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评估初级纤毛的人工智能方法

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DOI：

10.3791/62521

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2021年5月1日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 2Nikon Instruments Inc., 3Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University, 4Center for Diabetes and Metabolic Diseases, Indiana University School of Medicine

本文内容

摘要

与常用方法相比，利用人工智能（Ai）分析图像正成为一种更强大、更少偏倚且更快速的方法。本文中，我们训练人工智能识别一种细胞器——初级纤毛，并以严谨且可重复的方式分析其长度和染色强度等特性。

摘要

纤毛是基于微管的细胞附属结构，在多种哺乳动物细胞类型中作为多种信号通路的信号中心发挥作用。纤毛长度高度保守，受到严格调控，并在不同细胞类型和组织之间存在差异，且已被证实可直接影响其信号传导能力。例如，研究显示纤毛在纤毛G蛋白偶联受体被激活后会改变其长度。然而，准确且可重复地测量大量纤毛的长度是一项耗时且劳动密集的过程。现有方法也容易产生误差和偏差。人工智能（Ai）程序因其具备整合、处理和优化大规模数据集的能力，可用于克服上述诸多挑战。本文中，我们证明了Ai模块可被训练用于识别来自以下图像中的纤毛 体内 和 体外 样本。在利用训练好的人工智能识别纤毛后，我们能够设计并快速应用相关程序，对单个样本中的数百根纤毛进行长度、荧光强度和共定位分析。这种无偏倚的方法在比较来自不同原代神经元制备的样本时，显著提高了结果的可信度与严谨性。 体外 以及在同一动物不同脑区之间和不同个体之间。此外，该技术可用于以高通量方式对多种样本和处理组中任意细胞类型和组织的纤毛动态进行可靠分析。最终，随着各领域逐渐转向更少偏倚、更高可重复性的图像采集与分析方法，基于人工智能的方法有望成为标准。

引言

初级纤毛是突出于大多数哺乳动物细胞类型的感官细胞器1,2,3,4。它们通常是单一的附属结构，通过整合细胞外信号，在协调多种细胞信号通路中发挥关键作用5,6,7。初级纤毛在胚胎发育和成体组织稳态中具有重要功能，其功能或形态的异常与多种遗传性疾病相关，这些疾病统称为纤毛病8,9,10,11,12。在纤毛病的动物模型中，纤毛结构或信号传导能力的丧失会表现出多种临床上相关的表型，包括与多食相关的肥胖3,13,14,15。在许多模型系统中，纤毛长度的变化已被证明会影响其信号传导能力和功能16,17,18,19。然而，准确且可重复地评估纤毛长度和组成仍存在诸多耗时且技术上的挑战。

成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）是研究纤毛形态与功能时面临挑战的生物学环境之一。尽管已有证据表明中枢神经系统中的神经元及其他细胞均具有纤毛，但由于观察和分析这些纤毛的工具和手段有限，其功能至今仍不明确20。例如，典型的纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白并不能标记神经元纤毛20。这一研究难题在发现多种G蛋白偶联受体（GPCR）、信号转导装置以及富集于神经元纤毛膜上的膜相关蛋白后，得到了部分解决21,22。所有这些直接而基础的观察结果均提示，中枢神经系统纤毛在重要性和多样性方面似乎超越了其他组织。例如，脑内不同区域的纤毛长度和GPCR定位存在差异，某些神经核团中的纤毛长度与其他核团相比明显不同19,23。同样，其GPCR组成及信号转导装置的组合也因神经解剖位置和神经元类型的不同而呈现多样性2,24,25,26,27,28,29。这些简单的观察表明，哺乳动物中枢神经系统纤毛的长度和组成受到严格调控，这一点与模式生物（如Chlamydomonas reinhardtii）相似；然而，这些长度差异对纤毛功能、信号传导乃至最终行为的影响仍不清楚16,30,31,32。

准确测量纤毛长度和组成是一项技术难题，容易产生人为误差且难以重复。目前，纤毛 体内 和 体外 通常使用免疫荧光方法来鉴定，该方法通过标记纤毛蛋白或纤毛富集的荧光报告等位基因实现33,34,35然后使用 ImageJ 等图像分析软件中的线条测量工具，从二维（2D）图像中测量这些荧光标记的纤毛长度。36这一过程不仅繁琐且耗费大量人力，还容易引入偏差和错误。在测量纤毛强度以反映纤毛结构变化时，同样会遇到上述障碍。37为减少此类图像分析中的不一致性，人工智能（Ai）程序正逐渐成为更普遍且经济可行的选择38.

