小鼠口腔黏膜类器官培养物的生成与表征

摘要

我们介绍一种从成年小鼠舌部上皮组织衍生的口腔黏膜类器官培养物的生成与表征方法。

摘要

覆盖口腔内壁的黏膜层，即口腔黏膜，是一种高度区域化的组织，可分为颊黏膜、牙龈、唇部、腭部和舌部。其最表层为口腔上皮，由成体干细胞终生维持。成体上皮干细胞的增殖与分化已通过以下方法被广泛研究 体内 小鼠模型以及基于二维（2D）饲养细胞的 体外 模型。与这些方法相辅相成的是类器官技术，该技术将成体干细胞嵌入富含细胞外基质（ECM）的水凝胶中，并提供含有特定生长因子组合的培养基。在此条件下，成体干细胞增殖并自发形成三维（3D）细胞簇，即所谓的类器官。类器官培养最初由小鼠小肠上皮干细胞建立，但该方法现已拓展至其他类型的上皮干细胞。本文描述了一种小鼠口腔黏膜类器官培养物的建立与表征方案。从小鼠舌组织中分离原代上皮细胞，将其嵌入ECM水凝胶中，并在含有表皮生长因子（EGF）、R-spondin和成纤维细胞生长因子（FGF）10的培养基中进行培养。在初次接种后7至14天内，所形成的类器官即可传代以进一步扩增或冻存。我们还提供了通过3D全组织成像和基因表达分析对已建立的类器官培养物进行表征的技术策略。本方案可作为研究口腔上皮干细胞行为的工具 离体 以还原论的方式。

引言

口腔黏膜是覆盖口腔内壁的黏膜层，作为消化道的入口，参与消化过程的启动^1,2。此外，口腔黏膜还充当人体与外界环境之间的屏障，可抵御物理、化学和生物因素的侵害¹。根据功能和组织学特征，哺乳动物的口腔黏膜可分为三种类型：咀嚼黏膜（包括硬腭和牙龈）、被覆黏膜（覆盖软腭表面、舌腹面和颊部表面）以及特殊黏膜（覆盖舌背表面）²。所有口腔黏膜组织均由两层构成：表层的复层鳞状上皮和其下方的固有层¹。口腔上皮角质形成细胞是上皮中的主要细胞类型，也是朗格汉斯细胞等上皮内免疫细胞的所在位置¹。间质部分即固有层，包含成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞和免疫细胞等多种细胞类型¹。与其他复层上皮一样，口腔上皮的干细胞和前体细胞位于基底层¹。这些特化的细胞能够通过细胞分裂替代丢失的组织，从而维持成体生命过程中的细胞更新³。与其他上皮（如肠上皮⁴ 或皮肤表皮⁵）相比，口腔上皮的研究仍较为有限。然而，近期研究发现了一些标....

方案

此处描述的所有方法均符合欧盟和德国关于动物实验的法律法规。

注意：准备操作区域，包括无菌外科器械（精细镊子、精细剪刀和手术刀）以及盛有冷PBSO的培养皿。将BME在4 °C或冰上过夜解冻，并保存至使用前。在开始细胞分离前，将细胞培养板置于培养箱中预热过夜。所有材料均列于 材料表中。

1 小鼠口腔黏膜类器官培养体系的建立

1. 小鼠舌头的解剖
   1. 根据机构指南以及相应的国家和政府间法规对小鼠实施安乐死。
      ​注意：本方案中，小鼠通过暴露于CO₂ 进行安乐死，因为颈椎脱位可能导致头部不稳定，从而给器官采集带来困难。
   2. 将小鼠仰卧放置，并用大头针将其四肢固定在合适的衬垫上。
   3. 用70%乙醇喷洒小鼠全身，直至完全湿润，以完成消毒。
   4. 使用剪刀切开皮肤，首先沿气管方向从胸骨垂直剪至嘴唇，然后在两侧从气管向锁骨水平剪开。每次切口长约2 cm。
   5. 拨开毛发以暴露下颌。
   6. 剪开下颌肌肉，直至口腔后部。
   7. 使用两把镊子分别向相反方向牵拉上下颌，尽可能张开口腔，使下颌脱位。
   8. 用钝头镊子夹住舌头，并从舌后部垂直剪切，尽可能完整地取出....

