 打开软件，将所有 .fcs 文件拖入仪表板。选择补偿对照样本，并将其拖入补偿子文件夹中。通过双击打开未转导且未感染的样本文件，以显示 FSC-A/SSC-A 图。
  2. 选择多边形工具，在完整细胞群上设门，排除左下角的碎片。将此门命名为“Cells”。将该门拖动到 所有样本 工具栏中的所有样本上。使用水平箭头按钮逐个浏览每个样本，确保每个样本的设门均合适。
  3. 双击未转导且未感染样本的 Cells 群体，并将坐标轴调整为 FSC-Height (H) 与 FSC-Area (A)。使用矩形门选中单个较大的细胞群，以排除双联体。软件将自动建议将此群命名为 Single Cells。
  4. 将此门拖动至所有 Cells 群体，并再次检查所有样本的设门是否合适。选择未感染且未转导样本的 Single Cells 群体，将坐标轴更改为补偿后的蓝色激光（y，YFP）与补偿后的黄色激光（x，RFP）。在坐标轴上按 T 键，并为 x 和 y 轴选择 双指数 刻度。
  5. 选择 象限设门工具，点击阴性细胞群右上角的极端位置。通过将该设门拖入 所有样本 工具栏，将此初步设门应用于所有 Single Cell 群体。若象限门未能满意地分离各群体，可使用多边形工具对各个象限单独设门，如 图2 所示。
  6. 滚动至仅表达野生型 SAMHD1 的样本（仅 YFP），检查未转导（YFP 阴性）与 YFP 阳性细胞之间的设门是否正确。切换至等高线图视图有助于区分阴性细胞与微弱 YFP 阳性细胞。若最上方的 YFP 阳性细胞分布过宽，可将上方垂直门向右调整。
  7. 逐个浏览所有样本，检查 YFP 阳性状态下的设门情况。采用适用于所有样本的最佳 YFP 阴性与阳性分界方式。
    注意：补偿值是基于野生型 SAMHD1 的 YFP 表达水平计算得出的。若不同 SAMHD1-YFP 转导细胞间的感染水平差异较大，则可能需要调整补偿参数。因此，建议在使用前对 YFP VLP 进行标准化处理。
  8. 滚动至未转导但感染 HIV-RFP 的样本管，检查未感染（RFP 阴性）与感染（RFP 阳性）细胞之间的设门是否正确。根据需要进行调整，必要时可使用等高线图视图，并浏览其余样本，确认设门适用于所有样本。
  9. 每个样本均需包含双阴性细胞（Q4：左下，未转导且未感染）、YFP 阳性细胞（Q1：左上，表达 SAMHD1 且未感染）、RFP 阳性细胞（Q3：右下，未转导但感染 HIV）以及双阳性细胞（Q2：右上，表达 SAMHD1 且感染 HIV）。点击图标打开表格编辑器，将四个象限门拖入仪表板。选择 Excel 导出，然后点击 创建表格。根据本地文件命名规范保存生成的电子表格。
  10. 如需导出图谱及设门策略的图像表示，点击 布局编辑器 图标。选择每个群体，并按所需坐标轴、标签和间距拖入编辑器中。
  11. 若要创建一个在所有样本中显示相同图谱的布局，选择一列后点击 批量。点击 缩放至宽度，然后点击 避免分页。按需保存为相应文件格式。
  12. 在导出的电子表格中，通过生成以下列来计算限制比率：YFP 阴性细胞中的 RFP 百分比（RFP+ /（双阴性 + RFP+））和 YFP 阳性细胞中的 RFP 百分比（双阳性 /（双阳性 + YFP+）），最后计算一列（%RFP of YFP+ve / %RFP of YFP-ve），见 图1。对每种 SAMHD1 构建体的重复数据取平均值，并使用适当的数据分析软件，判断测试的 SAMHD1 变体的限制值是否与野生型和/或 206-7AA 存在显著差异。

结果

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上述分析的结果应显示，野生型 SAMHD1 阳性对照的限制比率为 0.25 或更低，阴性对照则为 1.0。如果这两个质量控制检查均有效，则需考虑结果的统计学显著性。与野生型相比无显著差异的 SAMHD1 变体，其氨基酸替换在此背景下不影响 SAMHD1 的限制功能；而与野生型有显著差异的变体则表现出限制功能受损。如果这些变体与阴性对照相比无显著差异，则表明其在此背景下丧失了限制能力（图 4 左侧图示）。

如果野生型 SAMHD1 限制值大于 0.3，则测试病毒的结果可能具有提示性，但不可靠。野生型蛋白限制效果不佳，可能是由于在细胞重建后恢复时间过短（2 周内）即使用 U937 细胞，或细胞使用时间过长（>2–3 个月）所致。这些参数可能需要针对特定细胞批次进行经验性确定。通常情况下，传代次数越低，细胞分化越可靠，从而为 SAMHD1 限制提供合适的环境。SAMHD1-YFP 或 HIV-RFP 感染水平不当，也可能导致补偿以及后续限制比率测定困难。如 图 4 右侧面板所示。

