方法文章

小鼠口腔黏膜类器官培养物的生成与表征

DOI：

10.3791/62529

⸱

2021年7月31日

 ,  , 
1Mildred Scheel Early Career Centre (MSNZ) for Cancer Research, IZKF/MSNZ, University Hospital Würzburg

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种从成年小鼠舌部上皮组织衍生的口腔黏膜类器官培养物的生成与表征方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

覆盖口腔内壁的黏膜层，即口腔黏膜，是一种高度区域化的组织，可分为颊黏膜、牙龈、唇部、腭部和舌部。其最表层为口腔上皮，由成体干细胞终生维持。成体上皮干细胞的增殖与分化已通过以下方法被广泛研究 体内 小鼠模型以及基于二维（2D）饲养细胞的 体外 模型。与这些方法相辅相成的是类器官技术，该技术将成体干细胞嵌入富含细胞外基质（ECM）的水凝胶中，并提供含有特定生长因子组合的培养基。在此条件下，成体干细胞增殖并自发形成三维（3D）细胞簇，即所谓的类器官。类器官培养最初由小鼠小肠上皮干细胞建立，但该方法现已拓展至其他类型的上皮干细胞。本文描述了一种小鼠口腔黏膜类器官培养物的建立与表征方案。从小鼠舌组织中分离原代上皮细胞，将其嵌入ECM水凝胶中，并在含有表皮生长因子（EGF）、R-spondin和成纤维细胞生长因子（FGF）10的培养基中进行培养。在初次接种后7至14天内，所形成的类器官即可传代以进一步扩增或冻存。我们还提供了通过3D全组织成像和基因表达分析对已建立的类器官培养物进行表征的技术策略。本方案可作为研究口腔上皮干细胞行为的工具 离体 以还原论的方式。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

口腔黏膜是覆盖口腔内壁的黏膜层，作为消化道的入口，参与消化过程的启动1,2。此外，口腔黏膜还充当人体与外界环境之间的屏障，可抵御物理、化学和生物因素的侵害1。根据功能和组织学特征，哺乳动物的口腔黏膜可分为三种类型：咀嚼黏膜（包括硬腭和牙龈）、被覆黏膜（覆盖软腭表面、舌腹面和颊部表面）以及特殊黏膜（覆盖舌背表面）2。所有口腔黏膜组织均由两层构成：表层的复层鳞状上皮和其下方的固有层1。口腔上皮角质形成细胞是上皮中的主要细胞类型，也是朗格汉斯细胞等上皮内免疫细胞的所在位置1。间质部分即固有层，包含成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞和免疫细胞等多种细胞类型1。与其他复层上皮一样，口腔上皮的干细胞和前体细胞位于基底层1。这些特化的细胞能够通过细胞分裂替代丢失的组织，从而维持成体生命过程中的细胞更新3。与其他上皮（如肠上皮4 或皮肤表皮5）相比，口腔上皮的研究仍较为有限。然而，近期研究发现了一些标记小鼠口腔上皮干细胞和前体细胞的基因，如 Krt14, Lrig1、Sox2、Bmi1、 和 Gli11,6,7,8。由于口腔上皮是口腔癌的起源部位，并在黏膜炎症、损伤与再生过程中发挥关键作用1，深入理解其基本细胞生物学特性，对于开发潜在的新疗法和药物发现至关重要。

动物模型已广泛用于口腔黏膜上皮的基础研究1。例如，前述的口腔上皮干细胞及祖细胞标志物，主要通过遗传谱系示踪小鼠模型得以定义1,6,7,8,9。然而，使用人源或鼠源细胞进行的体外（ex vivo）研究方法也已被广泛应用10。传统上，这类细胞培养工作主要依赖于源自口腔鳞状细胞癌（OSCC）的细胞系，或由（自发或基因诱导）永生化的原代细胞所建立的细胞系10。这些二维（2D）细胞培养方法在研究成体稳态方面存在若干重要局限性：（1）细胞永生化伴随显著的遗传不稳定性；（2）分化能力有限；（3）需要饲养层细胞；（4）培养基成分大多未明确定义，且含有血清11。综上所述，这些传统的体外（in vitro）金标准方法无法在不损害上皮干细胞增殖与分化能力、也不改变其野生型基因组的前提下，实现其长期培养。