人工智能（Ai）是指通过利用计算机算法和编程，使计算机系统能够执行通常需要人类智能才能完成的任务的技术进步39。人工智能设备被训练用于识别重复出现的模式、参数和特征，并采取行动以最大化实现成功结果的可能性。人工智能具有高度灵活性，可被训练以识别特定目标或感兴趣结构（例如纤毛），并进一步编程对已识别对象执行多种分析。因此，人工智能能够快速且可重复地生成复杂的图像数据38。对采集图像进行自动化和人工智能分析，可在限制潜在人为误差和偏倚的同时，提高研究的效能与效率39。建立基于人工智能的纤毛识别方法，可为所有研究团队提供一致的纤毛数据分析与解读方式。

本研究利用人工智能（Ai）模块在二维图像上识别体内（in vivo）和体外（in vitro）的纤毛。通过一组样本图像对 Ai 进行训练，使其能够识别纤毛。训练完成后，指定的 Ai 模块将在图像中对被识别的纤毛区域施加二值化掩膜。必要时，可对 Ai 生成的二值化结果进行手动调整，以确保图像中所有纤毛均被准确识别，并消除非特异性识别。在利用 Ai 完成纤毛识别后，采用自主开发的通用分析（GA）程序进行多种定量分析，例如测量纤毛长度和荧光强度。所收集的数据将导出为表格形式，便于阅读、解释并用于后续统计分析（图1）。采用自动化技术与 Ai 识别纤毛并获取不同实验组之间的精确测量数据，将有助于未来深入研究中枢神经系统（CNS）纤毛功能与形态对细胞间通讯及细胞行为的影响。

方案

1. 获取原始图像

  1. 根据需要对样本进行固定和免疫标记20。
    1. 使用共聚焦显微镜，以最大位深度和满足奈奎斯特分辨率的相同像素尺寸对纤毛进行成像。
    2. 将图像导出为单色的标记图像文件格式（.tif）文件。
      ​注意：本方案概述了如何在 NIS Elements 软件中专门使用 Ai 模块。如果图像是以 .nd2 文件格式采集的，则无需将图像导出为 .tif 文件，用户可直接进入步骤 2.3。如果图像是在其他系统上采集的，可单独购买 NIS Elements 许可证，并按照后续步骤所述将 .tif 文件进行转换。

2. 训练人工智能识别纤毛

  1. 打开训练数据集。
    1. 选择约 50 个样本图像，每个图像帧中至少包含一根纤毛，用于训练软件，并将它们复制到同一个文件夹中。该文件夹用于在打开图像时指引软件路径。在单个 ND2 文档中打开这 50 帧图像，确保每帧至少包含一根纤毛 。选择 文件 > 导入/导出 > 从文件序列创建 ND 文件。
    2. 选择包含训练数据集的文件夹。这将在对话框窗口中央显示文件列表。使用上方下拉菜单中的至少一个选项手动定义文件的组织方式。可选选项包括多点（用于多个最大投影文件）、Z 序列（用于 Z 轴堆栈图像）、时间（用于延时图像）和波长（用于多通道文件）。
    3. 在每个选定的选项下输入相应的数值。未选择的选项请设为 无。点击 转换 以打开 ND 文档。
  2. 校准图像。
    1. 在图像左下角输入像素尺寸：右键点击 未校准 > 校准文档 > 像素尺寸。
  3. 识别纤毛。
    1. 通过在所有已打开的图像帧上精确描画单个纤毛结构，手动识别纤毛，使用 自动检测 或 绘制对象 工具，该工具位于 二值化工具栏 中。此操作将在目标对象上生成二值掩膜。这些二值化图像将作为样本，用于训练软件基于像素特征在未来实验图像分析中识别纤毛。选择 视图 > 分析控制 > 二值化工具栏 > 绘制对象。
      注意：请移除任何不含二值化对象的图像帧，因为如果软件无法在所有已打开的帧中检测到二值化对象，则无法开始训练。
  4. 训练人工智能（Ai）。
    1. 开始训练软件。这将打开“训练 Segment.ai”对话框。选择 NIS.ai > 训练 Segment.ai。
    2. 在 训练 Segment.ai 对话框中，选择用于训练的源通道。如果打开了多个通道的文件，仅选择一个通道作为源通道。然后选择用于训练 Ai 的正确的真实二值化图像（ground truth binaries）。最后，根据二值化对象的数量和分布情况，选择所需的训练迭代次数。
      注意：如果二值化对象在背景中易于识别且在图像中分布良好，软件可能仅需不到 1000 次迭代即可完成训练以识别图像。如果图像信噪比较低，建议训练时至少运行 1000 次迭代，以便 Ai 能够以较高置信度识别测试样本中的纤毛。
    3. 选择保存训练后 Ai 文件（.sai）的目标文件夹，然后点击 训练 开始训练软件。软件将基于已描画的二值化图像进行自我训练。此过程可能需要数小时。
      注意：训练过程中，软件将显示一个训练损失图。该图初始阶段可能出现峰值，随后逐渐下降并最终稳定在约 1% 的损失水平。建议在“训练 Segment.ai”对话框中勾选 保存图表截图 以保存该图供后续参考（补充图 1）。
    4. 如果需要对训练进行进一步优化，可继续在相同数据集上训练。或者，也可使用完全相同的参数在新数据集上进行训练。不建议将已训练过的 Ai 模型用于参数不同或目标对象不同的新数据集上进行训练。选择 训练 segment.ai > 继续训练 > 选择已训练的 Ai 文件。