如果阴性对照偏离1.0（超出0.9–1.2范围），可能表明分析存在问题，例如感染细胞比例、设门策略或细胞状态正在影响实验结果。请参阅上述“注意事项”。

VLP 生产流程；用于 HIV-RFP 分析的流式细胞术；实验与数据结果。
图 1：实验方案示意图。 VLP，病毒样颗粒；PMA，佛波酯（phorbol myristate acetate）。编号步骤对应方案中的相应阶段。本图使用 BioRender.com 制作。 请点击此处查看此图的放大版本。

包装载体、转移载体、包膜表达载体示意图；基因转移方法；CMV、MLV、HIV。
图2：逆转录病毒质粒示意图。（A）包装载体（B）转移载体（C）VSV-G 包膜表达载体。图中显示了关键的编码和调控元件。详细信息请参见材料表。CMV IE：巨细胞病毒即刻早期启动子，BGH：牛生长激素，pA：多聚腺苷酸化信号，RRE：Rev 反应元件，CMV-LTR：嵌合型 CMV-HIV-1 LTR 启动子，Psi：HIV-1 包装信号，cPPT/CTS：中心多聚嘌呤区/中心终止序列，SV40：猴空泡病毒40。本图使用 BioRender.com 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

流式细胞术图解及荧光补偿分析；YFP、RFP通道，活细胞设门。
图 3：流式细胞术分析的设门策略。（A）补偿对照：左图显示未转导、未感染对照样本在FSC-A/SSC-A上的设门，用于完整细胞分析。中图和右图分别为YFP（中）和RFP（右）单色补偿对照的截图，其中黑色为未补偿数据，蓝色为补偿后数据。（B）上述补偿对照对应的补偿矩阵及补偿图。（C）设门策略。首先通过FSC-A/SSC-A分析所有细胞以排除碎片（左图）；然后通过FSC高度（height）与面积（area）的散点图排除双联体（doublets）（中图）；右图展示野生型SAMHD1抑制HIV-1的一个示例。坐标轴显示经补偿的蓝色和黄色激光荧光信号，分别对应YFP（SAMHD1）和RFP（HIV）阳性细胞。象限门根据RFP和YFP的阴性对照及单色对照比较后设定。数值表示相对于父代群体的百分比。YFP与GFP之间的补偿值会更高，但使用合适的滤光片组仍可有效区分。请点击此处查看该图的高清版本。

HIV感染与限制水平的流式细胞术分析；包括散点图和柱状图。
图4：预期结果：理想数据与次优数据的比较。（A）代表性YFP/RFP图示，左侧为理想数据，右侧为次优数据。数字表示亲代群体的百分比。在右侧图中，HIV感染水平过低，导致补偿和设门困难。限制比高于预期值0.5。（B）使用统计软件生成的SAMHD1各突变体相对于野生型（WT，红色）或阴性对照（HD206-7AA，黑色）的限制比图。每个点代表一个重复值，显示均值和标准差。所有组间均进行配对t检验，显著性差异见图示，除非特别标明。左侧：理想数据——野生型显示约0.2的预期限制水平，阴性对照显示1.0。突变体R372D（灰色）与野生型相比差异显著，但与阴性对照无显著差异，表明其丧失了限制能力。右侧：次优数据。此处阴性对照表现符合预期，但在全部六个重复中，由于感染率较低，野生型的限制比仅为0.5。组内变异度低，使得R143H呈现介于两者之间的表型，且与野生型和阴性对照均有统计学差异，而G209S则无限制能力；然而，由于阳性对照未达到预期的限制比，应使用新鲜细胞重复实验。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

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如上文注释所述，本实验方案的关键在于维持细胞产生病毒样颗粒（VLP）所需的正确细胞表型，并建立适当的环境以观察 SAMHD1 的限制作用。首先，通过双色流式细胞术对限制作用进行准确分析，依赖于获得适当比例的转导细胞和感染细胞，以确保图中每个区域都有足够数量的细胞用于分析。因此，研究人员应将感染复数（MOI）控制在 1 以下（参见实验方案）。转导和感染效率过高或过低都会因未感染细胞或双重感染细胞数量不足而影响分析结果。同样，待比较的 SAMHD1 载体需保持相似的转导率，这是确保整个实验可使用相同的补偿矩阵和设门策略的关键，从而提高后续分析的可靠性。

其次，所用U937细胞的培养时间是影响其能否成功分化的一个关键因素。可通过观察细胞贴壁情况、分化后培养基酸化程度随时间降低，以及检测中野生型阳性对照表现出充分的抑制效果，来监测分化是否成功。最长不超过5天的分化是可行的。

