方法文章

三种用于RNA测序的差异表达分析方法：limma、EdgeR、DESeq2

DOI：

10.3791/62528

⸱

2021年9月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Renmin Hospital of Wuhan University, 2Department of Pathology, Shanghai Skin Disease Hospital, Tongji University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提供了用于RNA测序的差异表达分析方法的详细方案：limma、EdgeR、DESeq2。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，能够揭示基因改变与复杂生物学过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后评估和治疗中具有重要价值。RNA-seq数据的差异分析对于识别异常转录至关重要，limma、EdgeR和DESeq2是进行差异分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要掌握一定的R语言技能以及选择合适方法的能力，而这些内容在医学教育课程中尚属欠缺。

本文提供了利用 limma、DESeq2 和 EdgeR 分别鉴定胆管癌（CHOL）与正常组织之间差异表达基因（DEGs）的详细实验方案，结果以火山图和维恩图展示。limma、DESeq2 和 EdgeR 这三种分析流程总体相似，但在分析过程的具体步骤上存在差异。例如，limma 采用线性模型进行统计分析，而 edgeR 和 DESeq2 则使用负二项分布模型。此外，EdgeR 和 limma 需要输入经标准化的 RNA-seq 计数数据，而 DESeq2 则无需预先标准化的数据。

本文提供了三种差异分析方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细实验方案。这三种方法的分析结果部分重叠。每种方法均有其优势，方法的选择仅取决于具体的数据情况。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，具有诸多优势（例如，数据可重复性高），并极大地加深了我们对复杂生物过程功能与动态的理解1,2。在不同生物学背景下识别异常转录本（也称为差异表达基因，DEGs）是RNA-seq分析中的关键步骤。RNA-seq使得深入理解与发病机制相关的分子机制和生物学功能成为可能。因此，差异分析被认为在肿瘤的诊断、预后评估和治疗中具有重要价值3,4,5。目前，已有越来越多的开源R/Bioconductor软件包被开发用于RNA-seq差异表达分析，尤其是limma、DESeq2和EdgeR1,6,7。然而，差异分析需要掌握一定的R语言技能以及选择合适方法的能力，而这些内容在医学教育课程中尚属欠缺。

本方案基于从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）提取的胆管癌（CHOL）RNA-seq 计数数据，分别使用R程序11执行三种最常用的方法（limma8、EdgeR9 和 DESeq210），以鉴定CHOL组织与正常组织之间的差异表达基因（DEGs）。limma、EdgeR 和 DESeq2 的三个分析流程相似，但在分析过程的具体步骤上存在差异。例如，EdgeR 和 limma8, 9 需要对RNA-seq计数数据进行标准化处理，而DESeq2则利用其自身的文库差异校正方法，无需预先标准化10。此外，edgeR 特别适用于RNA-seq数据，而limma则可用于微阵列和RNA-seq数据。limma采用线性模型评估差异表达基因12，而edgeR的统计方法基于负二项分布，包括经验贝叶斯估计、精确检验、广义线性模型和拟似然检验9。

综上所述，我们分别提供了使用limma、DESeq2和EdgeR进行RNA-seq差异表达分析的详细实验方案。通过参考本文，用户可轻松完成RNA-seq差异分析，并为其数据选择合适的差异分析方法。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意：打开 R-studio 程序并加载 R 文件 "DEGs.R"，该文件可从补充文件/脚本中获取。

