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利用 体内 出生后电穿孔法研究小脑颗粒神经元形态及突触发育

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DOI：

10.3791/62568

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2021年6月9日

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center

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摘要

本文描述了一种方法，用于在小鼠出生后脑发育过程中可视化颗粒神经元的突触发生，该时期这些细胞会精细调节其突触结构，并形成突触以整合到整个脑神经回路中。

摘要

神经元在大脑发育过程中会经历结构和功能的动态变化，以与其他细胞形成适当的连接。啮齿类动物的小脑是随时间追踪单一细胞类型——小脑颗粒神经元（CGN）发育与形态发生过程的理想系统。此处， 体内 对发育中鼠小脑的颗粒神经元前体细胞进行电穿孔转染，以稀疏标记细胞，用于后续形态学分析。该技术的有效性体现在其能够清晰展示颗粒神经元（CGN）成熟过程中的关键发育阶段，尤其聚焦于树突爪结构的形成——这些特化结构是颗粒神经元接收大部分突触输入的部位。此外，该方法还可提供颗粒神经元突触结构的阶段性图像 在整个小脑发育过程中，该技术可被用于以细胞自主的方式对颗粒神经元进行遗传学操控，以研究任何目的基因的作用及其对颗粒神经元形态、爪状突起发育和突触形成的影响。

引言

大脑发育是一个漫长的过程，从胚胎发生期一直延续到出生后生命阶段。在此期间，大脑整合了多种内在和外在刺激，塑造神经元树突与轴突之间的突触连接，最终引导行为的形成。啮齿类动物的小脑是研究突触发育的理想模型系统，因为可以追踪单一神经元类型——小脑颗粒神经元（CGN）——从祖细胞转变为成熟神经元的整个过程。部分原因在于，小脑皮层的大部分结构在出生后才发育，这使得出生后易于进行遗传操作和细胞标记1。

在哺乳动物中，颗粒神经元（CGN）的分化始于胚胎发育末期，此时后脑中一部分增殖细胞迁移越过菱形唇，在小脑表面形成一个次级生发区2,3,4。尽管这些细胞已完全定型为颗粒神经元前体细胞（GNP），它们仍会在外颗粒层（EGL）的外层持续增殖，直至出生后第14天（P14）。该层细胞的增殖导致小脑体积显著扩大，因为这些细胞最终仅分化为CGN5。新生的CGN一旦在EGL中退出细胞周期，便向内迁移至内颗粒层（IGL），同时留下一条轴突，该轴突将在小脑分子层中分叉并延伸，形成平行纤维，并与浦肯野细胞形成突触连接6。这些纤维在分子层中的位置取决于细胞退出细胞周期的时机。

先分化的颗粒细胞（CGNs）会使其平行纤维朝向分子层底部延伸，而后分化的颗粒细胞的轴突则成簇聚集在分子层顶部7,8。当颗粒细胞胞体到达内颗粒层（IGL）后，它们开始形成树突，并与邻近的抑制性和兴奋性神经元建立突触连接。成熟的颗粒细胞树突具有高度保守的结构特征，包含四个主要分支。在颗粒细胞成熟过程中，这些树突末端会发育成爪状结构，并富集大量突触后蛋白9,10。这些特化的结构被称为树突爪，承载了绝大多数作用于颗粒细胞的突触连接，在功能上负责接收来自脑桥起源的苔藓纤维传入所提供的兴奋性输入，同时也接收来自局部高尔基细胞的抑制性输入。一旦突触连接完全建立，颗粒细胞即可将来自前小脑核团的信号传递至浦肯野细胞，后者则将输出投射至小脑深部核团。

