Method Article

在微流体平台内开发 3D 组织人类心脏组织

DOI:

10.3791/62539

⸱

June 15th, 2021

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议的目的是解释和演示高度对齐的人类心脏组织的三维（3D）微流体模型的发展，该模型由干细胞衍生心肌细胞组成，与心脏成纤维细胞（CFs）在生物仿真、胶原蛋白基水凝胶中共同培养，用于心脏组织工程、药物筛查和疾病建模。

Abstract

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全世界的主要死因是心血管疾病（CVD）。然而，建模心脏肌肉的生理和生物学复杂性，心肌，是出了名的难以 完成体外。 主要，障碍在于需要人类心肌细胞（CMs），这些细胞要么是成人的，要么是显示成人样的表型，并且能够成功地复制心肌的细胞复杂性和复杂的3D结构。不幸的是，由于伦理问题和缺乏可用的原发性患者衍生人类心脏组织，加上CS的微小增殖，可行的人类CMs的采购一直是心脏组织工程的一个限制步骤。为此，大多数研究已经过渡到人类诱导多能干细胞（hiPSC）作为人类CMs的主要来源的心脏分化，导致 在体外 测定中广泛纳入HIPSC-CMs，用于心脏组织建模。

在这项工作中，我们演示了在微流体设备中开发3D成熟干细胞衍生人类心脏组织的方案。我们特别解释和视觉上演示了从hiPSC衍生的CMs中产生的3D 体外 不运动心脏组织芯片模型的生产。我们主要描述为 CMs 选择的纯化协议，通过将 CMs 与人类 CF （hCF） 混合来共同培养具有定义比率的细胞，以及暂停胶原蛋白水凝胶中的这种共同培养。我们进一步演示了在我们定义明确的微流体装置中注入细胞载水凝胶，内嵌交错椭圆微柱，作为表面地形，诱导周围细胞和水凝胶基质的高度对齐，模仿原生心肌的结构。我们设想，拟议的3D非同向心脏组织芯片模型适用于基础生物学研究，疾病建模，并通过它作为筛选工具，药物测试。

Introduction

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组织工程方法已广泛探索，近年来，伴随着体内临床发现再生医学和疾病建模1，2。由于在采购人类原发性心脏组织和产生生理相关体外代孕方面存在固有困难，因此特别强调体外心脏组织建模，这限制了对心血管疾病（CVDs）1、3复杂机制的基本理解。传统模型通常涉及 2D 单层文化测定。然而，在3D环境中培养心脏细胞，模仿心肌原生景观和复杂的细胞相互作用的重要性，已被广泛定性为4，5。此外，迄今为止生产的大多数模型都包括了与干细胞不同的CMs的单一培养。然而，心脏是由多个细胞类型6在复杂的3D架构7，保证迫切需要改善组织成分的复杂性在3D体外模型，以更好地模仿细胞成分的原生心肌。

迄今为止，已经探索了许多不同的方法来生产模因8的生物仿生3D模型。这些方法的范围从允许实时计算生成力的实验设置，从在薄膜（被认为是肌肉薄膜 （MTFs）9上播种的单培养 CMs，到悬浮在自立的钳子（被视为工程心脏组织 （EHTs）10中的 3D 水凝胶基质中的共同培养心脏细胞。其他方法则侧重于实施微模技术，以模仿心肌厌食症，从11号组织贴片中悬浮在突出微柱中的3D水凝胶中的单培养CMs，到在缩化微沟12、13中播种的单培养CMs。因此，利用与预期应用和相应的生物学问题相一致的技术，每种方法都有内在的优点和缺点。

增强干细胞衍生 CMs 成熟度的能力对于成功进行成人心肌组织体外工程以及将后续发现转化为临床解释至关重要。为此，在2D和3D14、15、16方面，对成熟CMs的方法进行了广泛的探索。例如，EHT中所包含的电刺激、CM与地表地形、信号提示、共同培养的生长因子和/或3D水凝胶条件等的强制对齐，都导致至少在以下一种情况下有利于CM成熟的变化:细胞形态、钙处理、肉瘤结构、基因表达或收缩力。

在这些模型中，利用微流体平台的方法在性质上保留了某些优势，例如控制梯度、有限的细胞输入和最少必要的试剂。此外，许多生物复制品可以立即产生使用微流体平台，有助于更好地解剖生物利益机制，增加实验样本量，有利于统计力17，18，19。此外，在微流体设备制造过程中使用光刻技术，在微观和纳米层面创建精确的特征（如地形图），作为中微线索，增强周围的细胞结构和宏观级组织结构18、20、21、22，用于组织再生和疾病建模的不同应用。