1. 数据下载与预处理

  1. 从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）下载胆管癌（cholangiocarcinoma, CHOL）的高通量测序（HTSeq）计数数据。此步骤可通过以下 R 代码轻松实现。
    1. 点击 运行 以安装 R 软件包。
    2. 点击 运行 以加载 R 软件包。
      if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
       + install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SummarizedExperiment"))
    3. 设置工作目录。
      library (TCGAbiolinks)
      library(SummarizedExperiment)
      setwd("C:/Users/LIUSHIYI/Desktop")
    4. 选择癌症类型。
      cancer <- "TCGA-CHOL"
    5. 运行来自 "GDCquery.R" 文件的 R 代码以下载数据。文件 "GDCquery.R" 可从补充文件/脚本中获取：
      source("Supplementary files/Scripts/GDCquery.R")
      head(cnt)
      ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07
      ##ENSG00000000003 4262
      ##ENSG00000000005 1
      ##ENSG00000000419 1254
      ##ENSG00000000457 699
      ##ENSG00000000460 239
      ##ENSG00000000938 334
      注：执行后，CHOL HTSeq 计数数据将被下载并命名为 "cnt"，其中行代表 ensemble 基因 ID，列代表样本 ID。请注意样本 ID 中第 14 至 15 位的数字；数字 01 至 09 表示肿瘤组织，10 至 19 表示正常组织。
  2. 将 ensemble 基因 ID 转换为基因符号。
    1. 根据注释文件的存储路径将其导入 R。注释文件（gencode.v22.annotation.gtf）可从补充文件中获取。
      ​gtf_v22 <- rtracklayer::import('Supplementary files/gencode.v22.annotation.gtf')
    2. 运行来自 "gtf_v22.R" 文件的 R 代码，该文件可从补充文件/脚本中获取：
      source("Supplementary files/Scripts/gtf_v22.R")
    3. 应用函数 "ann" 将 ensemble 基因 ID 转换为基因符号。
      cnt=ann(cnt,gtf_v22)
  3. 过滤低表达基因
    1. 点击 运行 以安装 R 软件包 "edgeR"。
      ​BiocManager::install("edgeR")
    2. 点击 运行 以加载 R 软件包 "edgeR"。
      ​library(edgeR)
    3. 运行以下 R 代码，保留至少在两个样本中每百万计数（counts per million, CPM）值大于 1 的基因。
      keep <- rowSums(cpm(cnt)>1)>=2
      cnt <- as.matrix(cnt[keep,])
      ​注：使用每百万计数（CPM）值而非原始读段计数，以消除因测序深度不同而引起的偏差。

2. 通过 "limma" 进行差异表达分析

  1. 点击 运行 安装 R 软件包 "limma".
    BiocManager::install("limma")
  2. 点击 运行 加载 R 包 "limma", "edgeR".
    library(limma)
    library(edgeR)
  3. 运行以下 R 代码以创建设计矩阵。
    组 <- substring(colnames(cnt), 14, 15) # 提取分组信息
    组 [组 %in% "01"] <- "癌症" # 将“01”设为肿瘤组织
    组 [组 %in% "11"] <- "正常" # 将“11”设为正常组织
    ​组 <- 因子（组，水平 = c("正常","癌症"))
    1. 创建设计矩阵。
      设计 <- model.matrix (~组别)
      design 的行名 <- colnames(cnt)
    2. 创建 DGEList 对象。
      dge <- DGEList(counts = cnt, group = group)
    3. 对数据进行归一化处理。
      dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")
    4. 运行以下 R 代码，以执行基于 limma-trend 方法的差异表达分析。
      dge
      ## 一个类的对象 "DGEList"
      ##$counts
      ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07
      ##TSPAN6 4262
      ##DPM1 1254
      ##SCYL3 699
      ##C1orf112 239
      ##​FGR 334
    5. 计算每分钟计数（CPM）值。
      ​lodge <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)
    6. 点击 运行 拟合线性模型以预测数据或推断变量之间的关系。
      合适 <- lmFit（logdge，design）
    7. 基于贝叶斯方法计算 T 值、F 值和对数优势比。
      合适 <- eBayes(fit, trend=TRUE)
    8. 提取结果表格。
      res_limma<- as.data.frame(topTable(fit, n=Inf))

