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用于质谱分析的包埋于最佳切割温度化合物中的人体组织制备

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DOI：

10.3791/62552

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2021年4月27日

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1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

本文内容

摘要

鞘脂是一类具有生物活性的代谢物，在人类疾病中具有明确的作用。通过质谱技术对组织中的鞘脂变化进行表征，有助于揭示其在疾病发病机制中的作用，或发现潜在的治疗靶点。然而，生物样本库中用于冷冻保存组织的OCT包埋剂会干扰质谱分析。本文阐述了利用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）分析嵌入OCT中的人体组织内鞘脂的实验方法。

摘要

鞘脂是一类在人体代谢和疾病中具有明确作用的细胞组分。质谱技术可用于检测鞘脂在疾病状态下是否发生改变，并探讨其是否可作为临床干预的靶点。然而，开展具有充分统计效能的前瞻性研究，直接从手术室获取组织样本，往往耗时较长，且在技术、后勤和管理方面均面临挑战。相比之下，回顾性研究可利用生物样本库中已有的大量冷冻保存的人体组织标本。从生物样本库获取组织的其他优势还包括能够获得与标本相关的组织学、病理学信息，以及在某些情况下可获取临床病理变量，这些信息均可用于与脂质组学数据进行相关性分析。然而，由于冷冻保存过程中常用的包埋介质——最佳切割温度化合物（OCT）与质谱分析存在兼容性问题，这构成了脂质分析的技术障碍。但我们先前已证明，通过反复洗涤和离心的步骤，可轻松去除生物样本库人源标本中的OCT，且不改变其鞘脂含量。我们还曾证实，用OCT包埋并冷冻保存的人体组织中的鞘脂在长达16年内保持稳定。在本报告中，我们详细阐述了对OCT包埋的人体组织标本进行鞘脂分析的步骤与工作流程，包括组织洗涤、称重以用于数据归一化、脂质提取、液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析前的样品制备、质谱数据整合、数据归一化以及数据分析。

引言

鞘脂是一类具有生物活性的代谢物，以其在人体代谢和疾病中的作用而著称1，2。它们调控多种复杂的细胞过程，如细胞迁移、细胞存活与死亡、细胞运动、囊泡运输、细胞侵袭与转移、血管生成以及细胞因子的产生1，2，3，4，5，6，7，8，9。鞘脂代谢调控的异常可促进癌症的发生与发展，决定癌症的侵袭程度以及癌症对治疗的反应性和耐药性的形成3，10。因此，由于鞘脂在疾病病因学中具有广泛影响，能够精确定量疾病特异性鞘脂变化的分析方法显得尤为重要。质谱法（MS）是分析鞘脂变化最准确且可靠的手段。

可用于鞘脂类物质变化分析的人体样本，可前瞻性地从手术室获取，或回顾性地从组织生物样本库中获得。手术获取的新鲜组织具有优势，因其可直接用于质谱（MS）或其他分析方法检测。然而，前瞻性获取组织样本在行政管理、技术操作和后勤方面存在诸多障碍，且收集到足够数量的样本以达到统计学效力往往具有挑战性。从生物样本库获取组织的优势在于，可回顾性地大量获取样本，且样本库通常会确认组织学和病理学特征，采用标准操作程序对组织进行低温冷冻保存和存储，并可提供可用于相关性分析的临床病理数据。然而，为了保存分子和结构特征，生物样本库可能会使用最佳切割温度（OCT）包埋介质对组织进行冷冻保存，而我们已证实该介质会干扰数据归一化实验以及通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对鞘脂类物质的定量分析11。此外，已有研究表明，OCT 包埋介质中的主要成分聚乙烯醇和聚乙二醇，在其他质谱分析平台中会导致离子抑制效应12,13,14,15。因此，在进行质谱法鞘脂组学分析前，必须将组织中的 OCT 包埋介质完全去除。

在先前的报告中，我们已验证了一种从人源样本中去除OCT包埋剂以进行液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析的方案11，以及用于组织称重以实现数据归一化的方法11。本文中，我们详细描述鞘脂组学OCT包埋剂去除方案（sOCTrP）的操作步骤，并展示来自人肺腺癌肿瘤及其癌旁正常未受累组织的代表性数据。