与病毒转染或转基因小鼠品系构建等其他标记方法相比，体内出生后对颗粒神经元前体细胞（GNPs）进行电穿孔具有优势，因为该方法可在较短时间内实现目标表达载体的表达，并且仅靶向少量细胞群体，适用于研究细胞自主性效应。该方法已在先前研究中用于分析小脑颗粒神经元（CGNs）的形态发育；然而，这些研究通常仅关注单一时间点或较短的时间窗口9,10,11,12,13。本研究将该标记方法与图像分析相结合，系统记录了出生后前三周CGN分化全过程中小脑颗粒神经元形态的动态变化。这些数据揭示了小脑神经元树突发育的动力学过程，为小脑环路的构建机制提供了重要依据。

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方案

注意：所有操作均在杜克大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的方案下进行。

1. 体内电穿孔或IVE的DNA制备（手术前一天）

  1. 准备以下材料：纯化DNA（每只动物0.5–25 µg）、3 M乙酸钠、乙醇、快绿染料（Fast Green dye）、超纯蒸馏水、磷酸盐缓冲液（PBS）（参见材料表）。
    ​注意：本实验所用DNA为在人泛素启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒，购自Addgene（FUGW，https://www.addgene.org/14883/）。任何在泛在性启动子控制下表达GFP或其他荧光蛋白的质粒均可使用。本技术对小脑颗粒神经元（CGN）的特异性标记不依赖于质粒本身，而是取决于电穿孔过程。
  2. 通过将所需量的DNA、体积比10%的3 M乙酸钠和体积比250%的预冷无水乙醇混合，进行电穿孔前的DNA制备。请注意，DNA会立即从溶液中沉淀出来。
  3. 将DNA混合物在-20 °C下过夜沉淀，或在-80 °C下沉淀1小时。
  4. 在台式离心机中以>16,000 × g离心收集DNA沉淀，并用70%乙醇洗涤两次。
  5. 将DNA沉淀完全干燥后，重悬于含0.02%快绿染料的1× PBS溶液中。

用于精确液体测量的注射器装置，带针头限位器示意图以实现准确给药。
图1：使用限位器将注射深度限制在1.5 mm。（A）使用剃刀刀片从加样移液器上切下一节11.2 mm的管段。（B）将该限位器套在Hamilton注射器针头末端（总长度为1.27 cm或0.5 in），并用胶水或Parafilm封口膜固定。暴露出的针尖长度应为1.5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 在体 电穿孔法转染出生后七天小鼠颗粒神经元前体细胞

注意：所有电穿孔手术均在无菌且高度通风的手术室内进行，所有人员均穿戴完整的个人防护装备，包括手套、口罩、头帽、防护服和鞋套。或者，手术也可在通风良好且无菌的生物安全柜中进行。