我们以前曾证明开发一种新的3D心脏组织片上模型，结合表面地形，以天生椭圆形微柱的形式，将水凝胶封装共同培养的心脏细胞对齐成一个相互连接的，不亚素组织20。经过14天的培养，与单层和3D同位素控制23相比，微流体装置内形成的组织在表型、基因表达特征、钙处理特性和药物反应等方面更加成熟。此处描述的协议概述了使用hiPSC衍生的 CMs 在微流体设备中创建这种 3D 共培养、对齐（即不运动）人类心脏组织的方法。 具体来说，我们解释区分和净化高浓缩丙基对CMs的方法，补充HCF与CMs产生一个既定的共同培养群体，将细胞群封装在胶原水凝胶中到微流体设备中，以及随后通过收缩和免疫荧光检测分析3D构造组织。由此产生的3D工程微组织适用于各种应用，包括基础生物学研究、CVD建模和药物测试。

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Protocol

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在生物安全柜内执行所有细胞处理和试剂准备。确保与细胞接触的所有表面、材料和设备均无菌（即喷洒70%乙醇）。细胞应在加湿的 37 °C、5% CO2 孵化器中培养。所有hiPSC文化和分化均在6井板中执行。

1. 微流体设备创建（大致持续时间:1 周）

  1. 光刻
    注:使用CAD文件设计的面膜（作为 补充文件1提供），包含微流体通道的设计。将设计打印在透明面罩上。然后，在洁净室内的 4 英寸硅晶片上使用负光分辨率 SU8 2075 进行标准光刻。
    1. 用异丙醇 （IPA） 清洁硅晶片，用氮干燥。在200°C下烘烤5分钟脱水。
      注意:用晶圆钳处理晶圆。
    2. 将晶圆放在旋转涂层中。将 3-4 mL 的 SU8 沉积在晶圆中心，然后旋转形成 200 μm 的层（即，将 15 s 增加到 500 rpm，旋转 10s，提高 5 s 至 1，200 rpm，旋转 30s，然后向下倾斜 15s 直到停止）。
    3. 在 65 °C 下取出晶圆并软烘烤 7 分钟，然后在 95 °C 下 45 分钟。
    4. 将晶圆移动到面罩对齐器上，然后用紫外线过滤器将透明面膜放在面罩架中。将晶圆暴露在2个周期的230mJ/cm2，延迟30，总曝光量为460mJ/cm2。
    5. 在 50 °C 烤箱中对暴露的晶圆进行暴露后烘烤过夜。
    6. 第二天早上关掉烤箱，晶圆冷却到室温后，将其浸入SU8开发人员中。每 5 分钟从开发人员处取出晶圆，然后用 IPA 清洗，然后将其放回开发人员中。
    7. 大约 20 分钟后，或当 IPA 运行清晰时，用气氮干燥晶圆，并在烤箱中硬烤至 150 °C;一旦烤箱达到150°C，关闭它，但不要打开。将晶圆留在烤箱中，直到达到室温，然后移除晶圆。
    8. 用精密仪确认SU8的高度，用光显微镜确认光学特性。一旦确认，将晶圆粘在150毫米塑料培养皿内。
  2. 软版画
    注:贴在培养皿上的晶圆需要硅化，以防止 PDMS 粘附在 SU8 功能上。
    1. 将晶圆（轻拍到塑料培养皿）倒置在相同尺寸的玻璃培养皿上，其中含有 0.4 mL 甲基氯辛烷 （MTCS），并将晶圆暴露在蒸汽中 4 分钟。将晶圆直立转动，盖上培养皿的盖子。
    2. 以10:1的比例将30克硅胶弹性体碱基与固化剂混合。取下培养皿的盖子，将多晶硅氧烷 （PDMS） 倒在晶圆上，然后在干燥器内除气。
    3. 一旦所有的气泡都消失了，将晶圆放置在80°C的1.5小时，以治愈PDMS。
    4. 小心剥离 PDMS，并分别用 1 mm 和 1.5 mm 活检冲压为组织端口和介质通道打孔入口和插座。
    5. 用胶带清洁 PDMS 通道以清除灰尘。接下来，将盖片（18 x 18 mm，1号）浸泡在70%乙醇中至少15分钟。然后，用纸巾擦干这些。
    6. 将盖片和 PDMS 通道（功能侧暴露）置于等离子体中（设置在高处）1 分钟，然后快速粘合在一起，并在 80 °C 烤箱中放置过夜，以确保粘结。
      注意:在粘接过程中，必须对 PDMS 通道的边缘施加轻度压力，以确保 PDMS 和玻璃之间的良好密封，同时避免通道本身，以防止通道崩溃。
  3. 设备准备
    1. 将粘结的 PDMS 设备浸入除离子水 （DI H2O） 中，并使用液体循环进行高压灭菌。接下来，从设备中吸气液体，并再次使用重力循环进行高压灭菌。然后，在 80 °C 下连夜脱水消毒设备。

