细菌中的RIBO-seq:NGS测序样本收集和库准备协议

Summary

在这里，我们描述了细菌中RIBO-seq样品收集和制备的阶段。根据这些准则对图书馆进行排序，可以获得足够的数据，以便进行全面的生物信息分析。我们目前的协议很简单，使用标准的实验室设备，从裂解到获得库需要七天时间。

Abstract

核糖体分析技术（RIBO-seq）是目前研究 体内蛋白质合成过程的最有效工具。与其他方法相比，这种方法的优点是它能够通过精确绘制 mRNA 成绩单上核糖体的位置和数量来监控翻译。

本文介绍了细菌中RIBO-seq方法的样品采集和制备的连续阶段，突出了与实验规划和执行相关的细节。

由于RIBO-seq依赖于完整的核糖体和相关的mRNA，关键步骤是快速抑制转化和细胞的充分解体。因此，我们建议在液氮中过滤和闪光冷冻，用于细胞采集，并可选使用氯霉素进行预处理，以阻止细菌的转化。对于解体，我们建议用砂浆研磨冷冻细胞，在氧化铝的存在下缠缠，以机械地破坏细胞壁。在此协议中，不需要蔗糖垫或蔗糖梯度超中心化用于单体净化。相反，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 进行 mRNA 分离，然后应用核糖体足迹切除 （28-30 nt 波段），并提供令人满意的结果。这在很大程度上简化了方法，并减少了程序的时间和设备要求。为了准备图书馆，我们建议使用市售的小型RNA套件，用于新英格兰生物实验室的照明测序，遵循制造商的指南，并进行一定程度的优化。

由此产生的 cDNA 库为下一代测序 （NGS） 提出了所需的适当数量和质量。根据上述协议对准备的库进行排序，每个样本可绘制 2 到 10 毫升的独特映射读数，为全面的生物信息分析提供足够的数据。我们介绍的协议是快速和相对容易的，可以用标准的实验室设备执行。

Introduction

核糖体分析技术（RIBO-seq）是在加州大学旧金山^分校乔纳森·魏斯曼的实验室里开发的。与用于研究转化水平基因表达的其他方法相比，RIBO-seq 专注于与 mRNA 结合的每个核糖体，并提供有关其位置和成绩单上核糖体的相对数量的信息。它能够监测体内蛋白质合成的过程，并可以提供单一的圆环分辨率和精度，从而能够测量细胞中单个 mRNA 和整个转录组的核糖体密度。RIBO-seq 技术的基础在于，在翻译过程中，核糖体将 mRNA 分子结合，从而保护脚本的埋藏片段免受核糖化的消化。加入核糖这些片段称为核糖体脚印（RF），然后可以分离、测序并映射到它们产生的脚本上，从而检测核糖体的确切位置。事实上，自20世纪60年代以来，保护mRNA片段的核糖体能力一直被用来研究核糖体结合和翻译启动站点（TIS）2，3，4。然而，随着深测序技术的进步，RIBO-seq已成为翻译监测⁵的黄金标准，通过核糖体的参与，可以提供蛋白质合成⁶的全基因组信息。核糖体分析填补了抄本组和原型⁶号之间存在的技术空白。

要进行核....

Protocol

1. 样本收集

1. 准备细菌培养。我们建议每个样本的文化量为 100 mL。
2. 准备设备和试剂进行样品收集:每个样品两勺，无菌0.45微米混合纤维素酯膜（MCE）过滤器，50mL无菌管，液氮，50毫克/mL氯霉素在70%（vol/vol）乙醇（可选）。刺穿50mL管的盖子，使液氮蒸发，防止封闭管的爆炸。用实验室洗涤剂和 70% 乙醇去污勺子。
3. 预热过滤设备和细菌培养的生长温度的勺子之一。
   注:我们推荐一个带漏斗、碎底座、接地接头和47毫米弹簧夹的全玻璃过滤装置。
4. 在采样前，将氯霉素加入细菌培养中，最终浓度为100微克/mL，孵育1分钟（可选）。
5. 将液氮倒入 50 mL 无菌管中，并将第二勺放入管内冷却。
   谨慎！液氮会导致封闭的容器爆炸，因为蒸发时压力变化。为了防止这种情况，有必要在50mL管的盖子上打几个洞，以便液氮蒸发。
6. 通过过滤收集细胞。当介质通过膜时停止过滤，但不允许滤镜完全干燥。
7. 通过使用预热铲快速刮掉过滤盘上的细胞来收集细菌颗粒。立即将整个勺子与收获的细胞放在充满液氮的 50 mL 管中。收获的颗粒应完全覆盖在液氮中。
8. 让颗粒彻底冻结，并用先前冷却的第二勺清除冷冻细胞。关闭被刺穿的盖子，将管子转移到 -80°C 停止点
   注:每次采集样品后对铲子进行消毒。