该检测方法的一个关键优势在于其灵活性。通过简单的定点诱变或克隆技术，可在载体中测试多种修饰形式的 SAMHD1（结构域、氨基酸、物种序列）。同样，也可探索测试病毒的不同变异体。此前该检测已被用于证明：dNTP 结合能力降低的 HIV-1 逆转录酶突变体对 SAMHD1 的限制作用更为敏感。相同的原理也可用于检测 SAMHD1 对其他病毒的限制作用。此外，通过改变细胞分化条件或人工调控细胞内 dNTP 浓度，可进一步探究细胞内环境与 SAMHD1 活性之间的相互作用，这也是 Bishop 实验室当前活跃的研究方向。SAMHD1 与多种核苷类逆转录酶抑制剂之间的相互作用已有报道，且通过改进该检测方法用于原代细胞后，已成功展示了 SAMHD1 的作用效果12,13,14,15。

将该方案改进后用于原代细胞，可克服在转化细胞中研究代谢表型所存在的局限性。然而，现有方案具有操作便捷、技术难度低的优势，适用于高通量分析，尤其在使用配备高通量进样器的流式细胞仪时更为高效。在对方案进行改进时，应考虑内部未转导的细胞对旁观者效应（例如免疫信号传导）的敏感性。

与细胞生物学的许多方面一样，必须将此类检测方法作为整体性研究策略的一部分，以全面理解特定现象。同时采用针对SAMHD1活性的生化检测方法16、细胞内dNTP池的定量分析，以及对人类、离体（ex vivo）和动物模型中SAMHD1突变体表型的观察（全球多个实验室正在开展此类研究，本期部分内容有所描述），对于深入理解这一复杂蛋白至关重要。

披露

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为了开放获取的目的，作者已对由此投稿产生的任何作者接受稿件版本应用了CC BY公共版权许可。文中观点仅为作者（们）的观点，不一定代表英国国家健康研究所（NIHR）或英国卫生与社会 care 部的观点。

致谢

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本工作由弗朗西斯·克里克研究所（Francis Crick Institute）资助，该研究所的核心资金来自英国癌症研究署（Cancer Research UK，资助号 FC001042 和 FC001162）、英国医学研究理事会（UK Medical Research Council，资助号 FC001042 和 FC001162）以及惠康基金会（Wellcome Trust，资助号 FC001042 和 FC001162），此外还获得惠康基金会授予 JPS 的研究员奖（108012/Z/15/Z）。剑桥大学的研究工作由英国国家健康研究所剑桥生物医学研究中心（NIHR Cambridge Biomedical Research Centre）、伊芙琳信托基金（The Evelyn Trust，项目号 16/21）、罗塞特里斯特信托基金（The Rosetrees Trust，项目号 M590）以及英国医学研究理事会（MR/S009752/1）共同资助。后者所获英国资助属于欧洲联盟支持的 EDCTP2 计划的一部分。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293T 细胞ATCCCRL-3216
0.45 µm 注射器滤器SartoriusFCT122
10 cm 培养皿Corning430167病毒制备可通过在更大容量的培养板或培养瓶中进行转染而扩大规模——请参见转染试剂使用指南
12 孔板Greiner665180
24 孔板Greiner662160
BD LSRFortessa 细胞分析仪BD Bioscience649225只要能够检测 RFP 和 YFP 荧光，其他分析仪也可使用
DMEMSigmaD6429ATCC 建议使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），其成分为含 4 mM L-谷氨酰胺、4500 mg/L 葡萄糖、1 mM 丙酮酸钠和 1500 mg/L 碳酸氢钠。 
DMSOFisherBP-231-100
胎牛血清Gibco10500064
FlowjoBD Bioscience-可使用其他分析软件
光学显微镜--任何明场光学显微镜均可
p8.91--HIV GagPol 表达质粒（PMID: 8602510）
多聚甲醛（4% PBS 溶液）Alfa AesarJ61889
PBSSigmaD8537
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）ThermoFisher15140122
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）SigmaP8139
聚凝胺SigmaTR-1003
pKB4--小鼠白血病病毒 GagPol 表达质粒（PMID: 23035841）
pLGatewaySAMHD1eYFP--编码野生型人源序列的 MLV 包装质粒。详细信息及克隆方法见 Arnold 等 2015（参考文献 1）。
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY
FP		--同上，编码关键活性位点残基的氨基酸替换
PrismGraphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 其他数据可视化软件也可适用
pVSV-G--VSV-G 表达质粒（https://www.addgene.org/138479/），替代选择：pMD2.G（https://www.addgene.org/12259/）
RPMIThermoFisher21875034
螺口管StarLabE1415-2231
SCRPSY--编码 RFP 的 HIV 包装质粒，Sam Wilson，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
10 mL 移液管Corning10084450
5 mL 移液管Corning10420201
TrypLE ExpressGibco12604021胰蛋白酶同样适用
TurbofectThermoFisherR0531其他转染试剂也可有效使用
U937 细胞ATCCCRL-1593.2

参考文献

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  1. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  2. Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
  3. Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
  4. Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194(2015).
  5. Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10(2010).
  6. Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
  7. Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
  8. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  9. Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
  10. Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
  11. Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
  12. Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824(2017).
  13. Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
  14. Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
  15. Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
  16. Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).

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HIV YFP RFP

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