3. 使用训练好的人工智能识别纤毛

  1. 打开实验数据集。
    1. 通过将样本 .tif 文件转换为 .nd2 文件，在软件中打开纤毛的共聚焦图像，操作方式与步骤 2.1 类似。选择 文件 > 导入/导出 > 从文件序列创建 ND 文件。
      注意：图像的像素大小应与用于训练 Ai 的图像一致。如果图像已经是 ND2 格式，则跳至步骤 3.3。
  2. 校准图像。
    1. 在图像左下角输入像素大小。右键点击 未校准 > 校准文档 > 像素大小。
  3. 在已打开的文件上运行训练好的 Ai 模型。
    1. 开始使用 Ai 识别纤毛。软件将根据前一步的训练结果在纤毛上绘制二值化轮廓。此过程需要几秒钟。选择 NIS.ai > Segment.ai。
      注意：如果打开了多个通道，软件会提示选择通道。通道将按其各自的名称列出。若未指定通道，“单色（Mono）”选项将被自动选中。
  4. 检查图像中是否存在误识别的二值化对象。
    1. Ai 完成纤毛识别并生成二值化图像后，检查是否存在被错误识别的对象。如有需要，可手动删除误识别的二值化对象。选择 视图 > 分析控制 > 二值化工具栏 > 删除对象。

4. 纤毛长度和强度的测量

  1. 创建一个新的通用分析3（GA3）方案。
    1. 现在，纤毛已被识别和分割，接下来使用GA3工具分析纤毛的不同参数，如长度和强度。这将打开一个新窗口，其中心区域为空白，用于定义分析内容。选择 图像 > 新型GA3配方.
  2. 选择要分析的二进制文件。
    1. 由于纤毛已使用 Segment.ai 进行分割，GA3 将自动检测并正确标记 Ai 生成的二值图像，并包含该节点。选择“二元组 > 自动检测_AI 或 二元组 > 绘制对象_AI.
  3. 选择分析所需的通道。GA3 还将自动检测图像中的通道，并在其下方显示相应通道的标签页 通道.
  4. 移除接触图像边框的物体。
    1. 由于人工智能会分割画面中所有类似纤毛的物体，因此也会检测到画面边缘处不完整的纤毛。这些物体可在步骤3.4中手动去除，也可在GA3中自动去除。选择 二值化处理 > 去除对象 > 触及边界.
  5. 选择用于测量纤毛的参数。
    1. 拖拽要测量的参数，例如纤毛长度（长度）和强度（总对象强度）。将节点连接到相应的二进制节点（连接 A）和通道节点（连接 B）。将鼠标悬停在节点连接处，将显示工具提示，指示该节点所属的连接。选择 测量 > 对象尺寸 > 长度 和 测量 > 对象强度 > 对象总强度.
      注意：该节点 长度 仅连接到二元节点，而 总目标强度 同时连接到二进制节点和通道节点。
  6. 将测量结果汇总到一个表格中。
    1. 通过拖放节点将所有测量结果合并到单个输出表格中 附加列 连接到分析流程图并将其连接至测量节点， 长度 和 总目标强度. 选择 数据管理 > 基础 > 追加列.
  7. 测量纤毛。
    1. 通过点击测量纤毛 运行此过程需要数分钟以测量实验图像中的所有纤毛。长度和强度数据将显示在新窗口中 分析结果 窗口
      ​注意：该表格有时可能包含人工智能识别为纤毛但尺寸过小、人眼无法检测并在步骤 3.4 中被剔除的掩膜数据。此类对象可在统计分析前通过设置筛选条件从数据集中去除。此处使用了 1 µm 的筛选阈值。 体外 纤毛长度测量在 图2 和 2 µm 用于 体内 纤毛。此操作可在使用以下路径导出数据之前完成。选择 分析结果窗口 > 定义筛选条件 > 输入数值 > 使用筛选.
  8. 导出数据以进行统计分析。

5. 共定位研究

注意：共定位分析可以包含在用于纤毛长度和强度分析的同一 GA3 流程中。如果使用同一流程，请按照下文所述打开文件，并在同一分析流程中测量两个通道的长度和强度以及共定位系数。