结果

本方案描述了使用酶混合液分离舌部上皮与其下方固有层及肌肉组织的方法（图1）。分离得到的上皮组织可用于类器官的建立，也可用于多种基因和蛋白分析。同样，消化后的固有层与肌肉层也可用于后续选定的实验操作。

对于类器官培养，舌上皮组织需进一步用胰蛋白酶溶液消化成小细胞团块（约2-3个细胞）。完全消化成单细胞是不可取的，因为这可能对类器官的出芽生长产生不利影响^52,53。将所得的细胞悬液接种至基底膜水凝胶中（图2A），随后使其凝固，形成富含细胞外基质的三维支架，以支持类器官生长。在7至14天内，源自小鼠舌上皮的口腔黏膜类器官将发育为体积更大、结构致密的类器官，并具有角化的核心区域（图2A）。

已建立的类器官培养物可通过传代进行维持。使用0.12.......

讨论

组织消化
胶原酶消化有助于将上皮组织与下方的固有层和肌肉组织分离。此步骤可实现原始组织与后续生成的口腔黏膜类器官之间的更好比较。由于酶消化过度会影响成体上皮干细胞形成类器官的能力，我们建议胶原酶孵育时间不超过1 h，胰蛋白酶消化时间不超过30 min。经过胶原酶消化后，上皮组织非常脆弱，因此在分离上皮时需格外小心，以避免将其撕裂。在显微镜下检查分离效果时，应评估结缔组织（通常呈灰白色）是否已从舌上皮脱离。此外，舌背侧的特化上皮与舌腹侧的衬里上皮通过覆盖舌侧缘的过渡区相连。因此，在进一步处理上皮组织时，需注意舌背侧与舌腹侧的上皮无法完全分离。

类器官形态与操作
与小鼠皮肤表皮类器官²⁵类似，口腔黏膜类器官以紧凑方式生长，不呈现其他上皮类器官培养中所描述的囊状球形表型^11,12,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>培养基 &和媒体组件
高级杜尔贝科培养基’DMEM/F12培养基	赛默飞世尔科技	12634-028
B27 补充剂	赛默飞世尔科技	17504-044
GlutaMAX-I（100倍浓缩液）	赛默飞世尔科技	35050-038
HEPES	赛默飞世尔科技	15630-056
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	A9165
烟酰胺	Sigma Aldrich	N0636
青霉素/链霉素	赛默飞世尔科技	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm1
RSPO3-Fc 融合蛋白条件培养基	U-Protein Express BV	R001
重组人EGF	Preprotech	AF-100-15
重组人 FGF-10	Preprotech	100-26
ROCK（Rho 激酶）抑制剂 Y-27632 二盐酸盐	Hölzel Biotech	M1817
<强>抗体
角蛋白-14 多克隆抗体 100µl	Biozol	BLD-905301
E-钙黏蛋白抗体	Bio-Techne	AF748
纯化小鼠抗-Ki-67 克隆 B56  (0.1 mg)	BD生物科学	556003
ALEXA FLUOR 594 驴抗小鼠	赛默飞世尔科技	A21203
ALEXA FLUOR 647 驴抗兔	赛默飞世尔科技	A31573
ALEXA FLUOR 488 驴抗山羊	赛默飞世尔科技	A110555
<强>试剂 / 化学品
BME 第2型，RGF Cultrex Pathclear	Bio-Techne	3533-005-02
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma Aldrich	34943-1L-M
胶原酶A	罗氏	10103578001
驴血清	Sigma Aldrich	S30-100ML
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	100-100-15
EDTA	Sigma Aldrich	221465-25G
乙醇，变性（96 %）	卡尔·罗斯	T171.3
中性缓冲甲醛溶液，10%	Sigma Aldrich	HT501128-4L
TritonX-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween-20	Sigma Aldrich	P1379-500ML
TrypLE Express 酶（1×），酚红	赛默飞世尔科技	12605-010
二甲苯	Sigma Aldrich	534056-500ML
<强>设备及其他
细胞培养12孔多孔板	Greiner BioOne	392-0047
细胞滤网：100 µm	VWR	732-2759
盖玻片	VWR	631-1569P
玻璃底微孔板 VE=10 4580	康宁	13539050
目标载玻片：Superfrost Plus	VWR	631-0108P