2. 干细胞培养（大致持续时间:1-2个月）

  1. 高PSC文化和维护
    注意:在冷冻保存或分化之前 ，在体外 解冻后，需要连续培养三段高PSC。hiPSC 在 E8 或 mTeSR1 介质中培养，取决于细胞系，在地下室膜基质涂层板24上。
    1. 要涂上 hESC 质量的地下室膜基质板，请将其添加到冰上 25 毫升 DMEM/F-12K 中解冻矩阵介质（批量依赖体积，一般为 200-300 μL;存储在 -80 °C）。将此悬浮的 1 mL 分配到 6 井板的每个井中。将盘子放在37°C的孵化器中至少1小时。
    2. 解冻后，通过添加 5 μM 的 Y-27632 25 （E8+RI）来修改 E8 介质以进行 hiPSC 文化。之后使用此介质 24 小时，然后将媒体更改为新鲜的 E8。
      注意:对于常规媒体更改，未修改的 E8 媒体用于 hiPSC 文化。要进行常规维护，E8 媒体必须每天更换，大约在上次媒体更改后 24 小时。
    3. 第 3 天或第 4 天的通道单元，吸气介质，然后用 1mL 的 1 倍杜尔贝科磷酸盐缓冲溶液 （DPBS） 清洗每口井。
      注意:确保细胞大约70%的汇流。不要让它们增长超过70%的汇流。
    4. 吸气 DPBS，然后在每口井中加入 1 mL 的 0.5 mM EDTA，并在室温下孵育 6-7 分钟。
    5. 小心吸气EDTA，将1mL的E8+RI加入每口油井，然后用1mL移液器（+5-10次收集所有细胞）对表面进行爆炸。将细胞悬浮在 15 mL 微中微管中。
    6. 在 E8+RI 中按所需的细胞密度（即每口井 200 K 欧元）计算细胞悬架和通过。
    7. 24小时后将介质更改为E8（无RI）。不要将细胞与RI一起留用超过24小时。
      注意:E8 不应加热到 37 °C。 在细胞培养之前，总是把它留在室温下取暖。
  2. 心肌细胞 （CM） 定向分化
    注意:需要注意高PSC26、27的不同行之间存在异质性，因此可能需要针对每个细胞系优化以下步骤。按照下面的步骤进行CM分化。
    1. 准备RPMI + B27 - 胰岛素通过添加10 mL的B27减去胰岛素和5毫升青霉素/链霉素（笔/链霉素）到500mL的RPMI 1640。
    2. 通过添加 10 mL 的 B27 和 5 mL 的笔/链球菌到 500 mL 的 RPMI 1640 来准备 RPMI + B27 + 胰岛素。
    3. 通过添加 10 mL 的 B27、5 mL 的笔/链球菌和 4 mM 乳酸钠到 500 mL 的 RPMI 1640 无葡萄糖来准备 RPMI 减去葡萄糖 + B27 + 胰岛素。
    4. 一旦hiPSC达到85%的汇合度，开始分化（第0天），用RPMI +B27的4mL替换旧介质 - 胰岛素介质，其中含有10μM CHIR99021到6井板的每口井（即， 将25微升的10m CHIR99021添加到25毫升RPMI+B27-胰岛素中，然后立即添加每口井4毫升）。
      注:CHIR99021 是葛兰素史克抑制剂，可导致 Wnt 激活。CHIR99021的最佳浓度和初始汇合因每个细胞系28而异。在实际实验之前，始终检查浓度梯度为 6-12 μM CHIR99021 和一系列播种密度，以确定启动分化的最佳条件。
    5. 正好 24 小时后 （第 1 天）， 吸气介质， 代之以 5 ml 的预热 Rpmi + B27 - 胰岛素到每个井。
    6. CHIR99021 添加后（第 3 天）正好 72 小时，从 6 井板的每口井中收集 2.5 mL 的废介质，在管中总共收集 15 mL 的废介质。
    7. 为此，添加15 mL的新鲜RPMI +B27 - 胰岛素介质。将 IWP2 添加到组合中管的浓度为 5μM（即，1μL 的 IWP2，在组合介质的每 1 mL 5 mM 或 IWP2 的 30 μL 中加入 30 mL 介质）。
    8. 将盘子剩余介质的约 1.5 mL 移除，使介质的 1 mL 保持不变。大力旋转板，以确保细胞碎片的充分清除。然后，吸气旧介质的其余部分，并添加5mL的组合介质，其中包含IWP2每井板。
      注意:在细胞中加入IWP2会导致Wnt抑制。
    9. 在第5天，从每个井吸气介质，代之以5mL的预热RPMI+B27 - 胰岛素。
    10. CM 成熟:在第 7 天、第 9 天和第 11 天，从每口井中吸气介质，代之以 5 mL 预热 RPMI + B27 + 胰岛素。这些天应该观察到自发的殴打。
    11. CM 净化:在第 13 天和第 16 天，通过从每口井中吸入介质，用 1 mL 的 1 倍 DPBS 清洗每口油井，然后加入 5 mL 预热 RPMI 减去葡萄糖 + B27 + 胰岛素，辅以 4 mM 乳酸钠。
    12. 在第19天，吸气的废中等，代之以5mL的预热RPMI +B27+胰岛素到每个井，使细胞恢复纯化后。
    13. 在第 21 天，按照下面描述的 CM 分离协议（步骤 3.3）重新板化单元。目标是在6井板中每口井板1.5-2 x 10 6个细胞。例如，如果是高效区分，通常将 6 口井扩展到 9 口井是好的。
    14. 从第 21 天开始，从每口井中吸气介质，每 2-3 天更换 4 mL 的 RPMI + B27 + 胰岛素。
      注:高PSC-CMs已准备好在第23天之后进行实验使用。