  1. 收集以下材料：用于电穿孔的 DNA、小型手术剪、小型手术镊、定制的 Hamilton 注射器、棉签、加热垫、聚维酮碘、70% 乙醇、1× PBS、Parafilm 膜、组织粘合剂（正丁基-氰基丙烯酸酯）、异氟烷、电穿孔仪和镊子型电极（参见 材料表).
  2. 从已灭菌的上样枪头中截取一段间隔器，套在 Hamilton 注射器上，以将注射深度限制为 1.5 mm（图1A，B）。用胶水或Parafilm封固间隔垫片。
  3. 将P7幼鼠置于异氟烷麻醉舱中，以0.8 L/min的流速进行麻醉。通过观察动物呼吸频率降低以及脚趾或尾部夹捏无反应来确认麻醉完全。图 2A).
  4. 动物完全麻醉后，将幼鼠置于带有鼻罩的平台上，以0.8 L/min的流速持续输送4%异氟烷。用无菌棉签蘸取聚维酮碘溶液擦拭幼鼠头部顶部3次，再用70%乙醇交替擦拭3次，以清洁和准备手术部位。每次擦拭后均需待溶液自然干燥后再进行下一步操作。
  5. 使用一对灭菌剪刀，从耳部顶端至基部剪开一道小切口，以暴露后脑图2B).
  6. 定位小脑（图 2C），将Hamilton注射器暴露的针尖垂直于脑部穿过颅骨，并注射 1.5 µL 将DNA混合物通过缓慢推动注射器后端活塞注入小脑实质。DNA混合物注射完毕后，缓慢撤出针头以防止回流，并让DNA溶液扩散30秒。
  7. 关闭异氟烷，将幼崽置于 37 °C 加热垫。将镊子型电极两端浸入无菌1x PBS中，以准备电穿孔实验。
    注意：在对幼鼠施加电脉冲时，将镊子型电极润湿可防止其皮肤发生接触性灼伤。
  8. 将镊子电极置于注射部位上方，正极朝下，负极位于动物头部上方（图 2D使用电穿孔仪施加五个电脉冲，参数设置如下：50 ms，130 V，脉冲间隔950 ms。
    注意：如有需要，可进行一次测试性注射，以确保注射位点位于小脑蚓部图2E).
  9. 捏合切口使其闭合，并使用无毒的正丁基-2-氰基丙烯酸酯组织粘合剂封闭伤口。用70%乙醇清洁伤口，因为任何微量血液都会增加亲代 infanticide 和同类相食的风险。
  10. 让动物在温暖的环境中恢复 37 °C 手术后将幼崽放回母鼠前，先将其置于加热垫上。术后至少2小时内每30分钟监测一次幼崽情况，以确保完全恢复。
    注意：双亲均可能出现 infanticide（杀婴）行为，较为常见。为防止同类相食，应在开始电穿孔前将种鼠雄性亲本单独饲养于不同笼具中，并始终将清洁后恢复的幼崽归还即， 无血迹、活动自如）放回原笼具的原始垫料中。也可用原笼具中的粪便擦拭幼崽，以尽量减少血腥气味。如果原母鼠持续出现食仔行为，可能需要使用代孕母鼠。

小鼠手术准备用于麻醉和切口，电极植入及染料定位研究
图2: 体内 P7野生型小鼠幼崽颗粒神经元前体细胞的小脑电穿孔. (A幼崽通过以0.8 L/min流速输送的4%异氟烷进行麻醉，以确保在注射DNA溶液期间维持麻醉状态。异氟烷的输送速率为0.8 L/min。B用碘伏和70%乙醇对小鼠消毒3次后，沿两耳间距做一切口，暴露后脑。C颅骨上白色标记的放大图像，该标记为注射位点的解剖标志。DNA 构建体应注射于标记上方 1 mm 范围内；虚线框出该标记区域，黑色箭头指示注射位点。小脑蚓部的皱褶可能可见，有助于定位注射位点。D镊子型电极的取向以实现高效电穿孔。在施加电脉冲前，正极（+）必须朝下，以将带负电荷的DNA拉入小脑实质。E测试注射 1 µL 0.02% 快绿染料的显影显示注射部位局限于小脑蚓部第5至第7小叶之间的区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 电穿孔小脑颗粒神经元的免疫组织化学