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方案

去标识化的人肺组织来自弗吉尼亚联邦大学（VCU）组织与数据获取及分析核心，该研究已通过机构审查委员会（IRB）批准的方案（#HM2471）。使用小鼠进行研究以及采集小鼠组织的操作已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 材料准备

注意：这些步骤应在组织洗涤前一天进行。

  1. 预先标记并称重1.5 mL聚丙烯离心管，为次日将要处理的每个样本使用简洁但清晰的标识代码。使用耐化学腐蚀的永久性记号笔（参见 材料表不会因反复操作离心管而褪色
  2. 打开一个电子表格，依次将各列标注为以下列标题：管标识符（ID）、空管、带组织的管、组织总重。将待处理的管标识符输入至“管 ID”列中。
  3. 预先校准并归零分析天平。将一个洁净的10 mL锥形瓶置于天平托盘中央（该锥形瓶将用作试管架）。关闭称量室门，并对装有锥形瓶的天平进行去皮归零。
  4. 称量1.5 mL离心管。小心将离心管放入天平称量室中，关闭称量室门。待重量稳定后，记录“仅离心管”一栏中的重量。
    注意：称量试管时避免移动10 mL锥形瓶。若锥形瓶被移动，需重新居中放置并重新归零天平。将盖好的试管放入试管架中，保存至需要时使用。
  5. 预先用标识代码标记13 × 100 mm螺口玻璃管及其管盖，并向每管中加入2 mL液相色谱-质谱级甲醇。将试管置于试管架中，盖好管盖，于冰箱（4 °C）中保存至使用。
    注意：使用瓶顶溶剂分配器（参见 材料表）。如果无法获得，则使用玻璃移液管，以避免在分装有机溶剂时使用塑料制品。
  6. 预先标记13 × 100 mm玻璃试管。盖好后于室温下保存。
  7. 预先用标识码标记自动注射器小瓶。盖好瓶盖，并将自动注射器小瓶于室温下避光保存至使用前。
  8. 制备组织干燥芯。
    1. 首先将手术剪浸入LC-MS级甲醇中5分钟进行清洗，然后用洁净的实验级纸巾擦拭。
    2. 使用无粉手套，将实验室级纸巾的一端轻轻旋转 材料表直至形成尖端细长的30-40 mm灯芯。
    3. 使用经甲醇清洁的剪刀，从灯芯较粗的一端将其剪断。将灯芯放入干净的纸板盒中。制备的灯芯数量应为处理所有样品所需数量的两倍。
  9. 准备截短的1 mL移液枪头。使用经甲醇清洁的手术剪，在1 mL移液枪头尖端剪去4–5 mm，然后将处理后的枪头放回枪头盒中。准备的枪头数量应为待处理样本数量的两倍。
    ​注意：这些将用于从管中回收洗涤后的组织。请勿触碰吸头末端。
  10. 将分子生物学级磷酸盐缓冲液（PBS）预冷至 4 °C（0.5 L 已足够），用于采集样本。每个待处理样本需准备 60 mL 超纯去离子水，并预冷至 4 °C。
  11. 配制质谱内标。将以下脂质溶解于乙醇:甲醇:水（7:2:1；v/v/v）中，浓度为 25 nmol/mL：d17:1-鞘氨醇（(2S,3R,4E)-2-氨基十七碳-4-烯-1,3-二醇）、d17:1-鞘氨醇-1-磷酸（十七碳鞘-4-烯基-1-磷酸）、C12-神经酰胺（d18:1/C12:0）（N-(十二酰基)-鞘-4-烯胺）、C12-鞘磷脂（d18:1/C12:0）（N-(十二酰基)-鞘-4-烯基-1-磷酸胆碱）、C12-葡萄糖基神经酰胺（d18:1/C12:0）（N-(十二酰基)-1-β-葡萄糖基-鞘-4-烯）、C12-乳糖基神经酰胺（d18:1/C12:0）（N-(十二酰基)-1-ß-乳糖基-鞘-4-烯）。

2. 组织洗涤

注意：提前一天完成第1节中的所有步骤，可使熟练的研究人员每天处理多达40个样本，而新手每天可处理约10至15个样本。应于清晨开始操作，并持续进行，直至完成第2.1至3.8节中的所有步骤，期间不得中断。