  1. 打开实验数据集。
    1. 使用软件将样本 .tif 文件转换为 .nd2 文件，以打开纤毛的实验共聚焦图像。选择 文件 > 导入/导出 > 从文件序列创建 ND 文件.
    2. 在弹出窗口中，从窗口左侧第一列的资源管理器中选择所有感兴趣通道的16位深度单色文件。选择 多点 或 Z系列 从第一个下拉菜单中选择，并输入相应图像总数或图像栈总数的数值。
    3. 在第二个下拉框中，选择 波长 并将数值更改为文件夹中通道的总数。软件将自动解锁一个 波长 位于弹出窗口右下角的选择窗口。使用 颜色 下拉菜单中选择各通道的颜色。为每个通道在下方指定不同的名称 名称 柱。所有信息更新后，单击 转化软件将自动生成一个 全部 叠加了所有选定通道各自图像的图像文件。
  2. 校准图像。
    1. 在图像左下角输入像素大小。右键单击 未校准 > 校准文档 > 像素大小.
  3. 在第一个通道上运行训练好的人工智能模型。
    1. 开始在一个已打开的通道上识别纤毛（例如，ACIII； 图 5A) 使用 Ai。软件现在将根据对此通道的训练结果，在标记了 ACIII 的纤毛上绘制二值图像。此过程需要几秒钟。选择 NIS.ai > Segment.ai > 源通道 > ACIII.
  4. 在第二通道上运行训练好的 Ai。
    1. 开始在另一个已打开的通道上识别纤毛（例如，MCHR1； 图5B) 使用 Ai。软件现在将根据此通道的训练结果，在标记了 MCHR1 的纤毛上绘制二值图像。此过程需要几分钟时间。选择 NIS.ai > Segment.ai > 源通道 > MCHR1.
  5. 检查图像中是否存在误判的双星系统。
    1. 一旦人工智能识别出纤毛并生成二值图像后，检查图像中是否存在误识别的对象。如有必要，手动删除误识别的二值图像。选择 视图 > 分析控制 > 二值化工具栏 > 删除对象.
  6. 创建新的GA3配方。
    1. 现在纤毛已被识别并完成分割，接下来使用 GA3 工具进行共定位分析。这将打开一个新窗口，其中心区域为空白，用于定义分析内容。系统将生成一个包含所有已识别二值图像和通道的窗口。请确认进行分析所需的所有通道和二值图像均已存在并被选中。选择 图像 > 新增 GA3 配方.
  7. 移除接触图像边框的物体。
    1. 由于人工智能会分割画面中所有类似纤毛的物体，因此也会检测到画面边缘处不完整的纤毛。这些物体可在步骤5.5中手动去除，也可在GA3中自动去除。选择 二值化处理 > 去除与边界接触的物体 > 与边界接触.
  8. 在 GA3 中设置共定位通路。
    1. 为测量纤毛内两个通道的重叠程度，使用曼德系数相关性分析。拖放 曼德斯系数 将节点插入GA3配方的空白区域，并将其连接到相应的二元组和通道。此处，“连接A”与ACIII二元组相连，“连接B”与MCHR1通道相连，“连接C”与ACIII通道相连，以确定MCHR1在ACIII二元组内的重叠情况。选择 测量 > 物体比率测定法 > 曼德斯系数.
      注意：该软件允许使用与本方案所述相同步骤的 Pearson 相关系数来测量共定位40.
  9. 将测量结果汇总到一个表格中。
    1. 将所有测量结果汇总到一个输出表格中。选择 数据管理 > 基础 > 追加列.
  10. 测量共定位。
    1. 点击测量纤毛 运行此过程需要几分钟时间来测量实验图像中的所有纤毛。数据将显示在一个新窗口中 分析结果 窗口
  11. 导出数据以进行统计分析。

结果

训练人工智能识别纤毛
测量和评估纤毛的结构长度与组成可能是一项繁琐、耗时且容易出错的工作。在此，我们利用人工智能（Ai）从大量图像中精确分割纤毛，并通过分析工具对其长度和荧光强度进行量化分析（图1）。所有人工智能方法的实施均需经过训练步骤。我们建立了一套用于识别纤毛的训练流程，该流程通过人工对纤毛结构施加二值化掩膜来完成。这些信息随后被用于基于二值化标注下的像素特征训练人工智能模型。一般而言，训练过程需进行约1000次迭代，若训练损失或错误率低于1%，则可视为达到最优状态。然而，训练过程中的迭代次数与错误率可能因所使用的训练样本图像而异。例如，在使用体外（in vitro）神经元纤毛图像进行训练后，错误率为1.378%，而使用体内（in vivo）脑组织切片图像训练时，错误率为3.36%（补充图1）。训练完成后，人工智能可在数秒内对实验图像中的纤毛进行分割，所得的二值化掩膜可用于测量纤毛的结构参数。该方法避免了传统强度阈值法在高背景噪声图像中或当目标结构彼此靠近时难以准确分割的问题。此外，人工智能通过在所有图像中应用相同的算法，减少了人为因素导致的误差与偏差。