3. 在微流体装置内创建3D心脏组织:（大致持续时间:2-3小时）

  1. hCF文化
    1. 文化人类心室心脏成纤维细胞（hCFs;从隆扎获得商业）在T75烧瓶（每瓶25万细胞）在纤维细胞生长介质-3（FGM3）。每隔一天更换一次媒体，并在70%的汇流时通过。在通道 10 之前使用 hCF，因为它们可能会在高通道29处开始分化为肌纤维细胞。
  2. hCF分离
    1. 要分离 hCF，请先从孵化器中取出烧瓶。将烧瓶放入生物安全柜中，并开始从烧瓶中吸气废止的介质。然后，用3mL的1倍DPBS清洗T75烧瓶。关闭盖并旋转烧瓶。
    2. 吸气的DPBS。服用3毫升预热1x特里普辛-EDTA（0.05%）并将其添加到烧瓶中。倾斜烧瓶和漩涡涂抹底部。将其留在 37 °C 孵化器中 4-6 分钟，检查显微镜下的烧瓶以确保细胞分离，这通过圆形细胞形状和浮动细胞就证明了这一点。如果没有，则将烧瓶放回孵化器中再放一分钟。
    3. 通过在烧瓶中加入 3 毫升预热 FGM3 来中和尝试素操作。然后，将溶液上下移到烧瓶底部，以驱散 CF。
    4. 将细胞悬浮在 15 mL 微中微管中。取10μL的细胞悬浮，并将其分配在血细胞仪中，用显微镜数细胞。
    5. 将细胞悬浮在200 x g 下4分钟。吸气超自然者小心不要打扰细胞颗粒。
    6. 在新鲜的 FGM3 中补充颗粒，以制造所需的 75 x 106 细胞/mL。要么通过一部分（每T75烧瓶25万个细胞），要么按照以下协议生成3D心脏组织。
  3. CM 分离
    注意:经过分化和纯化后，准备将 CMs 用于注入微流体设备。
    1. 将 CMs 板从孵化器中取出，吸气媒体。然后用 6 井板每口井 1 mL 的 1 倍 DPBS 清洗油井。每口井取6毫升的DPBS和1毫克的移液器。
    2. 吸气 DPBS 小心不要打扰连接到板上的细胞。派佩特 6 mL 的暖细胞分离解决方案（例如，TrypLE 快件），每口井添加 1 mL。将细胞孵化在 37 °C 孵化器中 10 分钟。
    3. 用等量的RPMI +B27+胰岛素（即每口井1mL）中和酶，并通过用1mL移液器上下输送培养容器，机械地分离细胞。
    4. 将 CMs 收集到 15 mL 离心机管中。离心机在300 x g 3分钟。
    5. 吸气超自然人。将细胞颗粒在 5 mL 的 RPMI + B27 + 胰岛素中补充。用 1 mL 移液器上下调理解决方案，以确保正确混合。取10μL的细胞悬浮，并将其分配在血细胞仪中，以确定整个细胞数量。
    6. 再以300 x g 的离心力将细胞分给3分钟（以确保完全去除TrypLE），并吸气超自然。然后，添加适量的RPMI +B27 + 胰岛素，以实现75 x 106 细胞/mL。
      注意:如果心脏分化/选择不会导致高CM%（即>80%），通过免疫染色或流动细胞测量（如cTnT）的CM特异性蛋白质，不要认为细胞适合组织形成。当这种情况发生时，应通过调整 CHIR99021 浓度和初始启动密度来优化分化过程。如果CM纯化需要改进，可以使用其他方法，例如对具有荧光激活细胞分拣（FACS）或磁激活细胞分拣（MACS）30、31、32的CM进行排序。
  4. 胶原蛋白制备
    注:从胶原蛋白高浓度库存中制备胶原蛋白（范围为8-11毫克/mL）。用于创建细胞的胶原蛋白:水凝胶混合物为6毫克/mL，最终浓度为2毫克/mL。根据要注入的设备数量，需要重新计算要制作的胶原蛋白溶液的体积。
    1. 将所有所需的试剂放在冰上，放在生物安全罩内。
      注:胶原蛋白是一种反应迟钝的水凝胶。因此，温度需要保持低，以防止过早聚合。
    2. 服用75微升库存胶原蛋白（8毫克/mL），在冰上的微中微管中分配。胶原蛋白溶液非常粘稠，所以用移液器慢慢吸气。