  1. 在处理组织的当天，准备生物安全柜工作区域，配备涡旋振荡器、充满电的移液器以及冰盒。在此部分的所有步骤中，均需穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、双层手套和护目镜。警告：人体组织和体液应被视为生物危害材料，并按相应要求进行处理。
  2. 预先冷却（4 °C）水平转子离心机、用于固定15 mL锥形离心管所需的任何适配器及离心生物安全盖；同时预先冷却（4 °C）可容纳1.5 mL离心管的固定角转子离心机。
  3. 若组织尚未分装至15 mL聚丙烯离心管中，使用经甲醇清洗的刮匙（每处理一个新的组织样本前均需清洁）将组织转移至预先标记好的15 mL聚丙烯离心管中。同时标记管盖。
    1. 将可容纳15 mL离心管的试管架放入冰盒中，并在冰盒内加满冰。将当日待处理的组织置于冰上的试管架中进行解冻。
      注：从生物样本库申请处理的组织量应至少为3–4 mg，已有研究表明，在此重量范围内，组织洗涤和称重方案具有准确性和可靠性11。
  4. 将装有样本的冰盒移入生物安全柜中。
  5. 按以下所述执行三次sOCTrP循环11（即重复步骤2.5.1–2.5.5共三次）。
    1. 向每根离心管中加入10 mL冰冻的超纯去离子水，并 tightly 封盖。使离心管静置孵育10分钟。
    2. 剧烈涡旋每根离心管10–20秒，或直至附着在管壁上的所有组织或组织沉淀完全重悬。
      注：在第2–3次sOCTrP循环中，必须将沉淀完全重悬，以确保沉淀中的OCT被充分稀释到洗涤液中。
    3. 将离心管转移至预冷（4 °C）的水平转子离心机中，在4 °C条件下以4,000–5,000 × g 离心10分钟。
      注：为避免产生和暴露于离心过程中产生的生物危害气溶胶，请使用生物安全盖密封离心转子（参见材料表）。
    4. 从离心机中取出样本并转移至冰盒中，将冰盒放入生物安全柜，打开管盖，并妥善保存管盖。
    5. 小心吸取洗涤液，避免吸入沉淀中的组织成分，操作时在管内保留约0.5 mL上清液。重新盖上管盖，并通过将标记的管盖与对应离心管匹配，避免交叉污染。
      ​注：步骤2.5.5中的洗涤液（即上清液）属于生物危害材料，应按照适用于人源标本的生物安全指南进行处理和处置。

3. 组织称重（用于数据归一化）

  1. 最后一次 sOCTrP 洗涤循环后，小心吸除大部分洗涤液，但避免扰动沉淀。在离心管中保留约 0.5 mL 洗涤液。
  2. 使用步骤 1.9 中制备的短截移液枪头，吸取 500 µL 冰冷的 PBS，并将其加入离心管中。
    1. 使用同一枪头，轻柔重悬沉淀并回收全部组织。避免剧烈吹打，以减少组织因黏附于管壁和枪头表面而造成的损失。
  3. 将重悬的组织转移至相应已预先标记并称重的 1.5 mL 离心管中，并将离心管置于冰上。对数据集中的所有组织重复此操作。
  4. 将 1.5 mL 离心管放入预冷的离心机中，在 4 °C 条件下以 7,000 × g 离心 5–7 分钟，使组织沉淀。
    1. 取出离心管，小心尽可能吸除 PBS，但不要扰动沉淀。将离心管放回冰上。
  5. 再次以 7,000 × g 离心 3 分钟，以确保组织充分沉淀。将离心管转移至冰上。
    注：额外的离心步骤对于在去除全部洗涤液和吸水操作过程中防止组织损失至关重要。若处理超过五个样本，每处理完第五个样本后，应重复一次 3 分钟、7,000 × g 的离心步骤，以确保组织持续保持沉淀状态。
  6. 使用步骤 1.8 中制备的吸水纸，轻柔去除任何残留的洗涤液。每个样本使用新的洁净吸水纸。允许用吸水纸轻轻轻触组织，有助于去除大部分残留液体，但应避免组织因黏附于吸水纸上而损失。盖紧管盖，并将离心管置于冰上。
  7. 在最近校准、去皮并归零的分析天平上称量每个离心管。
    1. 将每个离心管放入玻璃锥形瓶中，并关闭天平室门。待读数稳定后，将重量记录在电子表格中标注为“含组织管重”的列中。
    2. 称重后，将离心管放回冰上。
  8. 加入 300 µL 冰冷的 PBS。使用短截移液枪头（步骤 1.9），小心回收全部组织，并转移至已预先标记的螺口玻璃管（步骤 1.5 中制备）中，该玻璃管内已含有 2 mL 冰冷的液相色谱-质谱级甲醇（需将组织直接加入甲醇中，而非管壁）。
  9. 通过从“含组织管重”数值中减去空管重量，计算出洗涤后的组织量。将该数值记录在“总组织量”列中。该总组织量数值将在步骤 6.12 中用于标准化质谱数据。
  10. 将样本储存于 -80 °C，直至准备进行步骤 4.1–4.15。
    ​注：此为合适的暂停点，样本可在 -80 °C 安全储存数周。如需采用其他组织标准化方法（如蛋白质浓度或脂质磷酸含量测定），请参考 Rohrbach 等人11 的研究。