使用GA3测量纤毛长度
纤毛长度受到严格调控，并与纤毛信号传导的功能效应密切相关16,19在此，我们使用NIS Elements软件中的分析流程“通用分析3”（General Analysis 3，GA3）测量纤毛长度。GA3有助于将多种工具整合到单一工作流程中，为每个实验构建定制化的分析程序。我们首先在一种细胞系中测量纤毛长度。对小鼠肾髓质集合管细胞（IMCD-3细胞）的纤毛使用乙酰化微管蛋白进行免疫标记，并通过共聚焦显微镜成像。在使用segment.ai进行分割后，我们利用GA3测量纤毛长度。补充图3A）。尽管乙酰化α-微管蛋白主要存在于初级纤毛中，但也存在于其他富含微管的区域，如细胞骨架以及细胞分裂桥。经过训练的人工智能能够准确识别图像中的纤毛，而不会识别其他非纤毛结构的乙酰化微管蛋白阳性信号。IMCD细胞上的纤毛长度范围从 0.5 µm 到 4.5 µm 1.8 ± 0.04 µm (图2A）。接下来，我们检测了Ai在原代神经元培养物中测量纤毛长度的能力。我们将新生小鼠下丘脑和海马组织的神经元培养10天，并使用纤毛标志物腺苷酸环化酶III（ACIII）进行免疫标记21,41在分析神经元培养物时，我们发现对长度进行统计分析前先应用滤波器会很有帮助。由于信噪比较低，存在多个小于 1 µm 被鉴定出并非纤毛的结构。因此，我们对数据进行了筛选，以剔除所有小于 1 µm 长度，以确保仅分析纤毛。在培养的下丘脑神经元中，纤毛长度范围为 2 µm 到 7 µm 3.8 ± 0.19 µm (图2B）。有趣的是，培养的海马神经元纤毛更长，平均长度为 6.73 ±0.15µm (图 2C据报道，下丘脑内不同的神经元核团表现出不同的纤毛长度，且这些纤毛会以核团特异性的方式，根据生理变化而改变其长度。19,23因此，我们还对标记了成年雄性C57BL/6J小鼠下丘脑脑切片中的ACIII，并对弓状核（ARC）和室旁核（PVN）进行了成像。使用GA3测量纤毛长度，我们观察到 体内 下丘脑纤毛比...更长 体外 纤毛。具体而言，下丘脑纤毛 在体 范围从 1 µm 约 15 µm (图3). 下丘脑室旁核（PVN）中纤毛长度的差异无统计学意义（5.54 ± 0.42 µm) 以及弓状核（ARC）中的（6.16 ± 0.27 µm) (图3C)23同样，海马体 cornu ammonis（CA1）区域的纤毛长度范围较窄，从 1 µm 至 10 µm 5.28 ± 0.33 µm (图3）。根据以往已发表的研究，我们使用Ai和GA3工具进行的分析显示，不同脑区的纤毛在长度上表现出多样性。19,23此外，利用这种人工智能方法，我们能够快速评估大量纤毛。

使用GA3测量纤毛组成
初级纤毛是多种信号通路的信号中枢，利用多种类型的蛋白质执行特定功能，例如马达蛋白、鞭毛内运输蛋白和G蛋白偶联受体等3,24,42,43. 维持这些蛋白质在纤毛内的适当水平对于其正常功能至关重要，且通常表现出细胞环境依赖性。对这些蛋白质进行荧光标记不仅使我们能够观察其定位，还能通过量化荧光强度来评估相对较小的纤毛区室中标记蛋白的含量20因此，我们试图确定一种纤毛G蛋白偶联受体——黑色素浓缩激素受体1（MCHR1）的信号强度， 体内 在成年雄性小鼠下丘脑的弓状核（ARC）和室旁核（PVN）中24,44. 利用 Ai 和 GA3，我们测量了 MCHR1 阳性纤毛的长度及荧光强度，以确认所计数的结构确为纤毛补充图 3A）。我们排除了分析后小于 2 µm 长度，并分析了剩余二值化掩膜的强度。有趣的是，我们发现下丘脑室旁核（PVN）中纤毛MCHR1的强度显著高于弓状核（ARC），表明PVN中纤毛MCHR1的存在更为丰富（图4）。需要进一步研究以确定纤毛MCHR1在这些神经环路中的意义。我们还检测了下丘脑和海马原代培养神经元中纤毛MCHR1的强度。两种培养细胞的纤毛均表现出MCHR1强度的广泛分布，提示存在异质性神经元群体（补充图2因此，利用诸如Ai和GA3等复杂的分析工具，可以评估同一组织内或不同组织间纤毛的异质性。值得关注的是，其他神经元G蛋白偶联受体（GPCRs）是否在相同组织的神经元内也表现出类似的定位差异，以及这些差异是否会随生理状态的变化而发生改变。