    3. 服用13.85μL的介质（即RPMI+B27+胰岛素），并在同一管中分配。
    4. 然后服用10μL的酚红色，加入混合物并重新喷出。
    5. 最后，服用1N NaOH的1.15μL，并添加到暂停。
    6. 使用 200 μL 移液器尖端，重新悬架。
      注:库存胶原蛋白具有酸性pH，需要添加NaOH中和，然后再使用它封装心脏细胞。酚红色作为pH值指示器:因此，在NaOH添加之前添加此。此时，胶原蛋白溶液为黄色，表示其酸度。添加 NaOH 后，溶液应变为橙色为浅粉色，表示其中和。
  5. 水凝胶混合物和细胞制备
    注意:在这一步骤中，完成了胶原蛋白水凝胶中细胞的封装。在接下来的步骤中，细胞以及所有水凝胶前体应放置在冰上。
    1. 此时，如果 CF 尚未尝试脱脂，请将 CM 悬架存放在 15 mL 离心机管中，盖子拧开，允许气体流动，在 37 °C 的孵化器内。同时，分离 CF 并以 75 x 106 单元/mL 的密度收集，用于设备加载。
    2. 以 4:1 的比例将暂停的 CMs 与 CFs 混合。取8μL的CMs的别名，并添加到冰上一个新的离心机管。然后服用2μL的CFs，并添加到离心机管中的细胞悬架中。
    3. 重新悬浮细胞，抓住细胞悬架的5.6μL，并把它放在一个新的微中微管中。
    4. 采取4μL的胶原蛋白刚刚准备在上述步骤，并添加到4:1 CM:CF混合物。添加 2.4 μL 的生长因子降低 （GFR） 基层基质矩阵，使最终细胞密度为 35 x 106 细胞/mL，用于设备注入。将混合物上下混合，以确保细胞悬架是均匀的。
  6. 设备插入
    注意:一旦准备了细胞:水凝胶混合物，就需要将其插入设备中。
    1. 将自切的微流体设备从 80 °C 烤箱中取出，并在插入细胞悬架之前将其放入 Biosafety 柜中至少 1 小时，使设备在保持不育的同时冷却到室温。
    2. 将设备放在 60 x 15 mm 培养皿中，每道菜 3-4 个设备。用薄层 DI H2O 填充 150 x 15 mm 培养皿，以容纳 60 x 15 mm 培养皿中的 3 个。这一步骤在微流体设备周围创造了一个潮湿的环境。
    3. 使用新的尖端并重新消耗细胞:当管子保持在冰上时，通过管道将悬架管道彻底地混合水凝胶。
    4. 将尖端插入设备的注入端口，然后缓慢而稳定地将细胞的 3 μL:水凝胶悬浮液插入使用 20 μL 移液器尖端的微流体设备的组织区域入口。填充端口后，停止注注并取出尖端。重复所有设备，或整个准备好的水凝胶悬架。
      注意:细胞体积小:水凝胶悬架加热/冷却非常快，因此尽可能长时间地将悬架保持在冰上是相关的。插入时，移液器将溶液从冰上移开，并尽快插入设备中，因为水凝胶可能开始在移液器尖端聚合。创建少量的细胞很重要:一次一个水凝胶悬架，因此，如果要注入许多设备，细胞:水凝胶悬架必须为每组 4 个设备进行新鲜。
    5. 用钳子翻转培养皿中的设备，然后用水将其放在大培养皿中。在 37 °C 孵化器中孵化 9 分钟，用于水凝胶聚合。
    6. 将设备从孵化器中取出，将设备直立翻转，并在 37 °C 下孵育 9 分钟，以完成水凝胶聚合。
    7. 将RPMI +B27 +胰岛素注射到侧翼介质通道（每个设备+20μL）。将设备放回 37 °C 的孵化器中。 每天用新鲜的RPMI+B27+胰岛素改变媒体渠道内的媒体。这些装置已被证明在14-21天20天内进行培养。
      注:由于每个芯片的介质量较小，为了防止介质蒸发，因此在装满 DI H2O 的大培养皿中维护设备非常重要，该盘是一个潮湿的腔室。此外，在常规媒体变化期间，可在通道入口/插座顶部输送过量的RPMI +B27 +胰岛素的小液滴。