4. 脂质提取

注意：当需要处理大量样本时，尤其应在早晨开始这些步骤。开始前，将水浴锅或培养箱预热至 48 °C。

  1. 从冰箱中取出步骤 3.8 制备的样品以及质谱脂质标准品（步骤 1.11 中制备的），室温平衡 20 分钟。
  2. 涡旋振荡，并将内标溶液置于超声水浴中（见材料表）2–3 分钟，或直至质谱脂质标准品完全溶解，然后再分装至样品中。这可避免数据归一化时产生误差。
  3. 使用多通道移液器，向每支试管中加入 250 pmol 内标（来自步骤 1.11 制备的 25 nmol/mL 溶液，取 10 µL）。轻轻盖上管盖。
  4. 为促进均质化，将甲醇体积调整至 2 mL。仅使用 LC-MS/MS 级甲醇。
  5. 每次处理一支试管，使用匀浆器反复吹打组织，直至无可见团块（通常为 5–20 秒）。移动匀浆器探头作圆周运动，并轻轻按压管壁以辅助吹打。重新盖上管盖。
    注意：确保所有组织被充分吹打可最大化脂质提取效率。匀质化前切勿向样品中添加氯仿，因为一次性匀浆探头由塑料制成，会在含氯仿的溶液中溶解。
  6. 将试管以 45° 角浸入超声水浴中 5–10 秒。
    1. 若试管在超声水浴中未形成组织团块，则盖上管盖，继续处理下一支试管。
    2. 若试管在超声水浴中形成组织团块，则重新匀浆，并重点处理团块区域。
    3. 重复此过程（匀浆/超声水浴浸入），直至所有大块组织团块均被分散。
  7. 在通风橱中，使用瓶口分液器向每支试管中加入 LC-MS 级氯仿和甲醇，使甲醇:氯仿:水的比例达到 2:1:0.1。使用洁净管盖将试管严密密封，并置于实验台面上直至当天结束。
    1. 对于重量为 50 mg 或更少的组织，使用总提取体积 4 mL；对于更大的样本，按此比例（50 mg : 4 mL 提取液）进行调整。
  8. 当天晚上离开前，将密封严密的试管放入 48 °C 水浴或培养箱中，过夜孵育。
    注意：试管必须严密密封，以防止溶剂因蒸发而改变比例。
  9. 次日早晨，从 48 °C 水浴中取出样品，于 4 °C、4,000–5,000 × g 离心 20 分钟，使不溶于溶剂的残渣沉淀。
  10. 在通风橱中操作，小心将上清液倾入预先标记的 13 × 100 mm 硼硅酸盐玻璃试管中。将 13 × 100 mm 试管倾斜 30–45° 角，以利于倾倒。
    注意：若处理超过 12 个样品，切勿让离心后的试管长时间静置，否则沉淀会软化，在执行步骤 4.10 时导致不溶性残渣被转移。为避免此情况，每次仅从离心机中取出 12 支试管，其余试管继续离心，直至准备倾倒时再取出。
  11. 将试管转移至可容纳 13 × 100 mm 试管的真空浓缩仪中。先加热 1 小时（40 °C），并在最大真空度下运行，以完全蒸发所有溶剂。
  12. 从真空浓缩仪中取出试管，向每支试管中加入 500 µL LC-MS 级甲醇（使用瓶口分液器）。
  13. 通过涡旋振荡 5–10 秒重悬干燥的脂质提取物，随后将试管以 45° 角浸入超声水浴中 2 分钟，同时旋转试管。再次涡旋 5 秒，并额外在超声水浴中浸入 1 分钟。
    注意：此步骤至关重要，以确保提取脂质的最大回收率。必须等到管壁上所有干燥物质完全重悬后，方可进行下一步。
  14. 将 13 × 100 mm 试管放入预冷（4 °C）的离心机中，于 4 °C、4,000–5,000 × g 离心 20–30 分钟，去除任何不溶性残渣。
  15. 小心将澄清的上清液倾入预先标记的自动进样小瓶中。将自动进样小瓶倾斜 30–45° 角，以利于倾倒。确保将 13 × 100 mm 试管中的全部内容物转移至自动进样瓶中。
  16. 严密盖上管盖，将试管在 -80 °C 保存，直至进行 LC-ESI-MS/MS 分析。