类器官技术已发展成为一种用于建立接近天然上皮组织培养的工具 体外11在2009年的研究中，Sato等人描述了首个上皮类器官培养系统12其方法基于利用Wnt/β-catenin信号通路靶基因标记的单个小肠干细胞进行包埋 Lgr513 到富含三维细胞外基质（ECM）的水凝胶中12通过提供含有对干性至关重要的特定生长因子组合，接种的成体上皮干细胞在培养中得以充分增殖12最终，活跃增殖的干细胞形成了包含所有主要肠上皮细胞类型的细胞簇。12，有效模拟来源组织的特性11与传统的二维培养相比，类器官技术可在无饲养层条件下，使用无血清且成分完全明确的培养基，实现小鼠肠道上皮干细胞的长期维持10,11此外，该方法不会显著改变培养的干细胞的遗传组成或表型。11此外，长期培养保留了干细胞的增殖和分化能力，且无需进行细胞永生化处理。11在短短十余年的时间里，这一早期的上皮类器官培养体系经过改进，已可用于培养来自多种其他上皮组织的成体干细胞，例如结肠（大肠）12,14,15子宫内膜16肝脏17,18，肺19,20乳腺21，卵巢22，胰腺23,24皮肤表皮25和胃26. 尽管大多数方案使用来自人类等哺乳动物的成年上皮干细胞11,27，小鼠11，猫28，狗29和猪30甚至已经可以从蛇毒腺中生成上皮类器官31类器官技术已成为一种广泛应用且具有高度通用性的干细胞培养方法11. 由于上皮类器官在很大程度上保持其遗传特性32,33 且表型稳定，是基因编辑的理想模型34,35 研究基因功能36 或肿瘤发生27,37,38,39,40此外，类器官培养物可被移植到小鼠体内37,41 用于研究宿主-微生物相互作用42 （包括病原体感染）43,44,45）。此外，将类器官与微环境细胞（如免疫细胞）进行共培养46,47,48 和成纤维细胞49,50 已有相关描述。在疾病研究中，类器官已被用于建立活体组织生物样本库21,22,51 以及药物测试27 用于评估疗效52,53 毒性和毒性作用54.

在本实验方案中，我们描述了一种优化的方法，用于从小鼠舌上皮建立和维持口腔黏膜类器官培养。该方法基于先前报道的通过酶消化法分离舌上皮的技术55 ，以及从小鼠和人源口腔黏膜上皮衍生类器官的方法52,53。小鼠口腔黏膜类器官的生长培养基中含有维持干细胞状态的关键因子。R-spondin 可激活 Wnt/β-catenin 信号通路5，而表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）10 是细胞因子，也是受体酪氨酸激酶的配体，能够刺激包括 MAPK/ERK 通路和 PI3K/AKT/mTOR 通路在内的多种信号通路25。我们还详细描述了如何通过基因和蛋白质表达分析对类器官培养物进行表征，并将其与来源组织进行比较。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

此处描述的所有方法均符合欧盟和德国关于动物实验的法律法规。

注意：准备操作区域，包括无菌外科器械（精细镊子、精细剪刀和手术刀）以及盛有冷PBSO的培养皿。将BME在4 °C或冰上过夜解冻，并保存至使用前。在开始细胞分离前，将细胞培养板置于培养箱中预热过夜。所有材料均列于 材料表中。

