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方法文章

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

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DOI：

10.3791/62539

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2021年6月15日

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

本文内容

摘要

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。

摘要

心血管疾病（CVD）仍是全球最主要的死亡原因。然而，在体外（in vitro）模拟心肌——即心肌组织——的生理和生物学复杂性一直极具挑战性。主要难点在于需要获取具有成人特征或成人心肌细胞（CMs）表型的人类心肌细胞，并能够有效重现心肌组织的细胞复杂性和精细的三维结构。遗憾的是，由于伦理问题以及缺乏可获取的原代患者来源的人类心脏组织，加之心肌细胞增殖能力极低，导致可用的人类心肌细胞来源成为心脏组织工程发展的限制性环节。为此，目前大多数研究已转向利用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为心肌细胞，作为人类心肌细胞的主要来源，从而推动hiPSC-CMs在体外（in vitro）心脏组织建模实验中的广泛应用。

在此工作中，我们展示了一种在微流控装置内构建三维成熟干细胞来源的人心脏组织的实验方案。我们具体阐述并以可视化方式演示了三维 体外 由hiPSC来源的心肌细胞构建各向异性的心脏类器官芯片模型。本文主要描述了一种用于富集心肌细胞的纯化方案，通过将心肌细胞与人源心肌成纤维细胞（hCFs）按特定比例混合，实现共培养，并将该共培养体系悬浮于基于胶原蛋白的水凝胶中。进一步地，我们将负载细胞的水凝胶注入结构明确的微流控装置内，该装置内置交错排列的椭圆形微柱，作为表面拓扑结构，可诱导周围细胞及水凝胶基质高度有序排列，从而模拟天然心肌组织的结构特征。我们预期，所提出的三维各向异性心脏类器官芯片模型适用于基础生物学研究、疾病建模，以及作为药物筛选工具用于药理学测试。

引言

近年来，组织工程技术已被广泛探索，以辅助再生医学和疾病建模中的体内临床发现1,2。由于获取人原代心肌组织存在固有困难，且难以构建符合生理特征的体外替代模型，导致对心血管疾病（CVDs）复杂机制的基础理解受到限制，因此研究尤其重视体外心肌组织建模1,3。传统模型通常采用二维单层细胞培养体系。然而，已有大量研究表明，在三维环境中培养心肌细胞对于模拟心肌组织的天然微环境以及复杂的细胞间相互作用至关重要4,5。此外，迄今为止大多数模型仅包含由干细胞分化而来的单一心肌细胞（CMs）培养体系。然而，心脏由多种细胞类型组成6，并具有复杂的三维结构7，因此迫切需要提高三维体外模型中组织构成的复杂性，以更真实地模拟天然心肌组织的细胞组成。

迄今为止，人们已探索了多种不同方法来构建心肌的仿生三维模型8。这些方法包括从实验装置 出发，实现实时测定生成的力，例如将单一培养的心肌细胞（CMs）接种于薄膜上（称为肌肉薄片（MTFs））9，到在三维水凝胶基质中共同培养心脏细胞，并将其悬置于自支撑悬臂之间（称为工程化心肌组织（EHTs））10。其他方法则聚焦于采用微模塑技术以模拟心肌的各向异性，例如在组织补片中将单一培养的心肌细胞置于突出的微柱之间并悬浮于三维水凝胶中11，或将单一培养的心肌细胞接种于具有凹陷微沟槽的结构中12,13。上述每种方法均有其固有的优势与局限性，因此，应根据预期应用及相应的生物学问题选择合适的技术。

增强干细胞来源的心肌细胞（CMs）成熟的能力对于成功实现 体外 类成人心肌组织的构建及研究结果向临床解读的转化。为此，已在二维和三维条件下广泛探索了心肌细胞成熟的方法14,15,16例如，EHTs 中整合的电刺激、通过表面形貌强制心肌细胞（CMs）排列、信号提示、共培养产生的生长因子和/或三维水凝胶环境等，均可至少在以下一个方面促进心肌细胞成熟：细胞形态、钙处理能力、肌节结构、基因表达或收缩力。