2. 细胞裂解

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Results

这里提出的示范性结果是在一项研究WT 杆菌亚蒂利细胞 的孢子细胞的翻译规则的研究中取得的。隔夜培养物被稀释到_{600 OD 600} 等于 0.1 在 100 mL 的丰富中等和孵育在 37 °C 与剧烈摇晃，直到 OD₆₀₀ 达到 0.5-0.6。然后，丰富的介质被最少的介质取代，以诱导孢子过程，潜伏持续了长达四个小时。从 T0 开始每小时采集一次细胞 - 旋转感应 - 导致五个时间点。收获前一分钟，按照上述协议，用氯霉素处理培养物。细胞通过过滤在预热玻璃过滤系统中使用0.45μm混合纤维素酯膜（MCE）过滤器收集，并在液氮中闪光冻结。

赖苏中获得的核糖核酸量取决于生长条件、培养量和密度。按照我们的协议，100mL的细菌培养（杆菌亚提利）平均产生1-4毫克RNA。从上述实验中获得的利萨特示例见表1。

Discussion

核糖体分析的关键技术挑战是需要快速抑制翻译，以便在特定的生理兴趣状态下捕获 mRNA 上的核糖体快照。为此，通常使用液氮中的转化抑制剂、快速收获和闪光冷冻。使用抗生素是可选的，因为它们会导致人工制品。氯霉素是一种常用的药物，用于抑制细菌RIBO-seq中拉长的核糖体。然而，它并不阻止启动，导致核糖体的积累约6个科顿下游的翻译启动网站^14。此外，其抑制肽转移酶反应的能力可能取决于核糖体P-和A部位基材的性质。据推测，CAM逮捕核糖体更有效地与格利，阿拉，塞尔，赛斯，或Thr作为倒数第二个氨基酸的新生肽^{17，38，50。}在实验设计和生物信息分析中，特别是在研究核糖核糖暂停¹⁷时，值得考虑。CAM也已被证明通过促进停止科顿读取和帧转换⁵¹影响转化精度。尽管如此，CAM抑制是相对快速和足够的典型的RIBO-seq研究<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X TBE（粉末）	Invitrogen	AM9864
2-巯基乙醇，99%，纯	Acros Organics	125472500
5'-三磷酸腺苷 （ATP）	New England Biolabs	P0756S
氧化铝煅烧纯 p.a.	Chempur	114560600
氯化钙二水合物	Sigma-Aldrich	C3881-500G
氯霉素	MP 生物医学	190321
DNA 洁净 &浓缩仪 -5	Zymo Research	D4004
Dnase I 重组，无 Rnase	Roche	4716728001
EDTA 二钠盐	Fisher Scientific	E/P140/48
乙醇绝对浓度 99,8% Pure-P.A.-Basic	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
过滤仪	VWR Collection	511-0265	全玻璃过滤仪，带漏斗、烧结底座、瓶盖、47 mm Ø 弹簧夹和接地接头烧瓶
凝胶 40 （19：1）	Rotiphorese	3030.1
凝胶加载染料，蓝色，6X	New England Biolabs	E6138G
鸟苷 5′-[β，γ-imido]三磷酸三钠盐水合	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&A 生物技术	040-500
乙酸镁四水合	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE 膜安装器	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	孔径：0.45um
MICROBExpress 细菌 mRNA 纯化	Invitrogen	AM1905
多重小 RNA 文库制备套装，用于 Illumina	New England Biolabs	E7300S
无核酸酶水	Ambion	AM9937
乙酸钾 无水纯 P.A.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
快速加载 pBR322 DNA-MspI 消化	New England Biolabs	E7323A
RNA Clean &浓缩器 -25	Zymo Research	R1018
醋酸钠	Sigma-Aldrich	S2889-250G
碳酸钠	Sigma-Aldrich	223530-500G
纯碳酸氢钠 p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold 核酸凝胶染料	Life Technologies	S11494
T4 多核苷酸激酶	New England Biolabs	M0201L
T4 多核苷酸激酶反应缓冲液	New England Biolabs	B0201S
TBE-尿素样品缓冲液 （2x）	Invitrogen	LC6876
三（羟甲基）氨基甲烷，超纯，99.9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100,98%	Acros Organics	327371000
尿素 GR	lach：ner	40096-AP0