利用DiCoExpress分析多因素RNA-Seq实验

摘要

DiCoExpress 是一个基于脚本的 R 语言工具，用于执行从质量控制到共表达分析的 RNA-Seq 分析。DiCoExpress 可处理包含最多两个生物学因素的完整或非平衡实验设计。本视频教程将引导用户逐步了解 DiCoExpress 的各项功能。

摘要

在高通量测序（NGS）数据分析中正确应用统计建模需要具备较高水平的专业知识。近年来，学术界逐渐达成共识，认为应采用广义线性模型进行RNA-Seq数据的差异分析，并利用混合模型开展共表达分析。为了提供一个可管理的环境来应用这些建模方法，我们开发了DiCoExpress，该工具提供了一个标准化的R语言分析流程，用于执行RNA-Seq分析。即使不具备统计学或R语言编程的专门知识，初学者也能在广义线性模型框架内，通过对比分析，完成从质量控制到差异分析再到共表达分析的完整RNA-Seq分析流程。本工具还针对差异表达基因列表以及共表达基因簇提供了富集分析功能。本视频教程设计为逐步操作指南，旨在帮助用户充分掌握DiCoExpress的使用方法，充分发挥其在提升RNA-Seq实验生物学解释能力方面的潜力。

引言

下一代RNA测序（RNA-Seq）技术现已成为转录组分析的金标准¹自该技术问世以来，生物信息学家与生物统计学家的共同努力推动了多种方法的发展，这些方法涵盖了转录组分析的各个关键步骤，从序列比对到转录本定量。²目前生物学家可用的大多数工具都是在 R 统计计算与图形软件环境中开发的³，且Bioconductor仓库中提供了大量用于生物数据分析的软件包⁴这些软件包提供了对分析过程的完全控制和自定义功能，但需要大量使用命令行界面。由于许多生物学家更习惯于使用图形化界面 "点击选择" 方法⁵RNA-Seq分析的普及需要开发更加用户友好的界面或操作流程⁶例如，可以使用 Shiny 构建 R 包的网页界面⁷，且通过 R-studio 使命令行数据分析更加直观⁸ 界面。开发专门的分步教程也有助于新用户。特别是视频教程可作为传统文本教程的补充，有助于更深入地理解整个操作流程的各个步骤。

我们最近开发了 DiCoExpress⁹，这是一种在 R 中分析多因....

方案

1. DiCoExpress

1. 启动 R Studio 会话，并将工作目录设置为 Template_scripts。
2. 在 R Studio 中打开 DiCoExpress_Tutorial.R 脚本。
3. 使用以下命令在 R 会话中加载 DiCoExpress 函数：
   > source("../Sources/Load_Functions.R")
   > Load_Functions()
   > Data_Directory = "../Data"
   > Results_Directory = "../Results/"
4. 使用以下命令在 R 会话中加载数据文件：
   > Project_Name = "教程"
   > Filter = NULL
   > Sep="\t"
   > Data_Files = Load_Data_Files(Data_Directory, Project_Name, Filter, Sep)
5. 将 Data_Files 对象拆分为多个对象，以便于操作：
   > Project_Name = Data_Files$Project_Name
   &....

结果

所有 DiCoExpress 的输出结果均保存在 Results/ 目录下的 Tutorial/ 目录中。我们在此提供一些评估分析整体质量的指导建议。

质量控制
位于 Quality_Control/ 目录中的质量控制输出对于验证 RNA-Seq 分析结果的可靠性至关重要。Data_Quality_Control.pdf 文件包含使用原始数据和标准化数据生成的多个图表，可用于识别数据中可能存在的任何问题。在比较组内和组间条件时，各样本的总标准化计数应相近。此外，标准化后的基因表达计数在组内和组间条件下应表现出相似的中位数和方差（图 3A）。否则，可能表明不同条件之间存在方差不齐的问题，这将对模型拟合造成影响。

最后，DiCoExpress 中基于标准化计数生成的 PCA 图有助于识别潜在的数据结构（图 3B）。在本示例中，重复样本之间未出现聚类，表明该因素不具备区分性.......

讨论

由于RNA测序（RNA-Seq）已成为生物学研究中普遍使用的方法，因此持续需要开发多功能且用户友好的分析工具。大多数分析工作流程中的关键步骤通常是可靠地鉴定出在不同生物学条件和/或处理之间差异表达的基因¹⁵。要获得可靠的结果，需要进行恰当的统计建模，这正是开发DiCoExpress的动因。

DiCoExpress 是一个基于 R 语言开发的脚本工具，旨在帮助生物学家在寻找差异表达基因（DEG）时充分利用中性比较研究的可能性。DiCoExpress 提供了一个标准化的分析流程，可评估数据结构与数据质量，从而确保选择最优的建模方法。即使不具备统计学或 R 编程的专门知识，初学者也能使用该工具完成从质量控制到差异分析，再到共表达分析的完整 RNA-Seq 分析流程，其中差异分析基于广义线性模型内的对比（contrast）实现。需要特别指出的是，DiCoExpress 聚焦于 RNA-Seq 分析的统计学部分，其输入要求为计数矩阵（count table）。用于 RNA-Seq 测序读段比对及生成计数矩阵的多种生物信息学方法不在本工具的涵盖范.......