在这些模型中，利用微流控平台的方法具有某些天然优势，例如可控制浓度梯度、所需细胞输入量少以及试剂消耗极少。此外，微流控平台能够同时生成大量生物学重复样本，有助于更深入地解析目标生物学机制，并通过增加实验样本量来提升统计效能17,18,19。另外，在微流控器件的制备过程中采用光刻技术，可实现微米级和纳米级精度结构（如形貌特征）的构建，这些结构可作为介观尺度的信号，增强周围细胞结构及宏观组织架构18,20,21,22，适用于组织再生与疾病建模等多种应用。

我们先前已证明，可开发一种新型的芯片上三维心脏组织模型，该模型通过固有的椭圆形微柱形式的表面拓扑结构，引导包埋于水凝胶中的共培养心肌细胞排列成相互连接的各向异性组织20。在培养14天后，微流控装置内形成的心脏组织在表型、基因表达谱、钙处理特性以及药物反应方面，相较于单层培养和各向同性三维对照组更为成熟23。本文所述方案详细阐述了在微流控装置中利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-derived CMs）构建此类三维共培养、定向排列（即各向异性）人源心脏组织的方法。具体而言，我们介绍了将hiPSCs向心肌细胞分化与纯化的步骤，将人心脏成纤维细胞（hCFs）与心肌细胞共培养以建立稳定的共培养体系，将包埋于胶原蛋白水凝胶中的细胞群体植入微流控装置，以及随后通过收缩功能检测和免疫荧光分析对构建的三维组织进行评估。所获得的三维工程化微组织适用于多种应用，包括基础生物学研究、心血管疾病（CVD）建模以及药物筛选。

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方案

所有细胞操作和试剂配制均须在生物安全柜中进行。确保所有与细胞接触的表面、材料和设备均无菌（例如，用70%乙醇喷洒消毒）。细胞应在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养。所有人诱导多能干细胞（hiPSC）的培养与分化均在6孔板中进行。

1. 微流控装置的制备（预计耗时：1 周）

  1. 光刻技术
    注意：使用 CAD 文件（作为补充文件1提供）设计的掩模包含微流控通道的结构。将该设计打印到透明掩模上，然后在洁净室内对4英寸硅片上的负性光刻胶SU8 2075进行标准光刻工艺。
    1. 用异丙醇（IPA）清洗硅片，并用氮气吹干。在200 °C下烘烤5分钟以去除水分。
      注意：操作硅片时应使用硅片镊子。
    2. 将硅片放入匀胶机中，在硅片中心滴加3–4 mL SU8胶，然后启动匀胶程序以形成厚度为200 µm的胶层（即：15秒内从0加速至500 rpm，保持10秒；再用5秒加速至1,200 rpm，保持30秒；最后减速15秒直至停止）。
    3. 取出硅片，在65 °C下预烘7分钟，随后在95 °C下继续烘烤45分钟。
    4. 将硅片转移至掩模对准仪，将带有紫外滤光片的透明掩模放入掩模夹具中。对硅片进行两次曝光，每次230 mJ/cm2，间隔30秒，总曝光量为460 mJ/cm2。
    5. 将曝光后的硅片置于50 °C烘箱中进行曝光后烘烤，过夜。
    6. 次日早晨关闭烘箱，待硅片冷却至室温后，将其浸入SU8显影液中。每隔5分钟将硅片从显影液中取出，用IPA冲洗，然后再放回显影液中。
    7. 约20分钟后，或当IPA冲洗液变澄清时，用氮气吹干硅片，并在150 °C烘箱中进行坚膜烘烤；当烘箱温度达到150 °C时立即关闭烘箱，但不要打开箱门。让硅片在烘箱内自然冷却至室温后再取出。
    8. 使用台阶仪确认SU8的高度，并用光学显微镜检查其图形特征。确认无误后，将硅片用胶带固定于一个150 mm的塑料培养皿内。
  2. 软光刻技术
    ​注意：固定在培养皿内的硅片需进行硅烷化处理，以防止PDMS粘附于SU8微结构上。
    1. 将固定有硅片的塑料培养皿倒置于另一个盛有0.4 mL甲基三氯硅烷（MTCS）的玻璃培养皿上方，使硅片暴露于MTCS蒸气中4分钟。随后将硅片恢复正向放置，并盖上培养皿盖子。
    2. 按10:1的比例将30 g硅弹性体基质与固化剂混合。打开培养皿盖子，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒在硅片上，随后在真空干燥器中脱气。
    3. 待所有气泡完全消除后，将硅片置于80 °C下加热1.5小时，使PDMS完全固化。
    4. 小心剥离PDMS，使用1 mm和1.5 mm的活检打孔器分别在组织入口和培养基通道处打孔，形成进样口和出样口。
    5. 用胶带清洁PDMS通道以去除灰尘。接着将盖玻片（18 × 18 mm，No.1）浸泡在70%乙醇中至少15分钟，然后用擦拭纸擦干。
    6. 将盖玻片和PDMS通道（结构面朝上）同时置于等离子体处理仪中（设定为高功率），处理1分钟，随后迅速将两者贴合，并放入80 °C烘箱中过夜，以增强键合强度。
      注意：键合过程中，应在PDMS通道边缘施加轻微压力，以确保PDMS与玻璃之间密封良好，但应避免按压通道区域，以防通道塌陷。
  3. 装置制备
    1. 将键合好的PDMS装置浸入去离子水（DI H2O）中，使用液体循环程序进行高压灭菌。随后吸除装置中的液体，再次使用重力循环程序进行高压灭菌。最后，在80 °C下干燥灭菌后的装置，过夜。