1 小鼠口腔黏膜类器官培养体系的建立

  1. 小鼠舌头的解剖
    1. 根据机构指南以及相应的国家和政府间法规对小鼠实施安乐死。
      ​注意：本方案中，小鼠通过暴露于CO2 进行安乐死，因为颈椎脱位可能导致头部不稳定，从而给器官采集带来困难。
    2. 将小鼠仰卧放置，并用大头针将其四肢固定在合适的衬垫上。
    3. 用70%乙醇喷洒小鼠全身，直至完全湿润，以完成消毒。
    4. 使用剪刀切开皮肤，首先沿气管方向从胸骨垂直剪至嘴唇，然后在两侧从气管向锁骨水平剪开。每次切口长约2 cm。
    5. 拨开毛发以暴露下颌。
    6. 剪开下颌肌肉，直至口腔后部。
    7. 使用两把镊子分别向相反方向牵拉上下颌，尽可能张开口腔，使下颌脱位。
    8. 用钝头镊子夹住舌头，并从舌后部垂直剪切，尽可能完整地取出舌头。
    9. 将舌头置于不含Mg2+和Ca2+的冷磷酸盐缓冲液（PBSO）中。
    10. 将舌头水平切开，分离背侧和腹侧舌黏膜。
      注意：背侧舌黏膜为舌头的上表面，腹侧舌黏膜为与口腔底接触的下表面。两者可通过形态学区分：背侧舌黏膜表面明显粗糙，而腹侧舌黏膜表面光滑。腹侧舌黏膜覆盖面积小于背侧舌黏膜（腹侧舌约5 × 2 mm；背侧舌约8 × 3 mm）。
    11. 可选：将舌头的一部分用固定剂（如4%多聚甲醛）或用于冷冻保存的OCT包埋介质固定。
    12. 可选：将组织碎片速冻，于-80 °C保存，用于后续RNA或蛋白质提取。
  2. 消化以分离上皮层与固有层
    1. 配制新鲜的酶混合液，含1 mg/mL胶原酶A和2 mg/mL Dispase II，溶于PBSO中，并在使用前将溶液预热至37 °C。
    2. 使用26 G针头，从舌头后端切口处向黏膜下层注射至少500 μL酶混合液。
    3. 将针头深入组织，穿透固有层并小心进入其下方的肌肉，保持与上皮层平行。
    4. 在缓慢回撤针头的同时注射酶液。
      ​注意：组织颜色变浅并出现明显膨胀 表明消化酶已充分注入。此外，上皮下出现透明区域也提示注射成功。
    5. 可重复注射最多五次。
    6. 将组织转移至含有相同酶混合液的2 mL微量离心管中。
    7. 在37 °C摇床（300 rpm）中孵育1小时。
    8. 将组织转移至含有PBSO的培养皿中。
    9. 用镊子夹住肌肉和舌尖，小心地将肌肉从上皮层剥离。若在后端切口处遇到阻力，可用钝头镊子轻轻抬起上皮层。
    10. 用PBSO清洗分离的上皮组织，并进行后续实验。若用于类器官培养，请进入步骤1.3.1；若用于组织全装片制备，请进入步骤4.1.1。
  3. 从小鼠原代组织建立口腔黏膜类器官
    1. 将上皮组织切成约2 × 2 mm大小的小块。
    2. 将组织加入含0.125%胰蛋白酶的PBSO中，在37 °C下进行消化。
      注意：消化时间不应超过30分钟。
    3. 每10分钟轻轻振荡一次，定期检查消化情况。
    4. 当混合液变浑浊（取决于组织量）或观察到细胞团块时，通过涡旋5秒并吹打10–20次进一步分散组织。
    5. 加入10 mL Advanced DMEM/F12+++培养基进行一次洗涤。
    6. 立即使用70 µm细胞筛过滤细胞悬液。
    7. 在4 °C下以350 × g离心5分钟。
    8. 弃去上清液，将细胞重悬于1 mL Advanced DMEM/F12+++培养基中用于计数。
    9. 使用Neubauer计数板或等效方法进行细胞计数。
    10. 在4 °C下以350 × g离心5分钟，吸除上清液。
    11. 将细胞沉淀重悬于BME中（保持BME在冰上以防止凝固）。根据细胞数量计算所需BME体积（约10,000个细胞/40 µL BME）。若无法完全吸除培养基，可用100 µL移液器小心吸除残留液体。
      ​注意：BME浓度不应低于70%，否则可能导致凝固不充分。
    12. 使用P100移液器将细胞以10 µL液滴形式接种于预热的细胞培养（悬浮）板底部。
    13. 将培养板倒置于培养箱中30分钟至1小时，使BME充分凝固。
    14. 新鲜配制所需的小鼠口腔黏膜类器官培养基，并加入ROCK抑制剂和Primocin（参见材料表和表1）。
    15. BME凝固后，将预热的培养基沿孔壁小心加入细胞液滴中，避免液滴脱落。
    16. 将培养板置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。
    17. 每2–3天更换一次培养基。前两次传代期间，ROCK抑制剂和Primocin需持续保留在培养基中。