5. 液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析

注意：以下实验步骤使用配备自动进样器、脱气装置和三重四极杆模式运行的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统的二元泵系统。色谱柱温度通过柱温箱进行控制。有关所用设备的详细信息，请参见材料表。

  1. 配制流动相 A1（CH3OH:H2O:HCOOH，58:41:1，v:v:v，含 5 mM 甲酸铵）和流动相 B1（CH3OH:HCOOH，99:1，v:v，含 5 mM 甲酸铵）。仅使用 LC-MS 级溶剂、水和试剂。
  2. 每组样品准备四个空白自动进样瓶，每个瓶中加入 500 µL LC-MS 级甲醇。
  3. 每组样品准备两个内标物（标记为 IS）自动进样瓶，将第 1.11 步配制的内标溶液各取 10 µL（每种标准品总量为 250 pmol），用 500 µL LC-MS 级甲醇稀释。
  4. 将色谱柱加热箱温度设为 60 °C，离子源温度设为 500 °C。
  5. 进行 MS/MS 分析时，使用质谱仪的三重四极杆模式。将第一四极杆（Q1）设定为仅允许前体离子通过，第三四极杆（Q3）设定为仅允许具有分子特异性的产物离子通过（或在 Q1 或 Q3 中对多个 m/z 进行扫描），并在第二四极杆（Q2）中使用氮气进行碰撞诱导解离，Q2 的碰撞能量相对于 Q1 偏移 30–120 eV。
  6. 将多反应监测对（MRM）检测窗口设为 120 秒，目标扫描时间为 1.0 秒。MRM 对、电离能量和碰撞能量的具体参数见表 1。
  7. 采用以下参数在液相色谱步骤中分离鞘脂类化合物：以 0.7 mL/min 的流速，使用 95% 流动相 A1 和 5% 流动相 B1 的混合溶剂对 2.1（内径）× 50 mm C18 反相色谱柱平衡 0.5 分钟。
    1. 进样后，保持流动相 A1/B1 比例为 95/5 持续 2.25 分钟，随后在 1.5 分钟内线性梯度升至 100% B1，保持 100% B1 5.5 分钟，再用 0.5 分钟梯度恢复至 95/5 A1/B1。
    2. 运行结束后，用 95/5 A1/B1 混合液冲洗色谱柱并重新平衡 0.5 分钟。
  8. 自动进样器设置如下：清洗体积 500 µL；进样针行程 52 mm（应根据进样瓶尺寸和瓶内体积进行调整）；清洗速度 35 µL/s；取样速度 5.0 µL/s；清洗浸入时间 2 秒；清洗模式为吸样前后均清洗；清洗时间 2 秒。
  9. 将第 4.15 步制备的样品按以下顺序放置于自动进样器样品盘中：空白；内标物（IS）；空白；第 4.15 步制备的样品；空白；内标物（IS）；空白。
  10. 采用 LC-ESI-MS/MS 对每份样品分析 5–10 µL。数据集中所有样品应使用相同的进样体积进行分析。

6. 数据处理、整合与标准化

注意：尽管以下步骤概述了特定软件的操作流程（参见材料表），但在类似的液相色谱-质谱（LC-MS）仪器及软件上也可采用相似的流程，用于分析脂质类别及其相应内标物的多反应监测（MRM）离子对积分。