2. 干细胞培养（预计持续时间：1-2 个月）

  1. hiPSC 培养与维持
    注意：hiPSCs 在解冻后需连续培养三个传代 体外 冻存或分化前，将hiPSCs在E8或mTeSR1培养基中培养。 培养基，根据细胞系的不同，置于基底膜基质包被的培养板上24.
    1. 为使用hESC级别的基底膜基质包被培养板，将一份基质培养基（体积依批次而定，通常为200–300 µL；储存于-80 °C）加入冰预冷的25 mL DMEM/F-12K培养基中，于冰上解冻。将1 mL该悬液加入6孔板的每个孔中。将培养板置于37 °C培养箱中孵育至少1小时。
    2. 解冻后，通过添加 5 µM Y-27632 来修饰用于 hiPSC 培养的 E8 培养基25 (E8+RI)。此后使用该培养基培养24小时，然后更换为新鲜E8培养基。
      注意：常规换液时，使用未添加额外成分的E8培养基培养hiPSC。日常维持培养需每天更换E8培养基，大约在上一次换液后24小时进行。
    3. 第3天或第4天传代细胞，吸除培养基，每孔加入1 mL 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤。
      注意：确保细胞融合度约为70%，不要让细胞生长超过70%融合度。
    4. 吸除 DPBS，然后每孔加入 1 mL 0.5 mM EDTA，在室温下孵育 6–7 分钟。
    5. 小心吸除EDTA，每孔加入1 mL E8+RI，用1 mL移液器反复吹打表面约5–10次以收集全部细胞。将细胞悬液收集至15 mL离心管中。
    6. 计数细胞悬液，并以所需细胞密度（即约每孔20万）在E8+RI培养基中传代。
    7. 24小时后更换为E8培养基（不含RI）。细胞在含RI的培养基中培养时间不得超过24小时。
      注意：E8 培养基不应加热至 37 °C。在用于细胞培养前，应始终在室温下放置以使其自然升温。
  2. 心肌细胞（CM）定向分化
    注意：不同株系的hiPSCs之间存在异质性，这一点至关重要。26,27因此，以下步骤可能需要针对每种细胞系进行优化。请按照以下步骤进行心肌细胞分化。
    1. 将10 mL不含胰岛素的B27和5 mL青霉素/链霉素（pen/strep）加入500 mL RPMI 1640培养基中，配制RPMI + B27 - 胰岛素。
    2. 在500 mL RPMI 1640培养基中加入10 mL B27和5 mL青霉素-链霉素溶液，配制RPMI + B27 + 胰岛素培养基。
    3. 将10 mL B27、5 mL 青霉素-链霉素溶液和4 mM乳酸钠加入500 mL无葡萄糖的RPMI 1640培养基中，配制含B27和胰岛素的无葡萄糖RPMI培养基。
