小鼠肝内胰岛移植过程中减少输注后门静脉出血的方法

摘要

本文介绍了在小鼠体内成功实施门静脉内胰岛移植的优化手术步骤。该手术是一种具有临床相关性但技术上具有挑战性的外科操作。

摘要

尽管目前在临床实践中普遍接受肝脏作为人胰岛移植的主要部位，但在大多数啮齿类动物的临床前胰岛移植研究中，胰岛通常被移植至肾包膜下。该模型被广泛使用的原因在于，小鼠肝内胰岛移植在技术上具有挑战性，且术后尤其是移植后穿刺部位出血，可导致较高比例的小鼠死于手术并发症。本研究展示了两种可最大限度减少输注后门静脉出血发生的方法。第一种方法是在注射部位应用可吸收的止血明胶海绵；第二种方法是先将胰岛注射针穿过脂肪组织，再进入门静脉，利用脂肪组织作为物理屏障以阻止出血。这两种方法均能有效防止因出血导致的小鼠死亡。研究展示了完整的肝脏切片，显示了移植后胰岛的分布情况以及胰岛血栓形成的证据，这是肝内胰岛移植的典型特征。这些改进的实验方案优化了肝内胰岛移植的操作流程，可能有助于各实验室建立该技术，用于在临床前条件下研究胰岛的存活与功能。

引言

通过门静脉进行的门静脉内胰岛移植（IIT）是临床环境中人类胰岛移植最常用的方法。小鼠IIT模型为研究胰岛移植以及测试可提高胰岛移植疗效的有前景干预措施提供了极佳的机会¹。IIT最早于20世纪70年代被描述，并由多个研究团队所采用^1,2,3,4,5。在2000年人类胰岛移植取得突破性进展后，该方法重新受到广泛关注^6,7。然而，大多数胰岛移植研究倾向于选择肾包膜下作为实验性胰岛移植的首选部位，因其操作简便且成功率较高。相比之下，IIT技术难度更高，因此在胰岛移植研究中使用较少^8,9。然而，与IIT不同的是，移植至肾包膜下的胰岛不会经历以血栓形成、炎症反应和肝组织缺血为特征的即刻血液介导的炎性反应，因此其功能优于移植至肝脏的胰岛。因此，肾包膜下移植模型可能无法完全模拟人类胰岛移植过程中胰岛所面临的应激环....

方案

所有操作均获得南卡罗来纳医科大学和查尔斯顿拉尔夫·约翰逊医疗中心机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 使用链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病

1. 受体小鼠准备：
   1. 分别称量每只小鼠的体重。
   2. 使用血糖仪检测尾静脉血样中的血糖水平。
2. 三种不同情况下的STZ剂量确定：
   1. 对于患有脂肪肝疾病的小鼠，注射一次链脲佐菌素（STZ）[40 mg/kg/天，腹腔（i.p.）注射] 连续5天。
   2. 对于 NOD-SCID 小鼠，在过夜禁食后，腹腔注射单次剂量为 125 mg/kg 的 STZ。
   3. 对C57BL/6小鼠腹腔注射单次剂量为225 mg/kg的STZ。
3. STZ（13.5 mg/mL）的计算：
   注意：此计算针对5只体重为30 g的C57BL/6小鼠：
   1. 总体重：5只小鼠 × 30克/只 = 150克
   2. 所需STZ：150 g × 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg
4. STZ 的制备：
   1. 根据预先计算的剂量称量STZ。
   2. 将称量好的STZ粉末转移至预冷的10 mL烧杯中，置于冰上。

结果

我们通过门静脉进行了同基因型和异种胰岛移植。在两种胰岛移植模型中，移植物功能均呈剂量依赖性。在使用C57BL/6小鼠的同基因型胰岛移植模型中，移植250个胰岛可导致短暂的正常血糖，随后小鼠恢复至高血糖状态。接受500个胰岛移植的小鼠在移植后超过30天达到并维持正常血糖水平（图2A）。两组小鼠的体重均有所增加（图2B）。

类似地，在将人胰岛移植到糖尿病NOD-SCID小鼠的胰岛移植模型中，比较了移植45、85或140 IEQ/kg体重胰岛时移植物的功能。当移植45 IEQ/g（约每只小鼠225–275个胰岛）的人胰岛时，无法实现正常血糖。当胰岛数量增加至85 IEQ/g（约每只小鼠400–450个胰岛）时，移植后第60天有35.7%（10/28）的受体达到正常血糖（与45 IEQ/g组相比，p = 0.02）。此外，接受140 IEQ/g（约每只小鼠600–650个胰岛）人胰岛移植的受体中，有83.3%（5/6）达到正常血糖。

讨论

本研究展示了两种改进的操作步骤，可预防出血并可能降低小鼠在自体肝内胰岛移植（IIT）过程中的死亡率。本研究使研究人员能够直观观察胰岛移植模型，该模型在研究移植后即刻发生的血液介导的炎症反应方面具有独特优势。IIT模型是研究胰岛细胞存活以及肝脏缺血性损伤对胰岛移植反应的独特模型¹⁹。本文在既往研究基础上优化了操作流程，减少了早期并发症导致的小鼠死亡。方法A^14,15,16 和方法B^8,9均已在多项研究中被采用。我们发现，胰岛在肝脏全范围内分布，且移植后移植物中性粒细胞浸润和血栓形成等典型IIT相关病理特征在移植后即刻即已显著出现。

小鼠肝内胰岛移植包含几个关键步骤。由于人和小鼠的胰岛直径均可达到200 μm，移植时必须使用至少.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 中性缓冲福尔马林（v/v）	Fisher Scientific	23426796
1 mL 带针注射器	AHS	AH01T
20 mL 注射器	BD	301031
25G × 5/8" 皮下注射针头	BD	305122
酒精消毒片，无菌	Fisher Scientific	22-363-750
动物麻醉系统	VetEquip, Inc.	901806
盐酸丁丙诺啡注射液	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
离心管，15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
乙醇，绝对（200 proof），分子生物学级	Fisher Scientific	BP2818500
超细显微解剖剪，4” 直头锐利	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
胎牛血清（FBS）	Corning	35011CV
FreeStyle  血糖仪	Abbott	Lite
FreeStyle 血糖检测试纸	Abbott	Lite
明胶海绵（可吸收明胶海绵，USP）	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe 镊子，4” 超精细尖端	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
加热垫	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner 持针器，5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
胰岛素注射器，带 27 号针头	BD	879588
碘伏消毒片	Fisher Scientific	19-027048
异氟烷	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
青霉素/链霉素（P/S）	HyClone	SV30010
聚丙烯缝线 4-0	Med-Vet International	MV-8683
聚丙烯缝线 5-0	Med-Vet International	MV-8661
氯化钠，0.9% 静脉注射液	VWR	2B1322Q
链脲佐菌素（STZ）	Sigma	S0130
手术巾，无菌	Med-Vet International	DR1826
组织包埋盒	Fisher Scientific	22-272416