4. 组织分析

  1. 实时成像
    注:所有实时成像应使用舞台孵化器进行，以保持 37 °C 和 5% CO2。
    1. 将设备放置在环境控制的阶段孵化器中。以最大帧速率记录每个设备内多个点的 30 s 视频。
    2. 要评估提取跳动信号后的组织收缩性，请使用补充自定义编写的 MATLAB 代码提取峰值（补充文件 2）来计算跳动间歇变异性。
    3. 在细胞培养罩中更改设备中的介质，然后放回细胞培养孵化器中。
  2. 免疫荧光染色
    1. 准备PBS-甘油:在PBS中溶解100毫米甘氨酸，并添加0.02%NaN3 用于长期存储。将pH调整为7.4。
    2. 准备PBS-Tween-20:将0.05%补间-20添加到PBS，并添加0.02%NaN3 用于长期存储。将pH调整为7.4。
    3. 准备如果缓冲区:添加0.2%Triton X-100，0.1%BSA，0.05%补间-20到PBS，并添加0.02%NaN3 用于长期存储。将pH调整为7.4。
    4. 准备10%山羊血清:在PBS的2mL中补充受精山羊血清，使100%山羊血清。然后，用18mL的PBS稀释2mL，使10%山羊血清。
    5. 通过在组织通道中加入 4% 的甲醛 （PFA） 并在 37 °C 下孵育 20 分钟来修复样品。
    6. 通过在组织通道中加入PBS-甘氨酸来清洗细胞，在室温下进行10分钟的潜伏。
    7. 在室温下加入 PBS-Tween-20 10 分钟，清洗细胞。
    8. 在室温下将 IF 缓冲器添加到组织通道中 30 分钟，使细胞渗透。
    9. 在室温下将10%山羊血清溶液添加到组织通道中1小时，从而阻断细胞。
    10. 以所需的浓度稀释10%山羊血清中的非共生原抗体（参照 补充文件3），加入组织通道，并在4°C的夜间孵育样本。
    11. 第二天，在室温下将PBS-Tween-20添加到组织通道中，每次3次，每次20分钟，清洗样品。
      注意:从步骤 4.2.12 开始，在黑暗中执行所有任务，因此样品不受光线影响。
    12. 以所需的浓度稀释 PBS-Tween-20 中的二次抗体，在 10，000 x g 下在离心机中稀释 10 分钟以收集任何沉淀物，然后添加到组织通道中。
    13. 30 分钟 1 小时后，在室温下用 PBS-Tween-20 3x 清洗样品 10 分钟。
    14. 在组织通道中添加防褪色或所需的安装介质。然后，如果需要更高的放大倍率，可以使用荧光显微镜或共焦显微镜对样品进行成像。为了可视化整个 3D 组织，可以在不同的 z 平面上堆叠和重建图像，以形成具有代表性的 3D 图像。