    4. 当hiPSCs达到85%融合度时，开始诱导分化（第0天）：将旧培养基更换为含10 µM CHIR99021的4 mL RPMI + B27 - 胰岛素培养基，加入6孔板的每个孔中（即，将25 µL的10 mM CHIR99021加入25 mL RPMI + B27 - 胰岛素培养基中，混匀后立即每孔加入4 mL）。
      注意：CHIR99021 是一种 GSK 抑制剂，可导致 Wnt 通路激活。CHIR99021 的最佳浓度和初始汇合度因细胞系而异28始终在正式实验前检测6-12 µM CHIR99021的浓度梯度以及一系列细胞接种密度，以确定诱导分化的最佳条件。
    5. 24 小时后（第 1 天），吸去培养基，每孔加入 5 mL 预热的 RPMI + B27 - 胰岛素。
    6. 在添加 CHIR99021 后的第 72 小时（第 3 天），从 6 孔板的每个孔中收集 2.5 mL 用过的培养基，共收集 15 mL 用过的培养基至一支离心管中。
    7. 加入15 mL新鲜的RPMI + B27 - 胰岛素培养基。向混合培养基管中加入IWP2，使其终浓度为5 µM（即每1 mL混合培养基中加入1 µL浓度为5 mM的IWP2，或向总共30 mL培养基中加入30 µL IWP2）。
    8. 每孔移除约 1.5 mL 剩余培养基，使每孔保留 1 mL 培养基。剧烈振荡培养板，以充分去除细胞碎片。随后吸除余下的旧培养基，每孔加入 5 mL 含 IWP2 的混合培养基。
      ​注意：向细胞中添加 IWP2 可导致 Wnt 信号通路抑制。
    9. 第5天，吸去每个孔中的培养基，更换为5 mL预热的RPMI + B27 - 胰岛素。
    10. CM成熟：在第7天、第9天和第11天，吸出每孔中的培养基，并更换为5 mL预热的RPMI + B27 + insulin。在此期间应可观察到自发性搏动。
    11. CM纯化：在第13天和第16天，开始葡萄糖饥饿处理，吸除每孔中的培养基，用1 mL 1×DPBS洗涤每孔，然后加入5 mL预热的无葡萄糖RPMI + B27 + 胰岛素，并补充4 mM乳酸钠。
    12. 第19天，吸除用过的培养基，每孔加入5 mL预热的RPMI + B27 + insulin，以促进细胞纯化后的恢复。
    13. 第21天，按照下述心肌细胞解离方案（步骤3.3）重新铺板细胞。目标铺板密度为1.5–2 × 106 每孔细胞数接种于6孔板中。例如，若分化效率较高，通常将6孔扩增至9孔即可。
    14. 从第21天开始，吸出每孔中的培养基，每隔2-3天加入4 mL RPMI + B27 + insulin。
      ​注意：hiPSC-CMs 在第 23 天后即可用于实验。