小鼠口腔黏膜类器官的传代、冷冻保存与解冻

  1. 小鼠口腔黏膜类器官培养物的传代
    1. 小鼠口腔黏膜类器官在初次接种后10至12天之间可进行首次传代。
    2. 传代时，使用P1000移液器将基底膜基质（BME）液滴重悬于培养基中，并转移至含有2 mL冰浴PBSO的15 mL锥形管中。
    3. 加入5 mL冰浴的Advanced DMEM/F12+++培养基补足体积。
    4. 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，收集类器官。
    5. 吸除上清液，使用含0.125%胰蛋白酶的PBSO消化类器官。
    6. 将沉淀重悬于1 mL 0.125%胰蛋白酶溶液中，37 °C孵育直至类器官解离成小块，每2分钟检查一次消化情况。
    7. 使用P1000移液器上下吹打20–30次，充分重悬细胞悬液，并使用P200移液器重复剧烈重悬操作。
    8. 用10 mL Advanced DMEM/F12+++培养基洗涤细胞。
    9. 可选：直接使用70 µm细胞筛过滤细胞悬液，以获得均一的单细胞悬液。
    10. 在4 °C条件下，以350 × g离心5分钟，收集细胞。
    11. 吸除上清液，将沉淀重悬于BME中，并按照步骤1.3.8–1.3.17所述继续培养类器官。
  2. 小鼠口腔黏膜类器官培养物的冷冻保存与复苏
    1. 进行冷冻保存时，让小鼠口腔黏膜类器官在传代后生长3–5天。
    2. 按照步骤2.1.2–2.1.4所述方法将类器官从培养板中分离。
    3. 离心后，将类器官重悬于1 mL冻存液（含10% FCS和10% DMSO的Advanced DMEM/F12+++培养基）中，并将细胞悬液转移至2 mL冻存管中。
    4. 将细胞置于-80 °C的适当冻存容器中，保存时间不超过24小时；如需长期保存，应将细胞储存在-120 °C以下，例如液氮罐中。
    5. 在37 °C条件下快速复苏冻存细胞，并立即将细胞悬液转移至含有9 mL预热Advanced DMEM/F12+++培养基的锥形 管中。
    6. 在4 °C条件下，以350 × g离心5分钟，收集细胞悬液。
    7. 弃去上清液，并按照步骤1.3.8–1.3.17所述继续处理类器官。

