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方法文章

从人单核细胞获取巨噬细胞以评估Leishmania braziliensis感染率及固有宿主免疫反应

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DOI：

10.3791/62555

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2021年8月7日

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1Oswaldo Cruz Foundation, Gonçalo Moniz Institute, 2Federal University of Bahia, 3National Institute of Science and Technology (INCT), Research Institute in Immunology, 4Senai Institute for Innovation in Advanced Health Systems, National Service for Industrial Learning, Integrated Manufacturing and Technology Campus, SENAI - CIMATEC Salvador

本文内容

摘要

本方案描述了从单核细胞获取人巨噬细胞并用巴西利什曼原虫（Leishmania braziliensis）感染的操作流程。该方法还可用于评估感染率和寄生虫活力、通过荧光显微镜检测活性氧（ROS）的产生，以及检测培养上清液中炎性介质的生成，以研究巨噬细胞对感染的应答反应。

摘要

巨噬细胞是免疫系统功能所必需的多功能细胞，也是主要的宿主细胞 Leishmania braziliensis （Lb）感染。这些细胞专门负责微生物识别和吞噬作用，同时还能激活其他免疫细胞、呈递抗原，并促进炎症反应和组织修复。本文描述了一种从健康供体外周血中分离单个核细胞（PBMC），进而获取单核细胞并诱导其分化为巨噬细胞的实验方案。随后可利用这些细胞进行感染实验 体外 在不同Lb浓度下评估控制感染的能力，以及评估宿主细胞的免疫反应，后者可通过多种方法进行检测。首先通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMCs，然后接种以使单核细胞贴附于培养板上；通过洗涤去除未贴壁细胞。接着，将贴壁细胞在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）存在下培养7天，以诱导其向巨噬细胞分化。我们建议接种2 x 106 每孔2×10⁵个细胞接种于24孔板中，以获得2×105 巨噬细胞。完全分化的巨噬细胞可接种Lb，感染4或24小时。该方案可获得较高比例的感染细胞，可通过光学显微镜或荧光显微镜进行评估。除感染指数外，还可通过计数每个细胞内寄生虫的数量来测定寄生虫载量。此外，可在培养上清液或巨噬细胞内开展进一步的分子和功能检测，使得本方案可应用于多种研究场景，并可适用于其他胞内寄生虫种类。

引言

属于Leishmania属的胞内原虫是引起一种被忽视的疾病复合体——利什曼病的病原体1。这类热带疾病具有广泛的临床表现，可从皮肤损害到内脏型疾病引发的并发症，若不及时治疗，后者可能致命。皮肤利什曼病（CL）是最常见的利什曼病类型，其特征为单个或少数几个伴有加剧慢性炎症的溃疡性皮肤病变2。疾病的发展取决于Leishmania的种类，同时也受到宿主免疫反应相关多种因素的共同影响，二者共同决定临床结局3,4。Leishmania braziliensis是巴西引起皮肤利什曼病的主要病原种，全国各州均有病例报道5。针对L. braziliensis的免疫反应被认为具有保护作用，因其可将寄生虫限制在接种部位，并涉及多种免疫细胞类型，如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞4,6,7。

巨噬细胞是免疫系统中具有多种功能的细胞，因其擅长识别和吞噬微生物，并能够呈递抗原以及激活其他类型的细胞。巨噬细胞能够调控从炎症反应到组织修复以及维持内环境稳态等多种生理过程8,9。这些细胞在抵御如Leishmania等胞内寄生虫的早期免疫反应中发挥着关键作用，对清除此类病原体至关重要10,11,12。

在 L. braziliensis 感染过程中，巨噬细胞可通过多种机制响应以清除寄生虫，例如产生活性氧（ROS）和炎症介质13,14。免疫反应可由促炎性或抗炎性细胞因子的产生所调控，这些细胞因子分别促进过度的炎症状态或组织修复过程6,15,16。巨噬细胞的可塑性对于皮肤利什曼病（CL）的免疫病理发生以及寄生虫与宿主之间的相互作用至关重要，这些细胞被认为是阐明疾病机制和开发新治疗策略的关键。