      head(res_limma)
      ## logFC AveExpr t P值 adj.P值 B
      ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823
      ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656
      ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001
      ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056
      ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704
      ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543
      #差异表达分析的结果保存在 "res_limma"，包括基因编号（gene id）、log2 倍数变化值（logFC）、基因在实验中的平均 log2 表达水平（AveExpr）、修正的 t 统计量（t）、相应的 p 值（P.Value）、经错误发现率校正的 p 值（adj.P.Val）以及差异表达基因的 log-odds 值（B）
      ​注意：该功能 "calcNormFactors()" 的 "edgeR" 用于对数据进行标准化，以消除样本制备、文库构建及测序过程带来的影响。在设计矩阵构建过程中，需将实验设计（例如：组织类型：正常或肿瘤组织）与矩阵中的样本编号相对应。limma-trend 适用于测序深度相同的数据，而 limma-voom 适用于以下情况：（i）样本文库大小不同；（ii）未使用 TMM 方法进行标准化的数据；（iii）数据量较大 "噪声" 在数据中，正值的logFC表示该基因在实验中上调，而负值则表示该基因下调。
    9. 鉴定差异表达基因。
      res_limma$sig <- 作为因子(
       ifelse(res_limma$adj.P.Val < 0.05 & abs(res_limma$logFC) > 2,
         ifelse(res_limma$logFC > 2 ，'up'，'down'），'not'） # 调整后的 p 值 < 0.05 和 |log2FC| >= 2 是用于鉴定差异表达基因的阈值
      summary(res_limma$.sig)
      ##向下而非向上
      ##1880 ​17341 1443
    10. 将结果表格输出到文件中。
      write.csv(res_limma, file = 'result_limma.csv')
    11. 点击 运行 安装 R 软件包 "ggplot2".
      install.packages("ggplot2")
    12. 点击 运行 加载 R 包 "ggplot2".
      library(ggplot2)
    13. 运行以下 R 代码： "volcano.R" 以生成火山图。该文件 "volcano.R" 可从补充文件中获取。
      来源"补充文件/脚本/volcano.R")
      火山图（res_limma，"logFC","adj.P.Val",2,0.05)
      注意：基因可根据其log2FC和adj-p值被映射到不同位置，上调的差异表达基因以红色标出，下调的差异表达基因以绿色标出。
    14. 点击 导出 保存火山图。
      ​注意：火山图可以以不同格式（如 pdf、TIFF、PNG、JPEG 格式）生成并下载。基因可根据其 log2FC 和 adj 值映射到不同位置 p 值，上调的差异表达基因（log2FC > 2，调整 p < 0.05）以红色标出，下调的差异表达基因（log2FC < -2，调整 p < 0.05）的基因用绿色表示，非差异表达基因用灰色表示。

3. 通过 "edgeR" 进行差异表达分析

  1. 点击 运行 加载 R 包 "edgeR".
    library(edgeR)
  2. 运行以下 R 代码以创建设计矩阵。
    组 <-substring(colnames(cnt), 14, 15)
    组 [group %in% "01"] <- "癌症"
    组 [组 %in% "11"] <- "正常"
    group=factor(group, levels = c("正常","癌症"))
    设计 <-model.matrix(~组别)
    design 的行名 = cnt 的列名
  3. 点击 运行 创建 DGEList 对象。
    dge <- DGEList(counts=cnt)
  4. 对数据进行归一化处理。
    dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")
  5. 点击 运行 用于估计基因表达值的离散程度。
    dge <- estimateDisp(dge, design, robust = T)
  6. 点击 运行 将模型拟合到计数数据。
    合适 <- glmQLFit(dge, design)
  7. 进行统计检验。
    合适 <- glmQLFTest(fit)
  8. 提取结果表格。结果已保存在 "res_edgeR"，包括对数倍数变化值、对数每百万计数（log CPM）、F值、p值和FDR校正后的p值。
    res_edgeR = as.data.frame(topTags(fit, n = Inf))
    head(res_edgeR)
    ## logFC logCPM F P值 FDR
    ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21
    ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R
    ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20
    ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20
    ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20
    ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19
    #结果保存在 "res_edgeR"，包括对数倍数变化值（logFC）、对数每百万计数（log CPM）、F 值、p 值以及经 FDR 校正的 p 值
  9. 鉴定差异表达基因。
    res_edgeR$sig = as.factor(
    ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2,
    ifelse(res_edgeR$logFC > 2 ，“上”，“下”），“否”）
    summary(res_edgeR$sig)
    ##向下而非向上
    ##1578 15965 3121
  10. 将结果表格输出到文件中。
    write.csv(res_edgeR, file = 'res_edgeR.csv')
  11. 创建火山图。
    火山图（res_edgeR，"logFC","错误发现率",2,0.05)
  12. 点击 导出 保存火山图。

4. 通过 "DESeq2" 进行差异表达分析

  1. 点击 运行 安装 R 包 "DESeq2".
    BiocManager::install("DESeq2")
  2. 点击 运行 加载 R 包 "DESeq2".
    library(DESeq2)
  3. 运行以下 R 代码以确定分组因子。
    组 <-substring(colnames(cnt), 14, 15)
    组 [group %in% "01"] <- "癌症"
    组 [group %in% "11"] <- "正常"
    group=因子(group, 水平 = c("正常","癌症"))
  4. 创建 DESeqDataSet 对象。
    dds <-DESeqDataSetFromMatrix（cnt，DataFrame（group），design = ~group）
    dds
    ##class: DESeqDataSet
    ##dim: 20664 45
    ##元数据(1)：版本
    ##检测(1)：计数
    ##行名(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144
    ##rowData 名称(0)：
    ##列名(45)：TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ...
    ##colData 名称（1）：group
  5. 执行分析。
    dds <- DESeq(dds)
  6. 生成结果表格。
    res_DESeq2 <- data.frame(results(dds))