3. 在微流控装置内构建三维心肌组织：（预计耗时：2-3 小时）

  1. 人脑类器官培养
    1. 在T75培养瓶中培养人左心室心脏成纤维细胞（hCFs；购自Lonza公司，每瓶接种250K个细胞），使用成纤维细胞生长培养基-3（FGM3）。每隔一天更换一次培养基，当细胞融合度达到70%时进行传代。建议在第10代之前使用hCFs，因为高代次细胞可能开始向肌成纤维细胞分化。29.
  2. 人脑类器官解离
    1. 为了分离人冠状动脉成纤维细胞（hCFs），首先将培养瓶从培养箱中取出，放入生物安全柜内，开始吸除培养瓶中的废弃培养基。随后，用3 mL的1×DPBS清洗T75培养瓶，盖紧瓶盖后轻轻晃动培养瓶。
    2. 吸除 DPBS。加入 3 mL 预热的 1x 胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，轻轻倾斜并旋转培养瓶，使其均匀覆盖瓶底。将培养瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 4–6 分钟，期间在显微镜下观察，确认细胞是否已脱落，表现为细胞呈圆形并开始漂浮。若未完全脱落，则将培养瓶放回培养箱继续孵育 1 分钟。
    3. 加入3 mL预热的FGM3以中和胰蛋白酶的作用，然后用移液器将溶液反复吹打贴壁的CFs，使其从培养瓶底部脱落。
    4. 将细胞悬液收集至15 mL离心管中。取10 µL细胞悬液加入血细胞计数板，用显微镜进行细胞计数。
    5. 将细胞悬液在200 x g 孵育4分钟。小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。
    6. 将沉淀重悬于新鲜的FGM3中，制成所需浓度为75 x 106 细胞/mL。可传代一部分细胞（每T75培养瓶接种250K个细胞），或按照以下方案制备三维心肌组织。
  3. CM解离
    ​注意：心肌细胞经分化和纯化后，将其制备成适用于注射至微流控装置中的悬液。
    1. 从培养箱中取出心肌细胞培养板，吸除培养基。随后用1x DPBS洗涤各孔，每孔加入1 mL，适用于6孔板。取6 mL DPBS，每孔加入1 mL。
    2. 吸除DPBS，注意不要扰动贴壁于培养板上的细胞。用移液器加入6 mL预热的细胞解离液（例如TrypLE express），每孔加入1 mL。将细胞置于37 °C培养箱中孵育10 min。
    3. 用等体积的 RPMI + B27 + 胰岛素（即每孔 1 mL）中和酶活性，并使用 1 mL 移液器在培养容器中反复吹打，机械解离细胞。
    4. 在15 mL离心管中收集CM。以300 x g离心 g 3 分钟
    5. 吸弃上清液。用5 mL RPMI + B27 + 胰岛素重悬细胞沉淀。使用1 mL移液器反复吹打溶液，确保充分混匀。取10 µL细胞悬液，加入血细胞计数板，测定总细胞数。
    6. 再次以 300 x g 3 分钟（以确保完全去除 TrypLE），吸除上清液。然后加入适量的 RPMI + B27 + 胰岛素，使细胞密度达到 75 x 106 cells/mL
      注意：如果心肌分化/筛选未能获得高比例的心肌细胞（即，CM%较低）， >80%），则认为这些细胞不适合用于组织构建。此时应通过调整CHIR99021的浓度和初始接种密度来优化分化过程。若心肌细胞纯化效果仍需提高，可采用其他方法，例如利用荧光激活细胞分选（FACS）或磁珠激活细胞分选（MACS）对心肌细胞进行分选。30,31,32.
  4. 胶原蛋白制备
    注意：使用高浓度胶原蛋白储备液（浓度范围为8-11 mg/mL）制备胶原蛋白。用于制备细胞-水凝胶混合物的胶原蛋白浓度为6 mg/mL，最终工作浓度为2 mg/mL。根据需注射的装置数量，需反向计算所需制备的胶原蛋白溶液体积。
    1. 在生物安全柜内将所有所需试剂置于冰上。