由于皮肤利什曼病（CL）是一种复杂的疾病，相关研究需要探索能够模拟人体内细胞类型的细胞。不同实验模型中观察到的免疫反应可能存在差异，并产生无法反映自然感染人类中所见免疫反应的结果。因此，本文所述方案旨在促进对人类巨噬细胞及其在巴西利什曼原虫（L. braziliensis）引起皮肤利什曼病期间免疫反应的研究。

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方案

巴西巴伊亚州萨尔瓦多市戈恩萨洛·莫尼斯研究所（奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会-IGM-FIOCRUZ）人类研究伦理审查委员会批准了本研究（方案编号：CAAE 95996618.8.0000.0040）。

1. 人外周血单个核细胞的分离

  1. 确保血样、1.077 g/mL 密度梯度液（例如 Ficoll-Histopaque）和生理盐水均处于室温。
  2. 按 1:1 比例用生理盐水稀释血样。
  3. 将 10–12 mL 密度梯度液转移至 50 mL 离心管中。
  4. 小心地将最多 40 mL 稀释后的血样叠加在密度梯度液上方，使血液与密度梯度液分层。
  5. 第一次离心：将含有血液和密度梯度液的离心管在 24 °C 下以 400 × g 离心 30 分钟。
    注意：启动离心机前请关闭刹车。
  6. 用移液器移除 PBMC 环上方的血浆（白膜层位于血浆与密度梯度液之间；其下方为红细胞/粒细胞沉淀）。
  7. 用移液器将云雾状的 PBMC 层（白膜层）转移至 15 mL 离心管中，并加入冷生理盐水（置于冰上或 4 °C 保存）至满管。
  8. 第二次离心：将离心管在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，开启刹车。
  9. 弃去上清液，加入冷生理盐水重悬沉淀。
  10. 第三次离心：将离心管在 4 °C 下以 250 × g 离心 10 分钟，开启刹车。
  11. 弃去上清液，加入冷生理盐水重悬沉淀。
  12. 第四次离心：将离心管在 4 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟，开启刹车。
  13. 弃去上清液，用 1 mL 冷 RPMI 培养基重悬沉淀。
  14. 计数细胞以确定获得的细胞数量。

2. 分化为人类巨噬细胞

注意：对于24孔板，计算所需总细胞数量，以每孔接种2 x 106 个细胞，可获得2 x 105 个巨噬细胞。该产量基于人血液中单核细胞平均比例为10%的估算。 Alternatively, monocytes can also be released by non-enzymatic methods and then counted for plating.

  1. 在24孔板中，将直径13 mm的圆形玻璃盖玻片置于每孔底部。每孔加入相当于2×106 个细胞的悬液，溶于1 mL不完全RPMI培养基中。
    注意：应控制每孔细胞数量，过多的细胞会阻碍贴壁并影响培养效果。此外，所有盖玻片必须洁净且无菌。
  2. 将培养板置于37 ºC、5% CO2 条件下孵育30分钟，以促进细胞贴壁。
  3. 移除上清液，并用室温的0.9%生理盐水洗涤一次，以去除未贴壁的细胞。
  4. 洗涤后吸除生理盐水，每孔加入250 µL室温的完全RPMI培养基（含10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和50 ng/mL M-CSF）。
  5. 将细胞在37 ºC、5% CO2条件下孵育7天。
    1. 每隔两天向每孔添加125 µL完全RPMI培养基。细胞分化结束时，每孔终体积为500 µL。
    2. 为检测细胞活力，需在96孔板中平行设置另一组培养（每孔2 x 105 个细胞）。
    3. 巨噬细胞分化完成后（第7天），每孔加入20 µL AlamarBlue检测试剂。
    4. 孵育7小时后，使用分光光度计在570 nm和600 nm波长下读取吸光值。