共定位
尽管在整幅图像区域内测量荧光强度可以大致反映蛋白质的表达情况，但这种方法无法提供空间分布信息，也无法揭示其与其他邻近蛋白质及细胞结构的接近程度。在此，我们通过绘制每个二值掩膜下MCHR1与作为纤毛标记物的ACIII的荧光强度关系图，来评估MCHR1与ACIII在纤毛中的共定位情况（图5）。该图显示，大多数纤毛同时表达ACIII和MCHR1，但部分纤毛中某一通道的表达强度明显高于另一通道。此外，还存在一些仅表达ACIII或MCHR1的纤毛，这可从分别位于x轴和y轴上的数据点明显看出。为了量化这种共定位程度，我们计算了Mander重叠系数，并比较了ARC和PVN神经元纤毛中MCHR1表达的重叠范围40。有趣的是，分析结果显示，PVN区域的重叠系数（0.6382 ± 0.0151）显著高于ARC区域（0.5430 ± 0.0181）（图5C）。这一结果与我们先前观察到的PVN中MCHR1荧光强度高于ARC的结果一致（图4）。这些数据表明，与纤毛长度类似，MCHR1在纤毛区室中的表达模式在脑内不同区域之间存在差异。通过使用相同的分析流程，未来可进一步确定其他纤毛G蛋白偶联受体（如神经肽Y受体2型（NPY2R）和生长抑素受体3型（SSTR3））是否也表现出类似的区域差异性。

沿纤毛测量强度分布
一旦使用 segment.ai 鉴定出纤毛，即可对 GA3 分析流程进行修改，以将纤毛分析与其他感兴趣结构的识别相结合。例如，使用基体标记物进行标记有助于鉴定纤毛的极性。为进行此类分析，我们对出生后第 0 天（P0）小鼠下丘脑脑切片进行了成像，这些小鼠表达 ARL13B-mCherry 和 Centrin2-GFP，并对弓状核（ARC）和室旁核（PVN）进行了成像34。在此分析中，纤毛仍如前所述通过 Ai 进行识别，但改进后的 GA3 分析流程额外包含了对 Centrin2-GFP 的识别，该蛋白是一种位于纤毛基部的中心粒蛋白（补充图 3B）。通过标记 Centrin2-GFP，可将纤毛的基部与 ARL13B-mCherry 阳性纤毛的顶端区分开来（图 6A）。随后，我们不再测量整个纤毛内的荧光强度，而是能够沿纤毛长度方向分析 ARL13B 荧光强度的变化（图 6B）。此外，我们还可比较纤毛近端与远端 ARL13B 荧光强度的差异。为此，我们从纤毛基部开始，将其长度划分为 1 微米（µm）的区间段，将第一个 1 µm 区间定义为近端，最后一个 1 µm 区间定义为远端。分析结果显示，在 ARC 和 PVN 中，纤毛基部附近的 ARL13B 含量显著高于其顶端，该结果与先前在人软骨细胞中报道的研究结果一致45（图 6C）。在此类分析中，不再依赖长度筛选来排除非纤毛的小型结构，而仅分析与 Centrin2-GFP 标记相关联的纤毛。这种方法在以下情况下具有优势：例如，当基因突变导致纤毛极短，或当纤毛亚结构域（如过渡区或顶端）发生改变时。利用 Ai 与 GA3 分析进行纤毛识别具有高度可调性，可根据多种复杂的科研问题进行定制化调整。

基于人工智能的纤毛分析工作流程：训练、分割、表征与结果可视化。
图1. 使用人工智能测量纤毛长度和强度的工作流程。（A）为训练人工智能，需在原始训练图像上对目标对象（纤毛）手动绘制二值轮廓。利用所绘制的二值轮廓，对 Segment Ai 进行训练，使其能够识别纤毛的形态和像素强度。（B）随后，将训练好的 Segment Ai 应用于原始实验图像，自动在被识别为纤毛的对象上绘制二值轮廓。这些二值轮廓可进一步优化，以确保仅对所有且仅限纤毛进行分析。（C）构建一个 GA3 程序，用于分析人工智能识别出的对象的强度和长度。（D）将记录导入软件中的表格。该表格可导出以进行后续分析。请点击此处查看该图的高清版本。