      ​注意：胶原蛋白是一种具有温度响应性的水凝胶，因此需保持低温以防止其过早聚合。
    2. 取75 µL储备胶原蛋白溶液（8 mg/mL），分装至预冷的微量离心管中，置于冰上。胶原蛋白溶液黏度较高，需用移液器缓慢吸取。
    3. 取13.85 µL培养基（即RPMI + B27 + 胰岛素），加入同一离心管中。
    4. 然后取10 µL酚红加入混合物中并重新悬浮。
    5. 最后，取1.15 µL的1N NaOH加入该悬液中。
    6. 使用200 µL移液器吸头重悬该悬浮液。
      注意：胶原蛋白储备液呈酸性 pH，因此在用于包封心肌细胞前需加入 NaOH 进行中和。酚红可作为 pH 指示剂，因此应在加入 NaOH 前先加入酚红。此时胶原蛋白溶液呈黄色，表明其处于酸性状态。加入 NaOH 后，溶液应变为橙色至淡粉色，表明已达到中和。
  5. 水凝胶混合物与细胞制备
    ​注意：此步骤中，细胞将被包埋于基于胶原蛋白的水凝胶中。在后续步骤中，细胞及所有水凝胶前体均应置于冰上。
    1. 此时，如果尚未对CFs进行胰蛋白酶消化，则将CM悬液置于15 mL离心管中，管盖松开以允许气体流通，并存放于37 °C培养箱中。同时，消化CFs并以75 x 10⁶密度收集6 细胞/mL，用于上样至装置。
    2. 将悬浮的心肌细胞（CMs）与成纤维细胞（CFs）按4:1的比例混合。取8 µL心肌细胞悬液，加入预冷离心管中。然后取2 µL成纤维细胞，加入离心管中的细胞悬液中。
    3. 重悬细胞悬液，取5.6 µL细胞悬液，加入一支新的微量离心管中。
    4. 取4 µL上述步骤中刚配制的胶原蛋白，加入到4:1的CM:CF混合物中。再加入2.4 µL生长因子减少型（GFR）基底膜基质，使最终细胞密度为35 x 106 细胞/mL，用于仪器注射。用移液器将混合液上下吹打，确保细胞悬液均匀。
  6. 装置插入
    注意：细胞与水凝胶混合物制备完成后，需立即注入装置中。
    1. 将灭菌后的微流控装置从80 °C烘箱中取出，放入生物安全柜中至少1小时，待其冷却至室温后再进行细胞悬液的加入，以保持装置的无菌状态。
    2. 将装置放入60 × 15 mm培养皿中，每皿放置3-4个装置。用去离子水在150 × 15 mm培养皿中覆盖一层薄层2O 用于放置60个直径15毫米的培养皿中的3个。此步骤可为微流控装置周围创造一个加湿环境。
    3. 使用新的枪头，在保持离心管置于冰上的同时，通过移液充分重悬细胞-水凝胶混合物。
    4. 将移液枪头插入装置的注射口，使用20 µL移液枪头缓慢而稳定地向微流控装置的组织区域入口注入3 µL细胞-水凝胶悬浮液。当注射口充满后，停止注射并取出枪头。对所有装置或全部制备好的水凝胶悬浮液重复此操作。
      ​注意：细胞-水凝胶悬浮液的体积较小，升温或降温速度很快，因此应尽可能长时间地将其置于冰上。操作时，应将悬浮液从冰上取下后立即用移液器吸取，并迅速注入装置中，以防水凝胶在移液器吸头内开始聚合。每次应制备少量细胞-水凝胶悬浮液；若需注入多个装置，每处理4个装置后均需重新配制新鲜的细胞-水凝胶悬浮液。
    5. 用镊子将装置在培养皿中翻转，并放入盛有水的大型培养皿中。置于37 °C培养箱中孵育9分钟，以实现水凝胶聚合。
    6. 将装置从培养箱中取出，翻转至正立位置，并在37 °C下继续孵育9分钟，以完成水凝胶的聚合。
    7. 向两侧的培养基通道中注入RPMI + B27 + 胰岛素（每台设备约20 µL）。将设备放回37 °C培养箱中。每天用新鲜的RPMI + B27 + 胰岛素更换通道中的培养基。已证明这些设备可培养14–21天。20.
      ​注意：由于每个芯片中的培养基体积较小，为防止培养基蒸发，务必将装置置于盛有去离子水的大培养皿中以维持湿度。2O，用作加湿培养室。此外，在常规更换培养基时，可将少量多余的RPMI + B27 + 胰岛素滴加至通道入口/出口的顶部。

