细菌中的RIBO-seq：用于高通量测序的样品收集与文库构建方案

摘要

本文描述了细菌RIBO-seq中样本采集与制备的各个步骤。按照本指南构建文库并进行测序，可获得足够数据用于全面的生物信息学分析。我们所介绍的实验方案简便，仅需使用常规实验室设备，从裂解到获得文库共需七天。

摘要

核糖体谱分析技术（RIBO-seq）目前是研究蛋白质合成过程最有效的工具 体内与其它方法相比，该方法的优势在于能够通过精确定位核糖体在mRNA转录本上的位置和数量，来监测翻译过程。

本文描述了细菌中RIBO-seq方法的样本采集与制备的连续步骤，重点介绍了与实验设计和实施相关的细节。

由于RIBO-seq依赖于完整的核糖体及其相关的mRNA，关键步骤是快速抑制翻译并充分裂解细胞。因此，我们建议通过滤膜收集细胞，并用液氮速冻，可选择性地预先用氯霉素处理以阻断细菌中的翻译过程。对于细胞裂解，我们推荐在氧化铝存在下，使用研钵和研杵研磨冷冻细胞，以机械方式破坏细胞壁。本方案中无需使用蔗糖垫或蔗糖梯度超速离心来纯化单核糖体。取而代之的是，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离mRNA，随后切取核糖体保护片段（28–30 nt条带），该方法可获得满意结果。这大大简化了实验流程，同时减少了所需时间和设备要求。在文库构建方面，我们推荐使用New England Biolabs公司提供的商用小型RNA建库试剂盒（适用于Illumina测序），并遵循生产商的说明书进行一定程度的优化。

所获得的cDNA文库具有适用于下一代测序（NGS）所需的数量和质量。按照本方案制备的文库测序后，每个样本可获得200万至1000万条唯一比对的读长，足以满足全面的生物信息学分析需求。本文所介绍的方案快速且相对简便，可使用常规实验室设备完成。

引言

核糖体谱分析技术（RIBO-seq）由加州大学旧金山分校 Jonathan Weissman 实验室开发¹。与其他用于研究翻译水平基因表达的方法相比，RIBO-seq 聚焦于每个与 mRNA 结合的核糖体，提供其在转录本上的位置以及核糖体相对数量的信息。该技术能够 in vivo 监测蛋白质合成过程，并可实现单密码子分辨率和高精确度，从而测量单个 mRNA 上以及细胞整个转录组中核糖体的密度。RIBO-seq 技术的基础在于：在翻译过程中，核糖体结合 mRNA 分子，从而保护其内部的转录片段免受核糖核酸酶的降解。加入核糖核酸酶后，未受保护的 mRNA 被消化，而被核糖体包裹的片段——通常长约 ~28–30 nt——则保持完整。这些片段被称为核糖体足迹（RF），可被分离、测序并比对至其来源的转录本，从而精确定位核糖体的位置。事实上，利用核糖体保护 mRNA 片段的特性自 20 世纪 60 年代起已被用于研究核糖体结合位点和翻译起始位点（TIS）^2,3,4。然而，随着深度测序技术的进步，RIBO-seq 已成为翻译过程监测的金标准⁵，通过核糖体占据情况，可提供全基因组范围内的蛋白质合成信息⁶....

方案

1. 样本收集

1. 准备细菌培养物。建议每个样本使用 100 mL 培养体积。
2. 准备样品采集所需的设备和试剂：每个样品准备两把刮勺、无菌 0.45 µm 混合纤维素酯膜（MCE）滤膜，50 mL 无菌离心管，液氮，70%（体积/体积）乙醇中的 50 mg/mL 氯霉素（可选）。在 50 mL 离心管盖上打孔，以允许液氮蒸发，防止密闭管爆炸。用实验室洗涤剂和 70% 乙醇对刮勺进行去污处理。
3. 将过滤装置和其中一把刮勺预热至细菌培养物的生长温度。
   注意：我们推荐使用全玻璃过滤装置，包括漏斗、烧结底座、磨口烧瓶和47 mm Ø 弹簧夹
4. 样品收获前，将氯霉素加入细菌培养物中，使其终浓度为 100 µg/mL，孵育1分钟（可选）。
5. 将液氮倒入50 mL无菌离心管中，并将第二把刮勺放入管内冷却。
   警告！液氮蒸发时产生的压力变化可能导致密闭容器爆炸。为防止此类情况发生，必须在50 mL离心管的管盖上预先打几个孔，以允许液氮蒸发。
6. 通过过滤收集细胞。当培养基完全滤过膜后停止过滤，但不要让滤膜完全干燥。
7. 使用预热的刮勺快速将细胞从滤膜上刮下，收集细菌沉淀物。立即将带有收获细胞的整个刮勺放入装有液氮的50 mL离心管中。收集的沉淀物应完全浸没在液氮中。
8. 让沉淀充分冷冻，使用预先冷却的第二把刮勺撬下冷冻的细胞。盖上已穿孔的管盖，将试管转移....

