本实验方案介绍了如何制作一个简单的成年Drosophila行为观察室，以及如何通过相对简单且经济的方法，在观察室内对不同类型果蝇的形态或行为进行高分辨率拍照或录像。
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方法文章
一种用于行为学研究的可调节高分辨率成像系统 果蝇 成年人
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 是生物学研究中一种非常强大的模式生物，但在摄影或摄像方面却表现不佳。本文介绍了一种简单而有效的方法，用于观察和记录果蝇的行为或形态。将果蝇置于一个半透明的观察室中，观察室直径约为 Ø15 × 5 mm（内部无食物）或 Ø15 × 12 mm（内含一块高 8 mm 的食物）。用一块具有高透光率的紫外（UV）/透明滤光片密封后，将观察室置于 5–50 倍变焦体视显微镜下，并在显微镜两侧放置小型发光二极管（LED）视频灯，以对观察室进行照明，获得均匀、柔和、明亮且几乎无阴影的光线。然后，通过支架将一台具备 3–5 倍光学变焦、可录制 1080 P 高清或更高分辨率视频（帧率 ≥30 fps）的紧凑型数码相机连接至显微镜目镜，通过目镜进行拍照或录像。通过调节变焦体视显微镜的变焦旋钮，可轻松追踪果蝇，并根据需要拍摄全景或细节特写图像，同时相机可完整记录显微镜下的所有画面。由于果蝇可在观察室内任意位置活动，因此可从各个方向对其进行观察和记录。所拍摄的照片和视频图像质量良好。该方法既可用于科学研究，也可用于教学。
引言
Drosophila melanogaster 是生物学研究中的优秀模式生物；然而，它在摄影或摄像方面却表现不佳，因其体型对相机或摄像机而言过小，而对复式显微镜而言又过大1。尽管文献中已有大量出色的研究，但大多数研究仅提供了模糊、不清晰的图像，而非能够清晰展现果蝇行为细节的清晰锐利照片。此外，尽管果蝇行为已被广泛研究（例如求偶和争斗行为），但这些论文中的大多数仍依赖示意图向读者解释其研究内容。
本文描述了一种简单且经济的方法。利用该方法，不仅能够观察到各种行为 黑腹果蝇 可以观察到，不仅能够清晰锐利地记录下所有在体视变倍显微镜下可见的细节，而且该方法也可用于记录果蝇的形态，因为当果蝇进入睡眠或半睡眠状态时，其静止的状态允许使用者拍摄单张照片或一组不同焦平面的照片，以获得大景深的图像。这些方法的实现无需复杂的技术、昂贵的设备，甚至不需要高超的手动操作技能。
本文的视频部分展示了果蝇的几种典型行为。展示这些视频的目的有两个：一是让观众了解使用该方法能够捕捉到的行为内容，并展示所获得的图像质量；二是让那些对Drosophila感兴趣但至今尚未有机会实际观察果蝇行为的新学生，能够通过这些清晰的视频（而非示意图或模糊图像）理解果蝇的行为（如求偶、打斗）。
补充视频：果蝇行为： 请点击此处下载该文件。
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方案
1. 观察/记录系统的构建
注意：构建果蝇行为观察/记录系统所需的材料如图1所示，构建完成的系统如图2所示。以下将描述构建该系统的方法以及使用说明。
- 制作果蝇行为观察室（FBOC）。
- 取一个小型半透明（非透明）容器，用于制作直径（Ø）15 mm × 20 mm 的 FBOC。可使用尺寸约为 Ø17 mm × 22 mm 的半透明塑料瓶盖制作 FBOC，或从 5 mL 移液器吸头较粗的一端截取约 17 mm 的一段来制作 FBOC。