3. Leishmania 培养与感染

注意： L. braziliensis 前鞭毛体 来自两个不同菌株（MHOM/BR/01/BA788 和 MHOM/BR88/BA-3456）的样本用于本实验。

  1. 计数 Lb 寄生虫，并计算获得 5 x 105/mL 寄生虫所需的体积。
  2. 配制添加补充物的 Schneider 昆虫培养基（含 10% 胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素）。
  3. 将寄生虫在 24 ºC 培养箱中，以总体积 5 mL 培养至稳定期（4 至 6 天）。
    注意：每天计数寄生虫以评估其生长情况。
  4. 达到稳定期后，在 4 ºC 条件下以 100 x g 离心 10 分钟，去除死亡的利什曼原虫（沉淀于管底）。
  5. 将上清液转移至新管中，在 4 ºC 条件下以 1,800 x g 离心 10 分钟，以回收有活力的寄生虫。弃去上清液。
  6. 用 1 mL 添加补充物的 RPMI 培养基重悬沉淀，用于寄生虫计数。
  7. 计算获得 10:1 寄生虫-细胞比例所需的寄生虫体积，并将寄生虫转移至已预先在添加补充物的 RPMI 培养基中培养的巨噬细胞培养板中（约 300 µL/孔），操作在室温下进行。
  8. 移除含有已分化巨噬细胞的各孔中的上清液。
    注意：应尽快更换每孔中的培养基，以避免细胞长时间处于无培养基状态。建议每次操作三个孔。
  9. 将计算好的 Lb 体积加入各含有已分化巨噬细胞的孔中。
  10. 在 37 ºC、5% CO2 条件下感染细胞 4 或 24 小时。
    1. 感染 4 小时后，用室温生理盐水洗涤巨噬细胞 3 次，以去除未被内化的寄生虫。
    2. 对于 24 小时感染组，在洗涤后向每孔加入 300 µL 添加补充物的 RPMI 培养基，然后在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 20 小时。
  11. 收集上清液，按照制造商说明书使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测炎症介质。
    1. 在室温下以 1,800 x g 离心收集的上清液 10 分钟，将上清液转移至新管中。此步骤用于去除未被内化的寄生虫。上清液可冷冻并保存于 -80oC，待后续分析时使用。
      注意：细胞可用于评估感染率、寄生虫活力或活性氧（ROS）的产生。

4. 感染的评估

  1. 感染率的定量
    1. 移除上清液后，向每个孔中加入 300 µL 甲醇，固定盖玻片上贴壁的细胞，静置 15 分钟。
    2. 将盖玻片从孔中取出，置于支撑物上，浸入细胞染色液（如 Quick Panoptic 2）中染色 1 分钟。
    3. 将盖玻片在细胞染色液（如 Quick Panoptic 3）中浸没两次，待其自然干燥。
    4. 在载玻片上滴加 15 µL 封片介质（如 Entellan），然后将盖玻片覆盖在封片介质上。
      ​注意：所有附着在盖玻片上的巨噬细胞均应与封片介质充分接触。
    5. 使用 100 倍物镜在光学显微镜下随机计数 100 个细胞，以定量感染率及每个细胞内化无鞭毛体的数量。
  2. 寄生虫活力检测
    1. 感染 4 小时后，用室温生理盐水洗涤细胞 3 次。
    2. 每孔加入 300 µL 添加补充物的 Schneider 昆虫培养基。
    3. 置于 24 ºC 培养箱中孵育。
    4. 在孵育 48、72、96 和 120 小时后定量检测寄生虫的生长情况。

5. 通过荧光显微镜评估活性氧的产生

  1. 感染结束后，移除上清液，并用 500 µL 生理盐水洗涤细胞。
  2. 向每孔中加入 300 µL 荧光探针试剂（例如，5 µM 的 CellROX Green 试剂）。
  3. 在 37 ºC、5% CO2 条件下孵育细胞 30 分钟。
  4. 用 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞 3 次。
  5. 加入 300 µL 3.7% 甲醛固定细胞，静置 15 分钟。
    ​注意：在 24 小时内测定荧光信号。
  6. 加入 5 µL DAPI 染色剂（例如，DAPI ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂）进行细胞染色。将含有巨噬细胞的盖玻片表面直接与 DAPI 染色剂接触放置。
  7. 使用荧光显微镜在激发波长 485/520 nm 下分析荧光信号。
  8. 使用 ImageJ 软件计算每张盖玻片上 30 个细胞的校正总细胞荧光强度（CTCF）。
    CTCF = 积分密度（所选细胞面积 × 背景荧光平均值）

6. 统计学分析

  1. 使用Mann-Whitney检验比较两组非配对样本。 使用以下方法进行统计分析 GraphPad Prism 7.0。考虑差异 具有统计学意义时 p < 0.05.