小鼠口腔黏膜组织和类器官的3个基因表达分析

  1. 从小鼠口腔黏膜类器官及原代组织中提取RNA
    1. 按照步骤2.1.2-2.1.4所述方法收获小鼠口腔黏膜类器官。
    2. 弃去上清液，并用预冷的PBSO洗涤类器官。
    3. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
    4. 为从原代组织中分离RNA，请使用已分离的上皮组织（见步骤1.2.10）。
    5. 将组织切成2 mm × 2 mm的小片。
    6. 进行RNA提取时，采用已建立的方法或试剂盒：分别将类器官或组织小块重悬于350 µL或700 µL裂解缓冲液中。
    7. 剧烈涡旋震荡裂解后的类器官至少10秒，组织裂解至少30秒。
    8. 将溶液置于-80 °C下冷冻至少2小时。
    9. 在冰上解冻细胞裂解液，并根据试剂盒说明书继续进行RNA提取。
  2. 通过逆转录反应合成cDNA
    1. 测定RNA浓度，并计算总RNA上样量为0.1–1 µg所需的体积。
    2. 进行cDNA合成时，按照试剂盒说明书使用cDNA合成试剂盒。本实验采用以下体系：5×反应混合液4 µL，逆转录酶1 µL，总RNA（0.1–1 µg）x µL，无核酸酶水补足至终体积20 µL。
    3. 采用三步循环程序进行逆转录：25 °C反应5分钟，42 °C反应30分钟，85 °C反应5分钟。
    4. cDNA储存于-20 °C。
  3. 通过定量实时PCR进行基因表达分析
    1. 进行定量实时PCR时，所有反应均需设置技术重复。
    2. 配制反应混合液，包含：qPCR Supermix 5 µL，反向引物（400 nM）1 µL，正向引物（400 nM）1 µL，cDNA（10–20 ng/孔）1 µL，无核酸酶水2 µL。
    3. 扩增程序采用标准设置：95 °C预变性30秒；随后40个循环：95 °C变性5–10秒，60 °C退火/延伸并读板60秒。熔解曲线分析条件为：65–95 °C，每步升温0.5 °C，每步停留2–5秒（或采用荧光定量PCR仪默认设置）。
    4. 采用合适的方法分析数据，如ΔCt法或ΔΔCt法56 ，或根据说明书使用荧光定量PCR仪配套的分析软件进行分析。

小鼠口腔黏膜组织和类器官的4种蛋白质表达分析

注意：舌上皮组织的整体染色在24孔板中进行，每一步均用镊子将组织从一个孔转移至另一个孔。

  1. 小鼠口腔黏膜组织和类器官培养物的固定
    1. 对于组织全 mount 染色，从步骤 1.2.10 开始，并继续进行步骤 4.1.5。
    2. 对于类器官染色，按照步骤 2.1.2 所述收获类器官，并继续进行步骤 4.1.3。
    3. 用 10 mL PBSO 补充细胞悬液。
    4. 在 4 °C 条件下以 350 × g 离心细胞悬液 5 分钟，并弃去上清液。
    5. 在室温（21 °C）下用 4% 多聚甲醛固定上皮组织或类器官 30 分钟。
    6. 用 PBSO 洗涤样品一次。在 4 °C 条件下以 350 × g 离心类器官 5 分钟，并弃去上清液。
  2. 小鼠口腔黏膜组织和类器官培养物的全 mount 染色
    1. 在室温下将样品置于 0.2% Triton X-100 溶液中孵育 20 分钟，以暴露抗原表位。
    2. 将样品转移至封闭液（含 5% 驴血清的 PBSO）中，在室温下孵育 1 小时。
    3. 用封闭液稀释一抗，并在 4 °C 条件下与样品于抗体溶液中孵育过夜。
    4. 用洗涤缓冲液（含 0.1% Tween-20 和 1% PBSO 的 ddH2O）洗涤细胞或组织三次，每次 5 分钟。
    5. 用 PBSO 按 1:400 稀释二抗。
    6. 在室温下将样品与二抗溶液孵育 3 小时。
    7. 重复步骤 4.2.4 的洗涤步骤。对于组织样品，继续进行步骤 4.2.8；对于类器官样品，继续进行步骤 4.2.9。
    8. 将上皮组织放置在载玻片上，基底侧（原本附着于固有层的一侧）朝上。使用含 DAPI 的水性封片剂封片，并加盖盖玻片。继续进行步骤 4.2.11。
    9. 对于类器官样品，将染色后的类器官重悬于任何可在室温下固化的合适凝胶基质中。
    10. 迅速将液滴（5 µL/孔）移入 96 孔玻璃底板中。将板置于冰上，使凝胶基质固化 15 分钟。每孔加入 100 µL 含 DAPI 的水性封片剂，对类器官进行封片。
    11. 将染色后的样品置于 4 °C 避光保存，直至进行图像分析。

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结果

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本方案描述了使用酶混合液将舌部上皮与下方的固有层及肌肉组织分离的方法（图1）。分离得到的上皮组织可用于类器官的培养，也可用于多种基因和蛋白分析。同样，消化后的固有层和肌肉层也可用于后续选定的实验操作。

对于类器官培养，舌上皮组织需进一步用胰蛋白酶溶液消化为小细胞团块（约2-3个细胞）。完全消化成单个细胞并不推荐，因为这可能对类器官的生长产生不利影响52,53。将所得的细胞悬液接种至基底膜水凝胶中（图2A），随后使其凝固，形成富含细胞外基质的三维支架，以支持类器官生长。在7至14天内，源自小鼠舌上皮的口腔黏膜类器官将发育为具有角化内核的较大致密类器官（图2A）。

已建立的类器官培养物可通过传代进行维持。使用0.125%的胰蛋白酶溶液，可...