- 将 1% 琼脂倒入 FBOC 中以调节其深度。若需在 FBOC 中放置食物（参见食物制备方法），则倒入琼脂使深度达到 12 mm；若无需放置食物，则倒入琼脂至 5 mm 深度，以便更清晰地追踪果蝇的活动轨迹。
- 若使用移液器吸头制作 FBOC，先将截下的吸头段放入 Ø35 mm 或 Ø60 mm 的培养皿中。向培养皿中倒入 1% 琼脂凝胶，厚度约 5 mm，待琼脂凝固后密封 FBOC 底部。然后向 FBOC 内倒入琼脂凝胶至所需厚度。
- 取一块 60 mm × 60 mm × 15 mm 的乙烯基泡沫板，在其中心部位钻一个与 FBOC 直径相同、深度约 10 mm 的孔，作为 FBOC 的基座。将 FBOC 插入该孔中。
注：FBOC 基座可保持 FBOC 稳定，防止其倾倒，并便于在观察和录像过程中移动 FBOC 以追踪果蝇。 - 如有必要，根据观察目的，使用酵母培养基2、人工饲料3 或纯蔗糖/葡萄糖（以 1% 琼脂作为凝固剂）制备果蝇食物。
- 为直观判断果蝇是否进食并增强果蝇与其环境之间的对比度，向食物中添加食用染料（见材料表），终浓度为 12.5 mg/100 mL。
注：果蝇进食后，其腹部颜色会立即发生变化。 - 将制备好的食物倒入培养皿中，高度为 8 mm。待其凝固后，用剃刀切出一块尺寸为 8 mm × 4 mm × 8 mm 的食物，并将其置于一块塑料片（如糖果包装纸）上。
- 将食物切成四棱锥或四棱台形（如图3所示），以便在果蝇随机降落于食物上时，从不同角度观察和记录其行为。食物下方的塑料片可防止食物中的染料扩散至 FBOC 中的琼脂内。使用镊子将食物置于 FBOC 中心位置。
- 为直观判断果蝇是否进食并增强果蝇与其环境之间的对比度，向食物中添加食用染料（见材料表），终浓度为 12.5 mg/100 mL。
- 在某些行为观察实验中，需预先使果蝇处于饥饿状态。将 1% 琼脂凝胶（1 g 琼脂/100 mL 水，600 µL 丙酸）倒入洁净空瓶中，厚度为 1–2 cm，在室温下放置 1–2 小时。将果蝇转移至该瓶中，并在 25 °C 下放置 ≥36 小时。
注：果蝇可从琼脂凝胶中吸收水分，因此无需频繁补充水分4,5。 - 使用吸虫器将一只或多只果蝇转移至 FBOC 中。若使用吸虫器操作困难，可将果蝇置于碎冰中冷藏使其失活，在冰袋上进行分选后，再按前述方法转移至 FBOC6。
注：冷藏处理可极大地方便果蝇转移；经冷藏的果蝇可在 1 分钟内恢复意识，远快于使用 CO2 麻醉的果蝇。尽管冷藏可能对果蝇行为产生不利影响（例如交配潜伏期由 5 分钟7 延长至 40 分钟8），但不会改变其基本行为（如求偶行为）。因此，冷藏法可用于一般性观察（如教学实验）和录像。然而，若观察结果将用于科学研究报告，则强烈建议避免对果蝇施加任何麻醉处理。 - 将果蝇转移至 FBOC 后，用一块 30–40 mm 的紫外/透明滤光片覆盖其上，构成 FBOC 复合体（图4）。将 FBOC 复合体置于体视显微镜下进行观察。
注：为获得清晰锐利的图像，强烈建议使用高透光率（>98%）且抗眩光的高质量紫外/透明滤光片。可参考此前描述的一些建议9,10；虽无需购买昂贵滤光片，但应避免使用培养皿盖等玻璃片覆盖 FBOC。 - 对 FBOC 进行照明。将微型 LED 视频灯安装在闪光灯热靴支架上，并置于 FBOC 左右两侧（图2）。打开 LED 灯，将亮度设为 100%，色温设为 5000–5600 K。
注：可调光、色温为 5600 K 的微型 LED 视频灯可提供均匀、明亮且几乎无阴影的照明。使用体视显微镜自带的顶部光源、LED 环形灯或光纤照明器均未获得满意效果。建议为 LED 视频灯配备持续电源（变压器）。 - 果蝇行为的观察与录像