  1. 打开定量分析软件。在定量选项卡中，双击定量向导。在弹出窗口的最左侧工作区中，导航至正确的数据集并单击选中。可用的样品将显示在中间的工作区中。
  2. 高亮选择需要分析的样品，然后点击右侧箭头将其添加到已选样品工作区。点击下一步进入设置和查询界面，通常使用默认设置。
  3. 点击下一步进入积分方法选择界面。选择包含待分析脂质的 MRM 转换对的合适积分方法。参见表1中的 MRM 转换对。点击完成。
    注意：保留时间会因仪器和个体设置不同而有所变化，因此必须针对每个具体实验条件进行验证。
  4. 在导航栏中点击峰形审查面板，以便检查 MRM 对。为便于审查，右键点击峰形审查面板，将自动缩放设置为最大峰的100%，并将缩放窗口设置为1.00 - 2.00 分钟。
  5. 右键点击定量显示窗口，选择分析物以及需要检测的目标鞘脂。确认空白样品中无任何峰，并确认内标（IS）样品中的正确峰已被积分。
  6. 开始对未知样品进行积分。每次处理一类鞘脂，首先检查该类内标（例如 C12:0 神经酰胺）MRM 对的保留时间，并确保软件已对正确峰进行了积分。
  7. 继续分析同一脂质类别中的其他分析物（例如 C14:0 神经酰胺、C16:0 神经酰胺等），从该类中链长最短的脂质开始。逐一确认每种链长脂质的软件程序是否已对正确的 MRM 对峰进行了积分。
  8. 当所有分析物均完成积分后，为每种被分析的鞘脂种类（例如神经酰胺、鞘磷脂等）创建一个电子表格。列标题应与 LC-MS/MS 定量软件中分析物及其链长的顺序一致。同时添加一列表头用于记录样本编号及步骤 3.9 中确定的样本归一化重量。
    注意：如先前所述11，其他常见的归一化方法包括总脂磷酸含量或蛋白质含量。
  9. 将所有分析物及内标的峰面积导出或复制至电子表格中。
  10. 通过将某一鞘脂类别中各链长组分的积分峰面积除以其对应内标的峰面积，对数据进行归一化处理。例如，C14:0 神经酰胺、C16:0 神经酰胺、C18:1 神经酰胺等均应分别除以 C12:0 神经酰胺内标的峰面积。
  11. 将峰面积转换为回收脂质的摩尔数：将归一化后的峰面积（步骤 6.10 计算所得）乘以在步骤 4.3 中加入样品的内标量（单位为皮摩尔）。在本实验方案中，该数值为 250 pmol。
  12. 为获得每个样品中脂质的相对含量，将每种脂质链长的皮摩尔数除以步骤 3.9 中测定的组织重量。结果单位为每毫克组织中脂质的皮摩尔数（pmol/mg 组织）。

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结果

在本实验方案中，我们详细描述了一种从冷冻保存的人体组织中去除OCT并称重组织以进行LC-ESI-MS/MS分析的方法。材料表列出了本实验所需的材料。图1展示了一项典型实验的结果，其中10例人肺腺癌肿瘤组织和10例相应的癌旁正常组织经过洗涤去除OCT后，采用LC-ESI-MS/MS进行分析。重要的是，正如我们先前研究所示11，与正常未受累的邻近组织相比，肺腺癌肿瘤组织中多种不同碳链长度的神经酰胺（图1A）和单己糖基神经酰胺（图1B）水平显著升高。

为评估OCT对第4节所述脂质提取步骤的影响，进行了对照实验：取200 mg小鼠肝脏（C57BL6；雄性；14-16周龄），重悬于2 mL磷酸盐缓冲液中，直至充分匀浆。将所得的细小肝脏悬液使用探头式超声仪进行充分超声处理（在冰上进行三轮超声，每轮1分钟，间隔1分钟，功率60%；采用微尖...