细胞系和神经元培养物；显微镜分析；纤毛长度频率图；荧光标记。
图 2. 体外纤毛长度测量。代表性图像显示了（A）IMCD 细胞（绿色，乙酰化微管蛋白）、（B）原代下丘脑培养物（绿色，ACIII）和（C）海马培养物（绿色，ACIII）中的纤毛。使用经过训练的人工智能（Ai）识别纤毛（如二值掩膜中的紫红色所示），然后使用 GA3 测量纤毛长度。纤毛长度分布以 0.5 或 1.0 微米为区间，表示为各区间内纤毛所占百分比。* 表示人工智能未正确识别细胞分裂桥。n = 225 根纤毛（来自 3 次重复实验的 IMCD 细胞），54 根纤毛（来自 3 只动物的下丘脑培养物）和 139 根纤毛（来自 3 只动物的海马培养物）。比例尺：10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

ARC、PVN、CA1 中 ACIII 的免疫荧光显微镜图像；二值掩膜分析；纤毛长度图。
图 3. 体内 纤毛长度测量。 （A）成年小鼠脑切片中弓状核（ARC）、室旁核（PVN）和 CA1 区纤毛（绿色，ACIII）的代表性图像。（B）使用 NIS Elements 中训练好的人工智能（Ai）识别纤毛，如二值掩膜（品红色）所示，随后使用 GA3 测量纤毛长度。（C）纤毛长度分布以每微米区间内纤毛所占百分比表示。数据来自 3 只动物，其中 ARC 有 68 根纤毛，PVN 有 36 根，CA1 有 29 根。比例尺为 10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

MCHR1表达分析：荧光图像、二值化掩膜、强度图、纤毛频率图。
图 4. 下丘脑神经元纤毛的AI辅助纤毛染色强度测量。 （A）成年小鼠脑切片中弓状核（ARC）和室旁核（PVN）纤毛（MCHR1，红色）的代表性图像。使用NIS Elements中训练好的AI识别纤毛（如二值化掩膜中的青色所示），然后使用GA3测量纤毛中MCHR1染色的强度。（B）MCHR1强度以平均值±标准误（S.E.M.）表示。每个点代表一条纤毛。* p < 0.05，Student's t检验。（C）MCHR1强度分布以每0.2 × 107任意单位（A.U.）区间内纤毛百分比表示。n = 3只动物，ARC中53条纤毛，PVN中78条纤毛。比例尺：10 µm。 请点击此处查看本图的放大版本。

ARC、PVN 中 ACIII 与 MCHR1 的共定位；荧光图像、二值化掩膜、共定位图表。
图 5. 基于人工智能的纤毛共定位分析。 （A, B）分别为弓状核（ARC）和室旁核（PVN）中纤毛的代表性图像。纤毛用 ACIII（绿色）和 MCHR1（红色）标记。在 NIS Elements 软件中使用训练好的人工智能模型识别纤毛，如二值化掩膜所示（ACIII 标记的纤毛为品红色，MCHR1 标记的纤毛为青色）。GA3 用于识别同时含有 ACIII 和 MCHR1 的纤毛。（C）Manders 重叠系数（MOC）以平均值 ± 标准误（S.E.M.）形式绘图。每个点代表一条纤毛。* p < 0.05，采用 Student's t 检验。（D）ARC 和 PVN 中 MCHR1 荧光强度与 ACIII 荧光强度的散点图。每个点代表一条纤毛。数据来自 3 只动物，共 72 条纤毛（ARC）和 47 条纤毛（PVN）。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示ARC和PVN中ARL13B蛋白分布的荧光显微镜图像；强度数据图。
图6. 纤毛与基体分析。（A）P0小鼠ARC和PVN中纤毛（红色，ARL13B-mCherry）和基体标记物（绿色，Centrin2-GFP）的代表性图像。使用经过训练的人工智能（Ai）识别纤毛，并在二值掩膜中以青色显示。基体的二值掩膜（品红色）通过GA3方案中的阈值设定生成。（B）单根纤毛的代表性线扫描强度图。（C）Ai识别出的纤毛近端和远端ARL13B强度，以平均值±标准误（S.E.M.）表示。近端和远端分别定义为从纤毛基部起始的前1 µm长度区域和末尾1 µm长度区域。每个点代表一根纤毛。* p < 0.05。n = 来自2只动物的ARC中6根纤毛，以及来自3只动物的PVN中21根纤毛。比例尺：10 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图1. 人工智能训练损失图 (A，B) segment.ai 在神经元纤毛上的训练损失图 体外 以及 体内 分别。 请点击此处下载此文件。

