一种实验性脂肪变性的模型 体外肝细胞在脂质超载条件培养基中的培养

摘要

本方案旨在作为研究肝细胞因脂质过度暴露而引发的脂肪变性，以及相关的分子、生化和细胞变化的工具 体外.

摘要

代谢功能障碍相关性脂肪肝病（MAFLD），先前称为非酒精性脂肪肝病（NAFLD），是全球最常见的肝脏疾病，其与肥胖、2型糖尿病和血脂异常密切相关。肝脂肪变性，即脂滴在肝实质细胞中的积聚，是该疾病的关键特征，先于脂肪性肝炎、纤维化及终末期肝病中所见的炎症反应。肝细胞内脂质的积聚可能干扰外源性和内源性分子的正常代谢，并引发促进疾病进展的细胞过程。尽管脂肪变性的实验研究可在体内（in vivo）进行，但体外（in vitro）研究方法作为补充工具具有多种优势。在脂质超载条件培养基中培养肝细胞，是一种高度可重复的研究肝脂肪变性的优良方法，可用于识别与脂质积聚相关的细胞过程，如氧化应激和内质网应激、自噬、细胞增殖、细胞死亡等，同时也适用于药物疗效评估、毒理学检测等多种应用。本文旨在描述在脂质超载条件培养基中进行肝细胞培养的方法学。HepG2细胞在添加棕榈酸钠和油酸钠的RMPI 1640培养基中进行培养。值得注意的是，这两种脂质的比例对于促进脂滴积聚，同时维持细胞增殖和适度的死亡率至关重要，这与疾病状态下肝脏中的情况一致。本文展示了从脂质溶液母液的制备、混合、加入培养基到肝细胞培养的完整操作流程。通过该方法，可利用油红O染色清晰观察到肝细胞内的脂滴，并可获得细胞增殖/死亡率的变化曲线。

引言

与代谢功能障碍相关的脂肪肝在全球范围内高度流行^1,2；据估计，高达25%的人口受到影响³。该疾病先前被称为非酒精性脂肪肝病（NAFLD），现已更新命名为代谢功能障碍相关脂肪肝病（MAFLD），以更准确地反映其与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病和血脂异常相关的发病机制，以及该疾病的可能管理策略^3,4。

无论名称如何，该疾病均包含一系列广泛的组织病理学改变，其特征是肝脏中脂质异常大量积聚（肝细胞中脂肪含量>5%⁵），可从单纯性脂肪变性中常见的脂质积聚逐步发展为脂肪性肝炎，进而可能导致纤维化、肝硬化、肝细胞癌以及肝功能衰竭^5,6,7,8。由于其患病率不断上升，代谢相关脂肪性肝病（MAFLD）预计将成为肝移植的首要指征以及肝细胞癌的主要病因⁹。

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方案

1. 标准培养基与条件培养基的制备

1. 制备标准 RPMI 1640 培养基：在 RPMI 1640 培养基中添加 10% (v/v) 胎牛血清（FBS，预先热灭活）和 1% (v/v) 青霉素-链霉素溶液。使用 0.22 µm 滤器灭菌，4 °C 保存。
2. 制备棕榈酸盐储备液：在先前已添加 1% 牛血清白蛋白（无脂）的标准 RPMI 1640 培养基中配制 50 mM 的棕榈酸盐溶液。准备 5–10 mL 该储备液即可。使用 0.22 µm 滤器灭菌，避光保存于 4 °C，可保存长达 1 个月。
3. 制备油酸盐储备液：在先前已添加 1% 牛血清白蛋白（无脂）的标准 RPMI 1640 培养基中配制 50 mM 的油酸盐溶液。准备 10 mL 即可。使用 0.22 µm 滤器灭菌，避光保存于 -20 °C，可保存长达 1 个月。
4. 从上述预先配制的储备液中制备致脂肪变性培养基，配制 1 份棕榈酸盐 : 2 份油酸盐的致脂肪变性培养基，分为两种浓度条件：轻度脂肪变性和重度脂肪变性。
   1. 轻度脂肪变性：在 100 mL 标准 RPMI 1640 培养基中配制 1 份棕榈酸盐 : 2 份油酸盐（50 µM）混合液。使用 0.22 µm 滤器灭菌，4 °C 保存，可保存长达 1 周。
   2. 重度脂肪变性：在 100 mL 标准 RPMI 1640 培养基中配制 1 份棕榈酸盐 : 2 份油酸盐（500 µM）混合液。使用 0.22 ....