    head(res_DESeq2)
    ## 基因平均表达量 log2倍数变化 lfcSE 统计量 p值 padj
    ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02
    ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03
    ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01
    ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03
    ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01
    ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11
    注意：结果将保存在 "res_DESeq2"，包括标准化读数计数的均值（baseMean）、对数倍数变化值（log2FoldChange）、对数倍数变化的标准误（lfcSE）、沃尔德统计量（stat）、原始 p 值（pvalue）和校正后 p 值（padj）
  7. 鉴定差异表达基因。
    res_DESeq2$sig = as.factor(
     ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs(res_DESeq2$log2FoldChange) > 2,
       ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2，“上”，“下”），“否”）
    summary(res_DESeq2$sig)
    ##向下而非向上
    ##1616 16110 2938
  8. 将结果表格输出到文件中。
    write.csv(res_DESeq2, file = 'res_DESeq2.csv')
  9. 创建火山图。
    火山图（res_DESeq2，"log2倍数变化","padj",2,0.05)
  10. 点击 导出 保存火山图。

5. 维恩图

  1. 点击 Run 以安装 R 软件包 "VennDiagram"。
    install.packages("VennDiagram")
  2. 点击 Run 以加载 R 软件包 "VennDiagram"。
    library (VennDiagram)
  3. 绘制上调差异表达基因（DEGs）的维恩图。
    grid.newpage()
    grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_
    limma[res_limma$sig=="up",]),
      edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]),
      DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig==
      "up",])),
     NULL,height = 3,width = 3,units = "in",
     col="black",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00",
     "#993366"),
     alpha=c(0.5, 0.5, 0.5),main = "上调差异表达基因（DEGs）"))
  4. 点击 Export 以保存维恩图。
  5. 绘制下调差异表达基因（DEGs）的维恩图。
    grid.newpage()
    grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_
    limma[res_limma$sig=="down",]),
       edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig==
    "down",]),
       DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="down",])),
     NULL,height = 3,width = 3,units = "in",
     col="black",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00",
    "#993366"),
     alpha=c(0.5, 0.5, 0.5),main = "下调差异表达基因（DEGs）"))
  6. 点击 Export 以保存维恩图。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可视化差异表达分析结果的方法有多种，其中火山图和维恩图尤为常用。limma 在 |logFC|≥2 且 adj.P.Val <0.05 的阈值下，鉴定出胆管癌（CHOL）组织与正常组织之间共有 3323 个差异表达基因（DEGs），其中 1880 个在 CHOL 组织中下调，1443 个上调（图 1a）。同时，edgeR 鉴定出 1578 个下调的 DEGs 和 3121 个上调的 DEGs（图 1b）；DESeq2 鉴定出 1616 个下调的 DEGs 和 2938 个上调的 DEGs（图 1c）。比较这三种方法的结果，发现共有 1431 个上调的 DEGs 和 1531 个下调的 DEGs 重叠（图 2）。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过RNA-seq差异分析可轻松识别癌症中大量异常转录本5。然而，RNA-seq差异表达分析的应用常受到限制，因其需要掌握R语言技能并具备选择合适方法的能力。为解决这一问题，本文详细介绍了三种最常用的方法（limma、EdgeR和DESeq2），并提供了应用RNA-seq差异表达分析的教程。这将有助于理解三种方法之间的异同，帮助研究者为自身数据选择合适的方法，并深入理解复杂的动态生物学过程。

本文介绍了一种通过limma、edgeR和DESeq2分别进行RNA-seq差异表达分析的详细实验方案，共分为五个阶段：（i）数据的下载与预处理，（ii）-（iv）分别使用limma、edgeR和DESeq2进行差异表达分析，（v）通过维恩图比较这三种方法的分析结果。

这三种方法在差异表达分析过程中既有相似之处，也有不同的步骤。limma 使用线性模型进行统计，适用于所有基因表达技术，包括微阵列、RNA-seq 和定量 PCR8,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该稿件此前未发表过，也未在其他地方考虑发表。所有作者均对本稿件的重要知识内容做出了贡献，并已阅读和批准最终稿件。我们声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究得到了 国家 自然 科学 基础 的 中国 （资助 No. 81860276）和国家重点研发计划重点专项基金项目&D 计划（资助） No. 2018YFC1003200）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
R版本 3.6.2免费软件
Rstudio免费软件

参考文献

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Limma EdgeR DESeq2

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