补充图2. 人工智能辅助的纤毛染色强度测量 体外 神经元纤毛. (A, B) 下丘脑和海马原代培养细胞中纤毛（MCHR1，红色）的代表性图像。使用NIS Elements中的训练后人工智能（Ai）识别纤毛，如二值化掩膜图（青色）所示，随后使用GA3测量纤毛中MCHR1染色的强度。MCHR1强度分布以每1000 A.U.（下丘脑）或2000 A.U.（海马）为区间，按纤毛百分比作图。数据来自3只动物，分别统计下丘脑培养中的30根纤毛和海马培养中的106根纤毛。比例尺 10 µm. 请点击此处下载该文件。

补充图3. 用于纤毛分析的通用分析3（GA3）方案。（A）用于测量纤毛长度、荧光强度和Mander系数的简易通用分析（GA3）方案。（B）使用基体标记物沿纤毛长度方向测量强度的复杂GA3方案。请点击此处下载该文件。

讨论

长度和强度测量是分析初级纤毛的常用方法，但目前该领域尚未建立标准化的常规方法。使用ImageJ等软件对初级纤毛进行鉴定和定量分析耗时较长，且容易受到操作者主观偏差和误差的影响，这使得对大规模数据集进行准确分析变得困难。本文展示了使用人工智能程序可克服上述诸多挑战，实现初级纤毛的高通量分析。本文详细描述了训练基于人工智能的应用程序以识别初级纤毛的流程，并概述了进行长度和强度分析所需的具体步骤。

尽管最初训练人工智能（Ai）识别纤毛需要用户投入大量时间，但一旦训练完成，便可用于任何采用相同参数获取的数据集。人工智能生成的二值化掩膜可进行修改，以便校正任何错误。然而，纤毛识别中的错误应提示用户：人工智能需要通过额外的图像进一步训练。该方法的一个主要优势在于，人工智能可被训练以在二维和三维的不同样本类型中识别纤毛。以往实验室内部开发的分析方法存在多种局限性，包括需要手动设定阈值进行识别，以及难以识别来自组织切片中细胞密度较高区域的纤毛36,46,47。这些方法也仅专门用于纤毛分析，而使用 NIS Elements 软件的分析则可同时评估图像的多个方面。由于本文所述的人工智能属于 NIS Elements 软件包的一部分，因此使用尼康显微镜获取的图像可无缝衔接至分析流程。然而，本方法的使用并不强制要求使用尼康设备进行成像。无论原始数据文件格式如何，".tif" 文件均可由 NIS Elements 打开并用于人工智能分析。

NIS Elements 中的这一人工智能应用已广泛提供，可能已成为研究初级纤毛的实验室当前所用图像分析软件的一部分。随着人工智能技术的普及，其他成像软件也可能扩展其分析功能，以包含类似的人工智能模块。将人工智能分析应用于纤毛识别，可支持多种不同方面的纤毛分析。本文已概述了几种简单分析方法，例如长度分析（图2 和 3），强度（图4）和共定位（图5）更复杂的分析可以添加到GA3分析工作流程中，如同 图6例如，与其测量整个纤毛的荧光强度，研究者可能更关注纤毛某一亚区域内的强度差异，以评估蛋白在纤毛内的亚定位情况。纤毛亚区域内的强度差异可能提示蛋白在纤毛顶端或基部富集，例如Gli蛋白在纤毛顶端富集的现象。48此外，该人工智能应用可快速识别不同基因型或处理组之间的差异。尽管本实验室主要利用该方法分析来自脑切片或神经元培养物的纤毛图像，但它同样适用于多种细胞系或其他组织类型所获得的图像。由于该应用可适用于多种样本类型，因此对于研究初级纤毛或任何其他待评估的离散细胞器（如线粒体、细胞核或内质网）的众多研究团队而言，这一分析方法具有重要价值。

披露

共同作者 Wesley Lewis 就职于尼康公司。无财务披露信息。

致谢

本工作由美国国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所R01 DK114008项目资助NFB，以及美国心脏协会博士后基金#18PRE34020122资助RB。我们感谢尼康软件公司总经理Rich Gruskin、Melissa Bentley、Courtney Haycraft和Teresa Mastracci对本文手稿提出的宝贵意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Intel Xeon，3.6 GHz，32GB RAMIntel CorporationW-2123用于运行 NIS Elements 的处理器
Nikon Elements 软件Nikon Instruments Inc.-Ai 和 GA3 软件
Quadro RTX 4000 显卡NVIDIA CorporationQuadro RTX 4000
Windows 10 专业版 64 位Microsoft Inc.-用于运行 NIS Elements 的操作系统
工作站HP Development Company, L.P.HP Z4G4用于运行 NIS Elements 的工作站

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