结果

在致脂肪培养基中培养的肝细胞会在孔板表面广泛生长；然而，脂肪变性的肝细胞相比在对照培养基中培养的细胞，其生长速率较低。所建议的油酸（OA）与棕榈酸（PA）比例和浓度可确保细胞在培养期间的存活。接种 1 x 10⁵ 每孔2×10⁴个细胞接种于24孔板可达到最佳汇合度，如图所示 图1.

在培养细胞中，轻度和重度脂肪变性组的细胞活力低于对照组。事实上，随着培养时间的延长，细胞活力逐渐下降，在严重脂肪变性条件下培养4天时活力降至最低，仅为60%（图2A）。相应地，在脂肪变性条件下培养的肝细胞死亡率更高，且随着脂质暴露时间的延长而逐渐升高（图2B）。由于细胞增殖，细胞数量随时间逐渐增加（图2C）。然而，在轻度脂肪变性条件下，培养3天和4天时的增殖速率较低。相比之下，重度脂肪变性在24小时时即表现出增殖减少。

讨论

本方案旨在提供一种研究脂肪变性的策略 体外细胞培养是一种强大的工具，可用于研究在不同条件下暴露的细胞的细胞、分子、生化及毒理学特性。通过该方法，不仅可以将脂肪变性视为代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）这一复杂疾病过程中的一个阶段，还可将其理解为肝细胞过度暴露于脂质及其由此引发的可能后果。因此，该技术的应用不仅限于MAFLD的病理生理学研究，还涉及脂肪肝患者在接触治疗药物、环境污染物及其他可能受脂肪变性影响的条件时的相关研究。综上所述，本实验方案在毒理学、药理学以及疾病治疗靶点的识别方面具有潜在应用价值。

在本实验方案的建立过程中，最关键的步骤之一是制备促脂肪变性混合物：1份棕榈酸与2份油酸的混合物，该混合物自第2天起即可诱导脂肪变性（图3，图4），并在细胞活力略有下降和死亡率升高的情况下仍允许肝细胞增殖（图2）。然而，细胞活力的下降不应超过30%-40%，因为超出此范围可能提示毒性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物安全柜	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	II级 A2型 生物安全柜
瓶顶滤器	Corning, US	430513	无热原、聚苯乙烯、无菌。每袋1个滤器。0.22 μm，500 mL。
牛血清白蛋白（BSA）	Gold Biotechnology, US	A-421-10	细胞培养用无脂肪酸BSA
培养基RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022	-
胎牛血清（FBS）	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801	-
血细胞计数板	Marienfeld, DE	640010	-
HepG2细胞系	ATCC, US	HB-8065	人肝细胞癌细胞。
恒温培养箱（带湿度控制）	Thermo Electronic Corporation,US	型号：3110	温度（37 °C ± 1 °C），湿度（90% ± 5%），CO2（5% ± 1%）
倒置显微镜Eclipse	NIKON, JPN	型号：TE2000-S	-
异丙醇	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L	-
油红O试剂盒	Abcam, US	ab150678	用于组织学中中性脂肪显色的试剂盒。
多聚甲醛	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G	-
青霉素/链霉素	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	抗生素，含青霉素10,000 U/mL，链霉素10,000 μg/mL
pH计	Beckman, US	型号：360 PH/Temp/MV Meter	-
磷酸盐缓冲液	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023	-
血清移液管	Sarstedt, AUS	86.1253.001	无热原、无菌、5 mL
血清移液管	Sarstedt, AUS	86.1254.001	无热原、无菌、10 mL
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	用于培养基配制
油酸钠	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A	-
棕榈酸钠	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881	-
注射器滤器	Corning, US	431219	无热原、无菌、28 mm、0.2 μm。
台盼蓝	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G	-
0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA	Corning, US	25-052-Cl	-
24孔细胞培养板	Corning, US	3524	平底带盖。经组织培养处理。无热原、聚苯乙烯、无菌。每包1个。
96孔细胞培养板	Corning, US	3599	平底带盖。经组织培养处理。无热原、聚苯乙烯、无菌。每包1个。