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讨论

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组织消化
胶原酶消化有助于将上皮组织与下方的固有层和肌肉组织分离。此步骤可实现原始组织与后续生成的口腔黏膜类器官之间的更好比较。由于酶消化过度会影响成体上皮干细胞形成类器官的能力，我们建议胶原酶孵育时间不超过1 h，胰蛋白酶消化时间不超过30 min。经过胶原酶消化后，上皮组织非常脆弱，因此在分离上皮时需格外小心，以避免将其撕裂。在显微镜下检查分离效果时，应评估结缔组织（通常呈灰白色）是否已从舌上皮脱离。此外，舌背侧的特化上皮与舌腹侧的衬里上皮通过覆盖舌侧缘的过渡区相连。因此，在进一步处理上皮组织时，需注意舌背侧与舌腹侧的上皮无法完全分离。

类器官形态与操作
与小鼠皮肤表皮类器官25类似，口腔黏膜类器官以紧凑方式生长，不呈现其他上皮类器官培养中所描述的囊状球形表型11,12,

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.K. 是一项与类器官技术相关且正在申请中的专利的发明人。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢Sabine Kranz提供的协助。我们感谢IZKF W的共聚焦显微镜与基于流式细胞术的细胞分选核心单元ü感谢rzburg对本研究的支持。本工作由德国癌症援助基金会（通过维尔茨堡IZKF/MSNZ资助K.K.）提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>培养基 &和媒体组件
高级杜尔贝科培养基’DMEM/F12培养基赛默飞世尔科技 12634-028
B27 补充剂 赛默飞世尔科技17504-044
GlutaMAX-I（100倍浓缩液）赛默飞世尔科技35050-038
HEPES赛默飞世尔科技15630-056
N-乙酰-L-半胱氨酸Sigma AldrichA9165
烟酰胺Sigma AldrichN0636
青霉素/链霉素 赛默飞世尔科技15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc 融合蛋白条件培养基U-Protein Express BVR001
重组人EGFPreprotechAF-100-15
重组人 FGF-10Preprotech100-26
ROCK（Rho 激酶）抑制剂 Y-27632 二盐酸盐Hölzel BiotechM1817
<强>抗体 
角蛋白-14 多克隆抗体 100µlBiozolBLD-905301
E-钙黏蛋白抗体Bio-TechneAF748
纯化小鼠抗-Ki-67 克隆 B56  (0.1 mg)BD生物科学556003
ALEXA FLUOR 594 驴抗小鼠赛默飞世尔科技A21203
ALEXA FLUOR 647 驴抗兔赛默飞世尔科技A31573
ALEXA FLUOR 488 驴抗山羊赛默飞世尔科技A110555
<强>试剂 / 化学品
BME 第2型，RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
二甲基亚砜（DMSO）Sigma Aldrich34943-1L-M
胶原酶A 罗氏10103578001
驴血清Sigma AldrichS30-100ML
磷酸盐缓冲液（PBS）赛默飞世尔科技100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
乙醇，变性（96 %）卡尔·罗斯T171.3
中性缓冲甲醛溶液，10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express 酶（1×），酚红赛默飞世尔科技12605-010
二甲苯Sigma Aldrich534056-500ML
<强>设备及其他
细胞培养12孔多孔板Greiner BioOne392-0047
细胞滤网：100 µmVWR732-2759
盖玻片VWR631-1569P
玻璃底微孔板 VE=10 4580康宁13539050
目标载玻片：Superfrost PlusVWR631-0108P

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
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