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通过超高频超声成像分析Braf/Pten基因工程小鼠黑色素瘤模型中的淋巴结体积

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DOI：

10.3791/62527

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2021年9月8日

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1Institute of Clinical Physiology, National Research Council (IFC-CNR), 2Oncogenomics Unit, Core Research Laboratory, ISPRO

本文内容

摘要

黑色素瘤是一种极具侵袭性的疾病，会迅速扩散至其他器官。本方案描述了超高频超声成像结合三维重建技术的应用，用于监测转移性黑色素瘤Braf/Pten小鼠模型中腹股沟淋巴结体积的变化。

摘要

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 基因工程小鼠（Braf/Pten 小鼠）被广泛用作转移性黑色素瘤的体内模型。经他莫昔芬处理诱导原发肿瘤后，可在诱导后4至6周内观察到转移负荷的增加。本文展示了如何利用超高频超声（UHFUS）成像技术，通过测量腹股沟淋巴结体积的增加，来监测其转移累及程度的进展。

使用UHFUS系统对麻醉小鼠进行扫描，采用UHFUS线性探头（22-55 MHz，轴向分辨率为40 µm）。将动物置于仰卧位，以短轴视图采集腹股沟淋巴结（左右两侧）的B模式图像。通过电机驱动的机械臂以44 µm的步长采集超声图像记录。随后，将二维（2D）B模式图像导入超声图像后处理软件平台，在获取的二维横截面图像中对腹股沟淋巴结进行半自动识别与分割。最终，系统自动完成三维（3D）体积的完整重建，并生成淋巴结体积的三维渲染图像，同时以绝对测量值形式输出体积数据。

这种非侵入性的体内技术耐受性良好，允许在2周内对同一实验动物进行多次成像扫描。因此，它非常适合用于评估药物治疗对转移性疾病的影响。

引言

黑色素瘤是一种侵袭性皮肤癌，常扩散至其他皮肤部位（皮下转移），以及淋巴结、肺、肝、脑和骨骼1。在过去十年中，多种新药已进入临床应用，显著延长了转移性黑色素瘤患者的生存期。然而，仍存在诸多局限，包括治疗反应的时间和程度差异较大、严重不良反应以及获得性耐药的出现1。因此，至关重要的是在转移扩散的早期阶段即予以发现，即当肿瘤累及局部淋巴结时。

通常通过活检局部淋巴结（前哨淋巴结）来检测黑色素瘤细胞的存在。然而，超声成像正逐渐成为一种检测转移性受累的非侵入性方法，因其优于临床评估，有助于避免不必要的活检2,3,4。此外，超声成像似乎适用于淋巴结的长期监测，尤其是在高龄和/或合并其他疾病的情况下5,6。超声分析所检测到的可用于区分正常与转移性淋巴结的特征包括体积增大、形态由椭圆形变为圆形、边缘不规则、回声模式改变以及血流信号改变（增加）7。

Tyr::CreER+,Braf

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方案

本研究所述所有方法均已获得意大利卫生部批准（动物实验方案编号：#754/2015-PR 和 #684/2018-PR）。

1. 黑色素瘤诱导

注意：本研究使用了6周龄的Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 小鼠 [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)]（参见材料表）。

  1. 用4-羟基他莫昔芬（4-HT）处理小鼠，将3 µL浓度为5 mM的4-HT滴加至约1 cm大小区域2 上背部剃毛区域的皮肤，如先前所述11,16,17连续3天。
    注意：这将激活 Cre 酶，导致野生型 Braf 转变为 BrafV600E，并造成 Pten 的缺失。这两个突变足以诱导黑色素瘤的形成。
  2. 观察到 原发性肿瘤在皮肤涂抹部位于2-3周内形成，并达到50-100 mm³的体积3<....

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结果

对 Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 小鼠皮肤涂抹 4-HT 后，可诱导 Cre 活性，从而在基因组水平上发生野生型 Braf 向 BrafV600E 的转换，同时 Pten 基因丢失（图 3A）。2 至 3 周内，小鼠原位出现原发性肿瘤，外显率为 100%。在 4-HT 处理后第 4 周（t0），原发性肿瘤体积达到 50–100 mm3，此后可继续使用游标卡尺测量其生长情况，持续约 2 周（t1 和 t2；图 3B，上排图）。由于肿瘤体积过大，后续时间点无法继续观察，小鼠需实施安乐死。

就转移负荷而言，在给予4-HT处理后4至6周内，腹股沟淋巴结中的色素沉着呈逐渐增加的趋势（图3B，下排图）。这种色素沉着的.......

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讨论

本研究获得的数据证实了超声成像技术在监测转移性黑色素瘤Braf/Pten小鼠模型腹股沟淋巴结转移方面的应用能力。如先前研究所示16，该技术特别适用于评估药物治疗的效果，因为它能够在同一动物个体中通过比较t1和t t2时间点与t0时间点采集的测量数据，实现对淋巴结体积变化的动态监测。这种方法提高了实验结果的可靠性，因为个体间差异以及其他可能影响基础淋巴结大小的因素均已被纳入考量。此外，超声成像技术有助于遵循“3R”原则，减少每个实验组所需的动物数量。

在Braf/Pten小鼠中，不仅腹股沟淋巴结，而且臂淋巴结和腋窝淋巴结也是转移扩散的部位。然而，建议重点关注腹股沟淋巴结，因为其他淋巴结距离原发肿瘤部位过近，在原发肿瘤发展过程中通常会改变其位置和形态。或者，如果选择不同的肿瘤诱导部位（如耳朵或足垫），臂淋巴结和腋窝淋巴结可能更适合超声成像8。至于其他转移部位，由于组织中存在空气，肺部无法通过超声.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 S. Burchielli（FTGM，比萨）在动物实验操作方面的协助。本研究由 ISPRO—Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica 提供机构经费支持，资助对象为 LP；并由 AIRC—Associazione Italiana Ricerca sul Cancro 资助，项目编号 MFAG #17095。 LP

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-羟基他莫昔芬默克H6278用于肿瘤诱导的药物
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ（Braf/Pten）小鼠杰克逊实验室013590
蓝胶Sooft Ialia眼科凝胶溶液
BRAFV600E 抗体Spring Bioscience CorporationE19290
异氟烷（IsoFlo）硕腾用于气体麻醉的液体
MLANA 抗体赛默飞世尔科技M2-7C10
Sigma 凝胶Parker电极凝胶
透声凝胶透明Telic SAU超声耦合剂
VeetReckitt Benckiser IT脱毛膏
紧凑型双麻醉系统富士胶片，Visualsonics 公司配备鼻罩和诱导室的异氟烷麻醉系统
MX550S富士胶片，Visualsonics 公司UHFUS 线性探头
Vevo 3100富士胶片，Visualsonics 公司UHFUS 系统
Vevo 成像系统富士胶片，Visualsonics 公司UHFUS成像工作站及配备加热板的生理监测进展单元
Vevo Lab富士胶片，Visualsonics 公司超声图像后处理软件平台

参考文献

  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).
  2. Blum, A., et al.

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Braf Pten

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