4. 组织分析

  1. 活体成像
    注意：所有活体成像均应在配备环境控制的载物台培养箱中进行，以维持 37 °C 和 5% CO2 的条件。
    1. 将装置放入环境可控的载物台培养箱中，在每个装置内的多个位置以最大帧率记录 30 秒的视频。
    2. 在提取搏动信号后，为评估组织收缩性，使用配套的自定义 MATLAB 代码提取峰信号（补充文件 2），用于计算搏动间期变异性。
    3. 在细胞培养超净台中更换装置内的培养基，然后将其放回细胞培养箱中。
  2. 免疫荧光染色
    1. 配制 PBS-甘氨酸溶液：将 100 mM 甘氨酸溶解于 PBS 中，并加入 0.02% NaN3 以长期保存。调节 pH 至 7.4。
    2. 配制 PBS-Tween-20 溶液：向 PBS 中加入 0.05% Tween-20，并加入 0.02% NaN3 以长期保存。调节 pH 至 7.4。
    3. 配制免疫荧光缓冲液（IF 缓冲液）：向 PBS 中加入 0.2% Triton X-100、0.1% BSA 和 0.05% Tween-20，并加入 0.02% NaN3 以长期保存。调节 pH 至 7.4。
    4. 配制 10% 山羊血清：将冻干的山羊血清用 2 mL PBS 重悬，制成 100% 山羊血清；然后将该 2 mL 溶液加入 18 mL PBS 中稀释，得到 10% 山羊血清。
    5. 向组织通道中加入 4% 多聚甲醛（PFA）固定样本，并在 37 °C 下孵育 20 分钟。
    6. 用 PBS-甘氨酸溶液在室温下洗涤组织通道两次，每次孵育 10 分钟。
    7. 用 PBS-Tween-20 溶液在室温下洗涤一次，持续 10 分钟。
    8. 向组织通道中加入 IF 缓冲液，在室温下孵育 30 分钟，以通透细胞。
    9. 向组织通道中加入 10% 山羊血清溶液，在室温下孵育 1 小时，以封闭非特异性结合位点。
    10. 将未标记的一抗用 10% 山羊血清按所需浓度稀释（参见 补充文件 3），加入组织通道中，并在 4 °C 下过夜孵育。
    11. 次日，用 PBS-Tween-20 溶液在室温下洗涤组织通道三次，每次 20 分钟。
      注意：从步骤 4.2.12 起，所有操作均需在避光条件下进行，以防止样本暴露于光照下。
    12. 将二抗用 PBS-Tween-20 按所需浓度稀释后，在 10,000 x g 条件下离心 10 分钟以去除沉淀物，然后加入组织通道中。
    13. 孵育 30 分钟至 1 小时后，用 PBS-Tween-20 在室温下洗涤三次，每次 10 分钟。
    14. 向组织通道中加入抗荧光淬灭剂或所需的封片剂。随后可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜（如需更高放大倍数）进行成像。为观察完整的三维组织结构，可对不同 z 平面的图像进行叠加和重建，生成具有代表性的三维图像。

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结果

为了从人诱导多能干细胞（hiPSCs）中获得高纯度的心肌细胞（CMs）群体，采用了一种改良方案，该方案结合了Lian分化方案33与Tohyama纯化步骤34（实验时间线见图1A）。在开始心肌细胞分化时（即传代后3–4天），hiPSCs应呈集落状生长，汇合度约为85%，并在培养孔中均匀分布（图1B）。具体而言，在第0天，hiPSC集落应高表达包括SOX2和Nanog在内的多能性转录因子（图1C）。根据本方案，成功的干细胞分化与纯化过程如图1D所示，可见密集的心肌细胞集落表达肌节α-肌动蛋白（α-actinin），周围非心肌细胞极少。此外，人心脏成纤维细胞（hCFs）必须保持成纤维细胞形态，并高表达波形蛋白（vimentin）（图1E），因此应在第10...