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结果

理解寄生虫与宿主细胞之间的相互作用对于阐明多种疾病发病机制中的相关过程至关重要。尽管由于细胞培养的局限性，相比细胞系，培养的人源细胞使用较少，但本文所展示的方案能够实现人源巨噬细胞的稳定且可重复的分化。该方案可用于分析免疫反应和细胞生物学的多个方面，从炎症介质的产生到人类巨噬细胞对病原体的易感性均可进行研究。

细胞分化发生的首个证据是巨噬细胞的形态学特征（图1A）。在接种当天，细胞呈圆形且体积较小，与培养7天后的形态相比明显不同。当培养物接受巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）处理后，可观察到细胞铺展现象。若缺乏M-CSF，细胞分化所需时间更长，且最终形成一群异质性的类似巨噬细胞的细胞（数据未显示）。经过7天的分化后，将巨噬细胞与AlamarBlue试剂共同孵育24小时，随后进行检测。该方法通过定量细胞将刃天青（resazurin）还原为羟基荧光素（resorufin）的能力，从而区分活细胞与死细胞。“ctrl”组指在补充培养基中培养7天的巨噬细胞，而“dead”组指在分化过程中经历渗透裂解的巨噬细胞，作为该技术的对照。一旦...

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讨论

本文所述的人单核细胞分化为巨噬细胞并继之以两种巴西利什曼原虫（L. braziliensis）菌株感染的实验方案，可用于评估寄生虫与细胞相互作用的多个方面。这些技术手段对于阐明皮肤利什曼病（CL）尚未解决的问题至关重要。通过建立该实验方案，本研究团队得以揭示来自糖尿病合并皮肤利什曼病个体的巨噬细胞免疫反应的某些特征14。

单核细胞向人巨噬细胞的分化过程十分复杂，需从培养第一天起即予以密切关注。研究人员必须监测分化进程，每日通过细胞形态学特征观察培养物的发育情况。通常，在含M-CSF的培养基中培养单核细胞七天，足以实现完全分化。需要指出的是，细胞形态受供体差异影响，不同供体之间可能观察到不同的细胞分化阶段。这一问题可通过增加供体数量加以克服，从而识别出异常样本。此外，使用M-CSF对于实现单核细胞向巨噬细胞的完全分化至关重要17；否则将导致获得大量异质性的树突状细胞样、巨噬细胞样细胞和单核细胞。其他生长因子或其组合已被用作工具，进一步将巨噬细胞极化为M1或M2表型。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由巴伊亚州研究支持基金会（FAPESB）资助，资助编号为PET0009/2016，以及巴西高等教育人员提升协调办公室（CAPES），资助代码001。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AlamarBlue 细胞活力检测试剂InvitrogenDAL1100
25 cm 细胞培养瓶²SPL70125
CellROX Green 试剂InvitrogenC10444
13 mm 盖玻片圆片Perfecta10210013CE
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）ThermoFisherD1306
一次性采血支撑架BD Vacutainer364815
Eclipse 采血针 21 g x 1.25 inBD Vacutainer368607
EntellanSigma Aldrich107961
Falcon 锥形管，15 mLSigma AldrichCLS430791-500EA
Falcon 锥形管，50 mLStemCell Technologies100-0090
胎牛血清GibcoA4766801
甲醛 3.7%默克252549
载玻片  25.4×76.2 mmPerfecta0200
HistopaqueSigma Aldrich10771
人IL-6 ELISA试剂盒RDDY206
人M-CSF重组蛋白PeproTech300-25
人TNF-α ELISA试剂盒RDDY210
白三烯B4 ELISA试剂盒Cayman520111
甲醇默克MX0482
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓缩液）赛默飞世尔科技10378-016
磷酸盐缓冲液 pH 7.2 (10x)Gibco70013032
血浆管，含158 USP单位肝素钠（喷雾涂层）BD Vacutainer367874
快速 H&E 染色试剂盒（苏木精和伊红）abcamab245880
RPMI 1640培养基Gibco11875093
施奈德昆虫培养基Sigma AldrichS0146
组织培养24孔板TPPZ707791-126EA
台盼蓝Gibco15250061

参考文献

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