在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

摘要

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。

摘要

心血管疾病（CVD）仍是全球最主要的死亡原因。然而，在体外（in vitro）模拟心肌——即心肌组织——的生理和生物学复杂性一直极具挑战性。主要难点在于需要获取具有成人特征或成人心肌细胞（CMs）表型的人类心肌细胞，并能够有效重现心肌组织的细胞复杂性和精细的三维结构。遗憾的是，由于伦理问题以及缺乏可获取的原代患者来源的人类心脏组织，加之心肌细胞增殖能力极低，导致可用的人类心肌细胞来源成为心脏组织工程发展的限制性环节。为此，目前大多数研究已转向利用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为心肌细胞，作为人类心肌细胞的主要来源，从而推动hiPSC-CMs在体外（in vitro）心脏组织建模实验中的广泛应用。

在此工作中，我们展示了一种在微流控装置内构建三维成熟干细胞来源的人心脏组织的实验方案。我们具体阐述并以可视化方式演示了三维 体外 由hiPSC来源的心肌细胞构建各向异性的心脏类器官芯片模型。本文主要描述了一种用于富集心肌细胞的纯化方案，通过将心肌细胞与人源心肌成纤维细胞（hCFs）按特定比例混合，实现共培养，并将该共培养体系悬浮于基于胶原蛋白的水凝胶中。进一步地，我们将负载细胞的水凝胶注入结构明确的微流控装置内，该装置内置交错排列的椭圆形微柱，作为表面拓扑结构，可诱导周围细胞及水凝胶基质高度有序排列，从而模拟天然心肌组织的结构特征。我们预期，所提出的三维各向异性心脏类器官芯片模型适用于基础生物学研究、疾病建模，以及作为药物筛选工具用于药理学测试。

引言

近年来，组织工程技术已被广泛探索，以辅助再生医学和疾病建模中的体内临床发现^1,2。由于获取人原代心肌组织存在固有困难，且难以构建符合生理特征的体外替代模型，导致对心血管疾病（CVDs）复杂机制的基础理解受到限制，因此研究尤其重视体外心肌组织建模^1,3。传统模型通常采用二维单层细胞培养体系。然而，已有大量研究表明，在三维环境中培养心肌细胞对于模拟心肌组织的天然微环境以及复杂的细胞间相互作用至关重要^4,5。此外，迄今为止大多数模型仅包含由干细胞分化而来的单一心肌细胞（CMs）培养体系。然而，心脏由多种细胞类型组成⁶，并具有复杂的三维结构⁷，因此迫切需要提高三维体外模型中组织构成的复杂性，以更真实地模拟天然心肌组织的细胞组成。

迄今为止，人们已探索了多种不同方法来构建心肌的仿生三维模型⁸。这些方法包括从实验装置 ....

方案

所有细胞操作和试剂配制均须在生物安全柜中进行。确保所有与细胞接触的表面、材料和设备均无菌（例如，用70%乙醇喷洒消毒）。细胞应在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。所有人诱导多能干细胞（hiPSC）的培养与分化均在6孔板中进行。

1. 微流控装置的制备（预计耗时：1 周）

1. 光刻技术
   注意：使用 CAD 文件（作为补充文件1提供）设计的掩模包含微流控通道的结构。将该设计打印到透明掩模上，然后在洁净室内对4英寸硅片上的负性光刻胶SU8 2075进行标准光刻工艺。
   1. 用异丙醇（IPA）清洗硅片，并用氮气吹干。在200 °C下烘烤5分钟以去除水分。
      注意：操作硅片时应使用硅片镊子。
   2. 将硅片放入匀胶机中，在硅片中心滴加3–4 mL SU8胶，然后启动匀胶程序以形成厚度为200 µm的胶层（即：15秒内从0加速至500 rpm，保持10秒；再用5秒加速至1,200 rpm，保持30秒；最后减速15秒直至停止）。
   3. 取出硅片，在65 °C下预烘7分钟，随后在95 °C下继续烘烤45分钟。
   4. 将硅片转移至掩模对准仪，将带有紫外滤光片的透明掩模放入掩模夹具中。对硅片进行两次曝光，每次230 mJ/cm²，间隔30秒，总曝光量为460 mJ/....