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讨论

构建一种具有增强的细胞间相互作用和仿生三维结构的体外人类心肌组织模型，对于基础心血管研究及其相应的临床应用至关重要1。本方案详细阐述了在微流控装置中利用源自干细胞的心肌细胞（CMs）与包裹于胶原水凝胶中的结缔组织成纤维细胞（CFs）共培养，构建三维各向异性人类心肌组织的方法，以模拟天然心肌复杂的细胞组成与结构。该特定方案具有高度可重复性，因为该装置的特定结构已针对源自大鼠心脏细胞以及人多能干细胞分化而来的CMs（包括hESCs及两种 hiPSCs系：SCVI20和IMR90-4）所形成的三维各向异性心肌组织进行了优化与验证，如我们近期发表的研究所示20。我们与许多其他研究团队均发现，不同细胞系间干细胞向心肌细胞的分化效率存在差异35,36。所采用的纯化方案有助于提高分化产率；然而，所需纯化时间的长短取决于细胞系及其分化效率。因此，不同细胞系在微流控组织构建中的最终成功率可能存在差异。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER Award #1653193）、亚利桑那州生物医学研究委员会（ABRC）新研究者奖（ADHS18-198872）以及弗林基金会奖为本项目提供的资金支持。人诱导多能干细胞系 SCVI20 来自斯坦福心血管研究所 Joseph C. Wu 博士，该研究所由美国国立卫生研究院（NIH R24 HL117756）资助。人诱导多能干细胞系 IMR90-4 来自 WiCell 研究所55,56。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.65 mL 离心管VWR87003-290
1 mm 活检打孔器VWR95039-090
1.5 mm 活检打孔器VWR95039-088
15 mL Falcon 管VWR89039-670
18x18 mm 盖玻片VWR16004-308盖玻片应为 No.1，以适用于高倍成像
4% 多聚甲醛ThermoFisher101176-014
6 孔平底组织培养板VWR82050-844
B27 不含胰岛素LifeTechA1895602
B27 含胰岛素LifeTech17504001
CHIR99021VWR10188-030
胶原蛋白 I，大鼠尾部来源Corning47747-218
DMEM F12ThermoFisher11330057
DPBSThermoFisher21600069
E8ThermoFisherA1517001也可自行配制
EDTAVWR45001-122
乙醇
FGM3VWR10172-048
GFR-MatrigelVWR47743-718
甘氨酸SigmaG8898-500G
山羊血清VWR10152-212
hESC-MatrigelCorningBD354277
异丙醇（IPA）
IWP2SigmaI0536-5MG
Kimwipes 纸巾VWR82003-820
MTCSSigma440299-1L
NaN3SigmaS2002-25G
NaOHSigmaS5881-500G
青霉素-链霉素（Pen/Strep）VWR15140122
培养皿（150x15 mm）VWR25384-326
培养皿（60x15 mm）VWR25384-092
酚红SigmaP3532-5G
RPMI 1640ThermoFisherMT10040CM
RPMI 1640 不含葡萄糖VWR45001-110
硅晶圆（100 mm）University Wafer1196
乳酸钠SigmaL4263-100ML
SU8 2075MicrochemY111074 0500L1GL
SU8 显影液ThermoFisherNC9901158
Sylgard 弹性体Essex BrownellDC-184-1.1
T75 培养瓶VWR82050-856
吐温 X-100（Triton X-100）SigmaT8787-100ML
TrypLEThermoFisher12604021
胰蛋白酶-EDTA（0.5%）ThermoFisher15400054
Tween20SigmaP9416-50ML
Y-27632Stem Cell Technologies72304
EVG620 对准仪EVG
等离子清洗机 PDC-32GHarrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 显微镜Nikon
Leica SP8 共聚焦显微镜Leica

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