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Results

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为了从高PSC获得高度纯化的CMs群，使用了涉及连分化协议33和富山净化步骤34组合的修改版本（参照图1A表示实验时间线）。hiPSC 需要像殖民地一样，约 85% 的汇合，并在通过 3-4 天后，在 CM 分化（图 1B）的开始，均匀地传播到整个文化中。具体来说，在第 0 天，hiPSC 殖民地应具有多能转录因子的高表达性，包括 SOX2 和 Nanog（图 1C）。根据这一协议，图1D证明了干细胞分化和纯化过程的成功证据，密集的CMs群落表达肉瘤α-actinin，周围最少的非CM。此外，hCF必须保持纤维细胞形态与高维他明表达（图1E），所以他们要在P10之前使用，因为他们可能会开始区分肌纤维细胞在更高的通道

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Discussion

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形成具有增强细胞相互作用和仿生3D结构的体外人体心脏组织模型，对于基本的心血管研究和相应的临床应用至关重要。此概述的协议解释了微流体设备中 3D 人类不运动性心脏组织的发展，使用干细胞衍生 CMs 与连接 CFs 共同培养，这些 CMs 封装在胶原蛋白水凝胶中，以模拟原生心肌的复杂细胞组成和结构。这个特定的协议是高度可重复的，因为设备的特殊结构已经优化和验证的3D不亚索性心脏组织形成从大鼠衍生的心脏细胞，和人类干细胞分化的CMs，从hESC，和两种类型的hiPSC（SCVI20和IMR90-4），如我们最近出版的20。我们和其他许多群体一样，发现干细胞CM分化的效率因细胞系35、36而异。实施的净化协议有助于提高差别化产量:然而，净化时间的长短取决于细胞线和分化效率。因此，在微流体组织形成方面所取得的成功可能因细胞系而异。

为了捕捉心肌的相关成分，被证明...

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Disclosures

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作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgements

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我们要感谢NSF职业奖#1653193，亚利桑那州生物医学研究委员会（ABRC）新调查员奖（ADHS18-198872），以及弗林基金会奖为该项目提供资金来源。HIPSC线SCVI20来自由NIH R24 HL117756资助的斯坦福心血管研究所博士吴约瑟。HIPSC线，IMR90-4，是从威塞尔研究所55，56获得。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.65 mL 离心管VWR87003-290
1 mm 活检穿刺VWR95039-090
1.5 mm 活检穿刺VWR95039-088
15 mL Falcon 管VWR89039-670
18x18 mm 盖玻片VWR16004-308盖玻片应为 1 号，以便进行高放大倍率成像
4% 多聚甲醛ThermoFisher101176-014
6 孔扁平瓶组织培养板VWR82050-844
B27 减去胰岛素LifeTechA1895602
B27 加胰岛素LifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
胶原蛋白 I，大鼠尾Corning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001也可以在内部制造
EDTAVWR45001-122
乙醇
FGM3VWR10172-048
GFR-基质胶VWR47743-718
甘氨酸SigmaG8898-500G
山羊血清VWR10152-212
hESC-Matrigel康宁BD354277
IPA
IWP2SigmaI0536-5MG
KimwipesVWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigma S5881-500G
笔/链球菌VWR15140122
皿 （150x15mm）VWR25384-326
培养皿 （60x15mm）VWR25384-092
酚红SigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 减去葡萄糖VWR45001-110
硅晶片（100mm）大学晶片1196
乳酸钠SigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 显影剂ThermoFisherNC9901158
Sylgard 弹性体Essex BrownellDC-184-1.1
T75 培养瓶VWR82050-856
Triton X-100SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
胰蛋白酶-EDTA （0.5%）ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632干细胞技术72304
EVG620 对准器EVG
等离子清洗剂 PDC-32GHarrick Plasma
蔡司 AxioObserver Z1 显微镜尼康
徕卡 SP8 共聚焦显微镜徕卡
器 器 巴 培养

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