- 打开 LED 视频灯，调节体视变倍显微镜，直至肉眼可清晰看到 FBOC 的边缘。将 FBOC 移至视野中心。
- 将通用望远镜式数码相机适配器的夹具固定在体视显微镜的一个目镜上，然后交替拧紧相机安装螺丝和相机固定螺丝，将紧凑型数码相机牢固地安装在适配器上（图2）。
- 打开数码相机，调节水平/垂直微调旋钮，使 FBOC 的边缘清晰地位于相机 LCD 屏幕圆形视野的中央。将模式拨盘转至光圈优先自动模式，按下多功能选择器上的对焦键，选择微距近摄模式，然后按下确定键。将变焦开关从广角端移至长焦端，放大圆形图像，使其中央部分充满整个 LCD 屏幕。 按下录像按钮开始录制（再次按下该按钮以停止录制）。
注：若图像过暗或过亮，按下靠近曝光补偿图标一侧的控制拨盘（图1），旋转拨盘以调整相机建议的曝光值（EV），以达到理想效果。正值 EV 使图像更亮，负值 EV 使图像更暗。图像应均匀、明亮，无暗角。 - 调节显微镜的对焦旋钮，直至 FBOC 中的果蝇清晰可见。选择感兴趣的行为进行观察或录像。调节变焦旋钮以放大或缩小，达到所需的观察或录像放大倍数。
注：这种通过目镜在显微镜下成像的方法适用于任何带目镜的显微镜。拍摄实验结果时，建议使用支持 RAW 格式拍摄的相机，因 RAW 图像文件优于 JPEG 格式。使用相机的 LCD 屏幕作为显示器观察果蝇行为，并确保体视变倍显微镜至少具备 5–50 倍的变焦能力。
2. 果蝇行为观察与录像的实验方案
- 准备果蝇
- 在25 °C、60%湿度及12小时光照/12小时黑暗循环条件下，将果蝇培养于玉米粉培养基上。除求偶和打斗行为外，孵化后6天内收集果蝇进行观察。
注意：此处培养基的成分为 1000 mL 水、105 g 玉米粉、75 g 蔗糖、15 g 琼脂、40 g 酵母粉、28 mL 10% 对羟基苯甲酸甲酯（w/v，溶于 95% 乙醇）和 6.25 mL 丙酸。
- 在25 °C、60%湿度及12小时光照/12小时黑暗循环条件下，将果蝇培养于玉米粉培养基上。除求偶和打斗行为外，孵化后6天内收集果蝇进行观察。
- 通过降温从麻醉中恢复意识
- 按照之前所述的方法将果蝇冷却。6 转移 果蝇 使用镊子将果蝇从冰盒转移到FBOC。用视频记录果蝇从静止状态恢复至正常姿势的过程。
- 果蝇睡眠、摄食、排泄及社会行为
- 饥饿果蝇36小时。将4-6只果蝇转移至含有染色食物的FBOC中。观察并录像记录果蝇行为。
注意：静止不动超过 5 分钟的果蝇表现出睡眠行为11果蝇可以在食物上或垂直的FBOC壁上睡眠（身体与观察室壁垂直）。睡眠时身体不动，但可见腹部呈波浪状起伏。取食行为表现为果蝇伸出喙，持续吸食并爬行于食物表面，其腹部会变为蓝色。在群体取食或其他活动中，果蝇会伸足轻触其他个体的身体，这是一种友好的社交行为。
- 饥饿果蝇36小时。将4-6只果蝇转移至含有染色食物的FBOC中。观察并录像记录果蝇行为。
- 果蝇梳理行为
- 按照所述方法将果蝇冷却6将冻死的果蝇投入琼脂粉中，滚动使其表面均匀覆盖琼脂粉。将果蝇转移至FBOC装置中，观察并记录其梳理行为。
注意：当果蝇从冷冻状态恢复意识后，会迅速抖落体表的琼脂粉，并用其腿部清洁身体各个部位12,13在摄食、求偶及其他行为过程中也可观察到理毛行为。
- 按照所述方法将果蝇冷却6将冻死的果蝇投入琼脂粉中，滚动使其表面均匀覆盖琼脂粉。将果蝇转移至FBOC装置中，观察并记录其梳理行为。
- 果蝇求偶与争斗行为
- 按照之前所述方法收集雌性和雄性果蝇7将一只雌性果蝇和一只雄性果蝇放入FBOC中，观察并记录6种求偶行为（包括成功与失败的求偶行为）。
