RNA 测序的三种微分表达分析方法:利马、边缘、DESeq2

Summary

提供了RNA测序的微分表达分析方法的详细协议:伽利马、EdgeR、DESeq2。

Abstract

RNA测序（RNA-seq）是转录学中最广泛使用的技术之一，因为它可以揭示基因改变与复杂的生物过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后和治疗方面具有重要价值。RNA-seq 数据的微分分析对于识别异常转录至关重要，而 limma、EdgeR 和 DESeq2 是微分分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。

在此，我们提供详细的协议，以确定胆管癌 （CHOL） 和正常组织之间通过伽马， DESeq2 和 EdgeR 的差异表达基因 （DEG）， 结果在火山地块和维恩图中显示。伽马、DESeq2 和 EdgeR 这三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，线性模型用于伽马体的统计，而负二元分布用于边缘R和DESeq2。此外，正常化的RNA-seq计数数据对于 EdgeR 和 limma 是必要的，但对于 DESeq2 来说不是必要的。

在这里，我们为三种微分分析方法提供了详细的协议:伽利马、EdgeR 和 DESeq2。这三种方法的结果是部分重叠的。这三种方法都有各自的优势，方法的选择只取决于数据。

Introduction

RNA测序（RNA-seq）是转录学中应用最广泛的技术之一，具有许多优点（例如，高数据可重复性），并极大地增进了我们对复杂生物过程^1、2的功能和动力学的理解。在不同的生物背景下识别异常记录（也称为微分表达基因 ）是RNA-seq分析的关键步骤。RNA-seq 使深入了解发病机制相关的分子机制和生物功能成为可能。因此，差异分析被认为是有价值的诊断，预后和治疗肿瘤^3，4，5。目前，更多的开源R/生物导体包已经开发为RNA-seq差分表达分析，特别是利马，DESeq2和EdgeR 1，6，7。然而，差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。

在本协议中，根据从癌症基因组图集 （TCGA） 中提取的胆管癌 （CHOL） RNA-seq 计数数据，R 程序¹¹分别执行了三种最已知的方法（limma

Protocol

注:打开 R 工作室程序并加载 R 文件"DEGs.R"，该文件可以从补充文件/脚本中获取。

1. 数据的下载和预处理

1. 从癌症基因组图集 （TCGA） 下载胆管癌 （CHOL） 的高通量测序 （HTSeq） 计数数据。此步骤可以通过以下 R 代码轻松实现。
   1. 单击 "运行" 以安装 R 包。
   2. 单击 "运行" 以加载 R 包。
      如果 （！ 需要命名空间 （"生物经理"， 悄悄地] 真实））
      • 安装.包（"生物经理"）
      生物管理器::安装（c（"TCGAbiolinks"、"总结经验"））
   3. 设置工作目录。
      图书馆（TCGAbiolinks）
      图书馆（总结经验）
      设置（"C:/用户/LIUSHIYI/桌面"）
   4. 选择癌症类型。
      癌症< - "Tcga - chol"
   5. 运行来自"GDCquery.R"文件的 R 代码以下载数据。文件"GDCquery.R"可以从补充文件/脚本中获取:
      来源（"补充文件/脚本/GDCquery.R"）
      头 （cnt）
      ##TCGA-3X-AAVA-01A-11r-A41I-07
      ##ENSG00000000003 4262
      ##ENSG00000000005 1
      ##ENSG0000000....

Results

有各种方法可视化差异表达分析的结果，其中火山图和维恩图特别使用。利马用|logFC|≥2和adj识别了 CHOL 和正常组织之间的 3323 个 DEG。P.Val<0.05作为阈值，其中1880个在CHOL组织中被降低调节，1443个被调高（图1a）。同时，EdgeR 确定了 1578 个下监管 DEG 和 3121 个向上监管的 DEG（图 1b）:DESeq2 确定了 1616 个下行监管的 DEG 和 2938 个向上监管的 DEG（图 1c）。比较这三种方法的结果，1431个上调的DEG和1531个下调节的DEG是重叠的（图2）。

Discussion

丰富的癌症异常记录可以通过RNA-seq差分分析⁵轻松识别。但是，RNA-seq 差分表达分析的应用往往受到限制，因为它需要具有某些 R 语言技能和选择适当方法的能力。为了解决这个问题，我们提供了三种最已知的方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细介绍，以及应用 RNA-seq 差分表达分析的教程。这将促进理解所有三种方法的相似性和差异，使选择适合单个数据的方法，并使我们能够了解复杂的动态生物过程。

在这里，我们分别通过 limma、边缘R 和 DESeq2 提出通过 RNA-seq 差分表达分析的详细协议，分为五个阶段:（i） 数据的下载和预处理:（ii-iv） 通过 limma、边缘和 DESeq2 进行差分表达分析，（v） 分别通过 Venn 图对这三种方法的结果进行比较。

这三种方法在差异表达分析过程中具有相似和不同的步骤。线性模型用于伽马体的统计，适用于所有基因表达技术，包括微阵列、RNA-seq和定量PCR^{8、13，<.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
R		版本 3.6.2	免费软件
Rstudio			免费软件