三种用于RNA测序的差异表达分析方法：limma、EdgeR、DESeq2

摘要

提供了用于RNA测序的差异表达分析方法的详细方案：limma、EdgeR、DESeq2。

摘要

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，能够揭示基因改变与复杂生物学过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后评估和治疗中具有重要价值。RNA-seq数据的差异分析对于识别异常转录至关重要，limma、EdgeR和DESeq2是进行差异分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要掌握一定的R语言技能以及选择合适方法的能力，而这些内容在医学教育课程中尚属欠缺。

本文提供了利用 limma、DESeq2 和 EdgeR 分别鉴定胆管癌（CHOL）与正常组织之间差异表达基因（DEGs）的详细实验方案，结果以火山图和维恩图展示。limma、DESeq2 和 EdgeR 这三种分析流程总体相似，但在分析过程的具体步骤上存在差异。例如，limma 采用线性模型进行统计分析，而 edgeR 和 DESeq2 则使用负二项分布模型。此外，EdgeR 和 limma 需要输入经标准化的 RNA-seq 计数数据，而 DESeq2 则无需预先标准化的数据。

本文提供了三种差异分析方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细实验方案。这三种方法的分析结果部分重叠。每种方法均有其优势，方法的选择仅取决于具体的数据情况。

引言

RNA测序（RNA-seq）是转录组学中最广泛使用的技术之一，具有诸多优势（例如，数据可重复性高），并极大地加深了我们对复杂生物过程功能与动态的理解^1,2。在不同生物学背景下识别异常转录本（也称为差异表达基因，DEGs）是RNA-seq分析中的关键步骤。RNA-seq使得深入理解与发病机制相关的分子机制和生物学功能成为可能。因此，差异分析被认为在肿瘤的诊断、预后评估和治疗中具有重要价值^3,4,5。目前，已有越来越多的开源R/Bioconductor软件包被开发用于RNA-seq差异表达分析，尤其是limma、DESeq2和EdgeR^1,6,7。然而，差异分析需要掌握一定的R语言技能以及选择合适方法的能力，而这些内容在医学教育课程中尚属欠缺。

本方案基于从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）提取的胆管癌（CHOL）RNA-seq 计数数据，分别使用R程序....

方案

注意：打开 R-studio 程序并加载 R 文件 "DEGs.R"，该文件可从补充文件/脚本中获取。

1. 数据下载与预处理

1. 从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）下载胆管癌（cholangiocarcinoma, CHOL）的高通量测序（HTSeq）计数数据。此步骤可通过以下 R 代码轻松实现。
   1. 点击 运行 以安装 R 软件包。
   2. 点击 运行 以加载 R 软件包。
      if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
       + install.packages("BiocManager")
      BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SummarizedExperiment"))
   3. 设置工作目录。
      library (TCGAbiolinks)
      library(SummarizedExperiment)
      setwd("C:/Users/LIUSHIYI/Desktop")
   4. 选择癌症类....

结果

可视化差异表达分析结果的方法有多种，其中火山图和维恩图尤为常用。limma 以 |logFC|≥2 且 adj.P.Val <0.05 为阈值，在 CHOL 组织与正常组织之间共鉴定出 3323 个差异表达基因（DEGs），其中 1880 个在 CHOL 组织中下调，1443 个上调（图 1a）。同时，edgeR 鉴定出 1578 个下调的 DEGs 和 3121 个上调的 DEGs（图 1b）；DESeq2 鉴定出 1616 个下调的 DEGs 和 2938 个上调的 DEGs（图 1c）。比较这三种方法的结果，共有 1431 个上调的 DEGs 和 1531 个下调的 DEGs 重叠（图 2）。

讨论

通过RNA-seq差异分析可轻松识别癌症中大量异常转录本⁵。然而，RNA-seq差异表达分析的应用常受到限制，因其需要掌握R语言技能并具备选择合适方法的能力。为解决这一问题，本文详细介绍了三种最常用的方法（limma、EdgeR和DESeq2），并提供了应用RNA-seq差异表达分析的教程。这将有助于理解三种方法之间的异同，帮助研究者为自身数据选择合适的方法，并深入理解复杂的动态生物学过程。

本文介绍了一种通过limma、edgeR和DESeq2分别进行RNA-seq差异表达分析的详细实验方案，共分为五个阶段：（i）数据的下载与预处理，（ii）-（iv）分别使用limma、edgeR和DESeq2进行差异表达分析，（v）通过维恩图比较这三种方法的分析结果。

这三种方法在差异表达分析过程中既有相似之处，也有不同的步骤。limma 使用线性模型进行统计，适用于所有基因表达技术，包括微阵列、RNA-seq 和定量 PCR^8,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
R		版本 3.6.2	免费软件
Rstudio			免费软件