- 为了观察果蝇的争斗行为，将两只雄性果蝇放入争斗行为观察室（FBOC）中，观察并记录它们相互推挤的行为。
- 果蝇产卵行为
- 按先前所述方法准备雌性果蝇5将4只雌性果蝇转移至含有食物的FBOC中。
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结果
透过紫外滤光片拍摄以获得清晰锐利的图像
在实验室中进行一个简单的实验，观察紫外滤光片与普通玻璃之间的差异。取一个果蝇培养管，移除塞子后将其置于体视解剖显微镜下，分别用紫外滤光片和培养皿盖覆盖。这两种情况下的拍摄结果如图5所示。透过紫外滤光片拍摄的照片清晰锐利，与未覆盖任何物体时拍摄的图像非常相似。即使对焦准确，透过培养皿玻璃盖拍摄的照片质量也非常差。普通玻璃（或丙烯酸板）未经过镀膜处理，其最高透光率仅为92%14,15，而具有多层镀膜的透明/紫外滤光片透光率可达98–99%。
因此，通过普通玻璃（或亚克力板）拍摄的图像不如通过透明/紫外滤光片拍摄的图像清晰。普通玻璃（如实验室培养皿盖）另一个重要缺陷是其表面不平整。这一点可在 图5 由于玻璃表面不平整，导致部分图像清晰而部分模糊。因此，应使用清晰/紫外滤光片...
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讨论
光是摄影和摄像的核心，也是获得高质量图像的决定性因素16。本实验中使用了两盏亮度和色温可调的LED视频灯作为光源，并选用半透明材料制作FBOC。两侧的LED灯板提供了足够的亮度，而半透明材料则柔化并散射光线，最终在FBOC内产生均匀、柔和且明亮的照明效果，避免出现令人不适的过曝或欠曝区域。即使不使用复杂且昂贵的照明设备，也可实现理想的照明效果。此处所用的紫外/透明滤光片具有很高的透光率和低反射率，覆盖在FBOC上时光线损失极小。这些措施确保了图像清晰锐利。
我们通过支架将数码相机连接到体视变倍显微镜的目镜上，并通过目镜进行拍照或录像。显微镜下观察到的所有图像均可被记录。通过旋转调焦旋钮并上下移动显微镜，可在FBOC狭窄空间内非常方便地追踪果蝇，并根据需要放大或缩小，以记录局部细节或整体动态，这是直接使用摄像机或录像设备对FBOC进行拍摄所无法实现的。同时，可根据图像质量要求选择合适的相机。事实上，通过支架可将数码相机连接至任何带有目镜的显微镜。本文通讯作者已采用此方法成功记录实验结果多年。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢李向东教授和摄影师程京先生给予的有益讨论和建议。本工作得到中国农业大学生命科学实验教学示范中心探索性项目（20200101）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 紧凑型相机，Nikon P310 | Nikon | 3-5倍光学变焦，可录制1080P高清视频 | |
| 乙烯胺泡沫 | 60 mm × 60 mm × 15 mm | ||
| 食用蓝色素1号 | CAS 3844-45-9 | ||
| 迷你LED灯及变压器 | GODOX | LED-P120 | 色温为5000-5600 K |
| 小型容器（例如瓶盖） | 直径约 Ø 15 mm × 20 mm | ||
| UV/透明滤光片 | 高透光率的高质量UV/透明滤光片，直径30-40 mm | ||
| 变焦体视显微镜 | 5-50倍变焦 |
参考文献
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