结果

为了从人诱导多能干细胞（hiPSCs）中获得高纯度的心肌细胞（CMs）群体，采用了一种改进的方法，结合了Lian分化方案³³和Tohyama纯化步骤³⁴（实验时间线见图1A）。在开始心肌细胞分化时（传代后3-4天），hiPSCs应呈集落状，汇合度约为85%，并在培养孔中均匀分布（图1B）。具体而言，在第0天，hiPSC集落应高表达多能性转录因子，包括SOX2和Nanog（图1C）。根据本方案，成功的干细胞分化与纯化过程如图1D所示，可见密集的心肌细胞集落表达肌节α-肌动蛋白（sarcomeric α-actinin），周围非心肌细胞极少。此外，人心脏成纤维细胞（hCFs）必须保持成纤维细胞形态，并高表达波形蛋白（vimentin）（图1E），因此应.......

讨论

构建一种具有增强的细胞间相互作用和仿生三维结构的体外人类心肌组织模型，对于基础心血管研究及其相应的临床应用至关重要¹。本方案详细阐述了在微流控装置中利用源自干细胞的心肌细胞（CMs）与包裹于胶原水凝胶中的结缔组织成纤维细胞（CFs）共培养，构建三维各向异性人类心肌组织的方法，以模拟天然心肌复杂的细胞组成与结构。该特定方案具有高度可重复性，因为该装置的特定结构已针对源自大鼠心脏细胞以及人多能干细胞分化而来的CMs（包括hESCs及两种 hiPSCs系：SCVI20和IMR90-4）所形成的三维各向异性心肌组织进行了优化与验证，如我们近期发表的研究所示²⁰。我们与许多其他研究团队均发现，不同细胞系间干细胞向心肌细胞的分化效率存在差异^35,36。所采用的纯化方案有助于提高分化产率；然而，所需纯化时间的长短取决于细胞系及其分化效率。因此，不同细胞系在微流控组织构建中的最终成功率可能存在差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.65 mL 离心管	VWR	87003-290
1 mm 活检打孔器	VWR	95039-090
1.5 mm 活检打孔器	VWR	95039-088
15 mL Falcon 管	VWR	89039-670
18x18 mm 盖玻片	VWR	16004-308	盖玻片应为 No.1，以适用于高倍成像
4% 多聚甲醛	ThermoFisher	101176-014
6 孔平底组织培养板	VWR	82050-844
B27 不含胰岛素	LifeTech	A1895602
B27 含胰岛素	LifeTech	17504001
CHIR99021	VWR	10188-030
胶原蛋白 I，大鼠尾部来源	Corning	47747-218
DMEM F12	ThermoFisher	11330057
DPBS	ThermoFisher	21600069
E8	ThermoFisher	A1517001	也可自行配制
EDTA	VWR	45001-122
乙醇
FGM3	VWR	10172-048
GFR-Matrigel	VWR	47743-718
甘氨酸	Sigma	G8898-500G
山羊血清	VWR	10152-212
hESC-Matrigel	Corning	BD354277
异丙醇（IPA）
IWP2	Sigma	I0536-5MG
Kimwipes 纸巾	VWR	82003-820
MTCS	Sigma	440299-1L
NaN3	Sigma	S2002-25G
NaOH	Sigma	S5881-500G
青霉素-链霉素（Pen/Strep）	VWR	15140122
培养皿（150x15 mm）	VWR	25384-326
培养皿（60x15 mm）	VWR	25384-092
酚红	Sigma	P3532-5G
RPMI 1640	ThermoFisher	MT10040CM
RPMI 1640 不含葡萄糖	VWR	45001-110
硅晶圆（100 mm）	University Wafer	1196
乳酸钠	Sigma	L4263-100ML
SU8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU8 显影液	ThermoFisher	NC9901158
Sylgard 弹性体	Essex Brownell	DC-184-1.1
T75 培养瓶	VWR	82050-856
吐温 X-100（Triton X-100）	Sigma	T8787-100ML
TrypLE	ThermoFisher	12604021
胰蛋白酶-EDTA（0.5%）	ThermoFisher	15400054
Tween20	Sigma	P9416-50ML
Y-27632	Stem Cell Technologies	72304
EVG620 对准仪	EVG
等离子清洗机 PDC-32G	Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 显微镜	Nikon
Leica SP8 共聚焦显微镜	Leica