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讨论

OCT 是生物样本库中常用的长期冷冻保存试剂。然而，当组织通过多种质谱平台进行分析时，OCT 可能导致离子抑制12,13,14,15，或在样本经液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析时引起信号丢失11。冷冻保存组织中的 OCT 还可能干扰组织归一化方法（如称重）以及蛋白质定量检测（如 Bradford 法和 BCA 法）11。本文中，我们提供了一种详细的去除人组织中 OCT 并随后进行质谱分析的实验方案。该方案可稍作修改，用于除肺组织以外的其他组织来源，或用于小鼠组织，正如我们先前所述11。此外，也可采用其他质谱数据归一化策略，包括我们此前描述的方法11，以及其他经过验证的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究项目得到了弗吉尼亚联邦大学马西癌症中心组织与数据获取及分析核心实验室以及弗吉尼亚联邦大学脂质组学与代谢组学核心实验室的服务与支持，这些核心实验室部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症中心支持基金P30CA016059资助。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金R21CA232234（Santiago Lima）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 聚丙烯移液器吸头NANA用于取样标本
1.5 mL 聚丙烯离心管NANA
10 mL 锥形瓶VWR89091-116用于试管和组织称重
AB Sciex Analyst 1.6.2SciexNA用于分析和整合质谱数据的软件
甲酸铵菲舍尔科学A11550用于液相色谱流动相
分析天平NANA精度达 0.1 mg 的天平
瓶口分液器赛多利斯LH-723071用于分装溶剂
C12-神经酰胺 (d18:1/C12:0)；N-(十二烷酰基)-鞘氨-4-烯Avanti Polar LipidsLM2212内标物
C12-葡萄糖基神经酰胺 (d18:1/12:0)；N-(十二烷酰基)-1-β-葡萄糖基-鞘氨-4-烯Avanti Polar LipidsLM2511内标物
C12-乳糖基神经酰胺 (d18:1/12:0)；N-(十二烷酰基)-1-ß-乳糖基-鞘氨-4-烯Avanti Polar LipidsLM2512内标物
C12-鞘磷脂  (d18:1/C12:0)，N-(十二烷酰基)-鞘氨-4-烯-1-磷酸胆碱Avanti Polar LipidsLM2312内标物
CHLOROFORM OMNISOLV 4LVWREM-CX1054-1
ClickSeal 生物安全盖赛默飞世尔科技75007309用于防止离心过程中产生生物危害性气溶胶
ConfliktDecon Labs4101去污剂
CTO-20A/20AC 柱温箱岛津NA用于液相色谱
d17:1-鞘氨醇；  (2S,3R,4E)-2-氨基十七碳-4-烯-1,3-二醇Avanti Polar LipidsLM2000内标物
d17:1-鞘氨醇-1-磷酸；十七碳鞘氨-4-烯-1-磷酸Avanti Polar LipidsLM2144内标物
DGU20A5R 脱气装置岛津NA
一次性培养管 13x100 mmVWR53283-80013x100 mm 螺口管
加热水浴锅NANA用于过夜脂质提取
匀浆器 150菲舍尔科学15-340-167用于组织匀浆
匀浆器塑料一次性探头菲舍尔科学15-340-177用于匀浆
Kimwipes 纸巾Kimtech34120实验室级纸巾，用于制作灯芯
甲醇 LC-MS 级 4LVWREM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD 二元泵系统岛津NA用于液相色谱-质谱联用
永久性记号笔VWR52877-310
酚醛螺纹盖，Kimble Chase（一次性培养管用盖）VWR89001-50213x100 mm 螺口管盖
磷酸盐缓冲液赛默飞世尔科技10010023用于清洗后从管中取出标本
重复移液器艾本德4987000118用于分装液相色谱-质谱内标物
螺口盖，蓝色，红色聚四氟乙烯/白色硅胶VWR89239-020自动进样瓶盖
带 ID 标签的螺纹玻璃小瓶VWR46610-724自动进样瓶
SIL-30AC 自动进样器岛津NA
SpeedVac 浓缩仪赛默飞世尔科技SPD2030P1220用于干燥溶剂
Supelco 2.1 (内径) x 50 mm Ascentis Express C18 色谱柱西格玛奥德里奇581300-U用于液相色谱-质谱联用
Triple Quad 5500+ 液相色谱-串联质谱系统SciexNA用于液相色谱-电喷雾电离-串联质谱
超声水浴锅BransonModel 2800用于匀浆以及提取和干燥脂质的重悬
涡旋振荡器NANA用于 sOCTrP 和重悬干燥脂质
VWR 一次性硼硅酸盐玻璃培养管VWR4772957213x100 mm 玻璃培养管
Water Hipersolve Chromanorm LC-MSVWRBDH83645.400

参考文献

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