结果

此处展示的典型结果来自一项研究，该研究旨在探究野生型 Bacillus subtilis 细胞在孢子形成过程中的翻译调控。将过夜培养的菌液用丰富培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 0.1，总体积为 100 mL，并在 37 °C 下剧烈振荡培养，直至 OD₆₀₀ 达到 0.5–0.6。随后将丰富培养基更换为最小培养基以诱导孢子形成过程，并继续培养最多四小时。从 T0（即诱导孢子形成开始）起，每隔一小时收集一次细胞，共获得五个时间点的样本。在每次收集前一分钟，按照上述方案用氯霉素处理培养物。通过预热的玻璃过滤装置，使用 0.45 µm 混合纤维素酯膜（MCE 滤膜）过滤收集细胞，并立即在液氮中快速冷冻。

裂解液中获得的核糖核酸量取决于生长条件、培养体积和菌液密度。按照本方案，100 mL细菌培养物（Bacillus subtilis）平均可获得1-4 mg RNA。上述实验所获得裂解液的示例见表1。

讨论

核糖体谱分析（ribosome profiling）的关键技术难点在于需要快速抑制翻译过程，以捕获特定生理状态下mRNA上核糖体的瞬时分布。为实现这一目标，通常采用翻译抑制剂、快速收集细胞以及液氮速冻的方法。使用抗生素是可选步骤，因为它们可能引入人为假象。氯霉素（chloramphenicol, CAM）是细菌RIBO-seq中常用的一种药物，用于阻滞正在延伸的核糖体。然而，它不能阻止翻译起始，导致在翻译起始位点下游约六个密码子处出现核糖体堆积¹⁴。此外，其抑制肽基转移酶反应的能力可能依赖于核糖体P位和A位底物的性质。据推测，当新生肽链的倒数第二个氨基酸为甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、半胱氨酸（Cys）或苏氨酸（Thr）时，CAM对核糖体的阻滞作用更强^17,38,50。这一点在实验设计和生物信息学分析中尤其值得考虑，特别是在研究核糖体暂停（ribosomal pausing）时

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10X TBE（粉末）	Invitrogen	AM9864
2-巯基乙醇，99%，纯品	Acros Organics	125472500
腺苷5'-三磷酸（ATP）	New England Biolabs	P0756S
氧化铝，经煅烧，纯度为 p.a.	Chempur	114560600
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C3881-500G
氯霉素	MP Biomedicals	190321
DNA 纯化 & 浓缩仪 -5	Zymo Research	D4004
重组DNase I，无RNase	罗氏	4716728001
EDTA 二钠盐	Fisher Scientific	E/P140/48
乙醇 Absolut 99.8%  Pure-P.A.-基础	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	BA6480111
过滤装置	VWR 系列	511-0265	全玻璃过滤装置，含漏斗、烧结底座、盖子，47 毫米 Ø 弹簧夹和磨口烧瓶
凝胶 40 (19:1)	罗蒂电泳	3030.1
6× 蓝色上样缓冲液	New England Biolabs	E6138G
鸟苷-5′′-[β,γ-亚氨基]三磷酸三钠盐水合物	Sigma-Aldrich	G0635-25MG
labZAP	A&生物技术	040-500
四水合乙酸镁	Sigma-Aldrich	M5661-250G
MCE 膜滤器	Alfatec Technology	M47MCE45GWS	孔径：0.45 μm
MICROBExpress 细菌 mRNA 纯化	Invitrogen	AM1905
Illumina多重小RNA文库制备试剂盒	New England Biolabs	E7300S
无核酸酶水	Ambion	AM9937
无水醋酸钾 P.A. 纯品	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	744330113
快速上样 pBR322 DNA-MspI 消化产物	New England Biolabs	E7323A
RNA 纯化 & 浓缩仪 -25	Zymo Research	R1018
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889-250G
碳酸钠	Sigma-Aldrich	223530-500G
碳酸氢钠 纯 p.a.	POCH Avantor Performance Materials Poland S.A	810530115
SYBR Gold 核酸凝胶染料	Life Technologies	S11494
T4 多核苷酸激酶	新英格兰生物实验室	M0201L
T4 多核苷酸激酶反应缓冲液	New England Biolabs	B0201S
TBE-尿素上样缓冲液（2x）	Invitrogen	LC6876
Tris(hydroxymethyl)aminomethane，超纯，99.9%	AlfaAesar	J65594
Triton X-100，98%	Acros Organics	327371000
尿素 G.R.	lach:ner	40096-AP0