  1. 准备以下材料：异氟烷、1× PBS、4% 多聚甲醛（PFA）、30% 蔗糖、正常山羊血清、非离子型去垢剂、载玻片、盖玻片、指甲油、封片剂、Hoechst 核染料以及适当的特异性一抗和二抗（见材料表）。
  2. 使用异氟烷麻醉实验动物，并通过脚趾和尾部夹捏测试确认动物已完全麻醉。
  3. 进行心脏灌注，将 1× PBS 和 4% PFA 缓慢注入动物心脏的左心室，同时剪开下腔静脉以使血液排出体外。
  4. 将脑组织浸入 4% PFA 中，在 4 °C 下固定过夜。次日，用 1× PBS 快速冲洗脑组织，然后将其转移至含 30% 蔗糖的 1× PBS 溶液中，于 4 °C 下进行冷冻保护，至少 24 小时。
  5. 如有需要，沿前后轴将脑组织切成两半，并使用直立式荧光解剖显微镜确认转染报告基因构建体的表达情况。
    注意：将脑组织置于盛有 1× PBS 的小皿中，保持浸没状态，防止干燥。
  6. 将脑组织固定于冷冻切片机上，切取 25 µm 厚的矢状切片，并将切片置于 1× PBS 与甘油按 1:1 比例配制的混合液中使其自然展开。
    注意：切片可长期保存于该冷冻保护液中，储存温度为 -20 °C。
  7. 用 1× PBS 洗涤切片三次，每次 10 分钟，以去除冷冻保护剂；随后在含 10% 正常山羊血清和 0.2% 非离子型去垢剂的 1× PBS 溶液中，于室温下在摇床上封闭组织 1 小时。
  8. 配制一抗溶液：1× PBS、10% 正常山羊血清、0.2% 非离子型去垢剂及抗-GFP 抗体，将溶液在 >16,000 × g 条件下离心 5 分钟；将切片置于该抗体溶液中，在 4 °C 下于摇床上孵育 48 小时。
  9. 用含 0.2% 非离子型去垢剂的 1× PBS 溶液洗涤切片五次，每次 15 分钟，以去除未结合的一抗。
  10. 配制二抗溶液：1× PBS、10% 正常山羊血清、0.2% 非离子型去垢剂及用于检测 GFP 的适当二抗，将溶液在 >16,000 × g 条件下离心；将切片置于该抗体溶液中，在室温下于摇床上避光孵育 2–3 小时，防止荧光淬灭。
  11. 用含 0.2% 非离子型去垢剂的 1× PBS 溶液洗涤切片三次，每次 15 分钟；随后将切片在含 Hoechst 的 1× PBS 溶液中孵育 5 分钟，以染色细胞核。
  12. 用含 0.2% 非离子型去垢剂的 1× PBS 溶液洗去 Hoechst 染液，将切片转移至载玻片上，加入封片剂，加盖盖玻片，并用指甲油密封边缘，防止封片剂蒸发。

4. 颗粒神经元的形态学分析——三维（3D）重建及表面积与细胞体积

  1. 使用共聚焦显微镜，以63倍物镜配合2倍缩放，对单个电穿孔的小脑颗粒神经元（CGNs）进行成像，每层以0.5 µm的步长采集z轴层扫图像。每个图像窗口仅包含一个细胞，以便于后续图像分析与重建。
  2. 通过以下链接安装适用于FIJI的Simple Neurite Tracer插件（https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions），以高效、便捷地在三维（3D）空间中追踪电穿孔CGNs的结构。
    注：该插件已有更新版本（https://imagej.net/SNT）。
  3. 使用Simple Neurite Tracer以盲法分析神经突长度及树突爪状结构的形成。将电穿孔CGNs的单通道z层扫图像导入FIJI，点击 Plugins | Segmentation | Simple Neurite Tracer （图3D）。
  4. 打开下拉菜单，选择 Create New 3D Viewer（图3D）。
  5. 滚动至树突基部，即其与胞体连接处，点击连接点以开始路径。通过在细胞填充信号最亮的区域逐段点击，手动追踪路径，并按 [y] 键保留追踪。若树突无爪状结构，则追踪至其末端；若存在爪状结构，则追踪至其基部，并按 [f] 键确认路径（图4D）。
  6. 接着，从爪状结构的基部开始新路径，追踪至最长神经突的末端。通过在Windows系统中按住 [ctrl] 键或在Mac OS系统中按住 [alt] 键并点击路径，可追踪二级和三级分支。按 [f] 键确认路径。
  7. 观察到路径的测量数据将在独立窗口中显示；将爪状结构各分支（一级、二级、三级）的测量值相加，得到每个爪状结构的总长度。
  8. 为分析电穿孔CGNs的表面积和细胞体积，请下载Imaris细胞分析软件（https://imaris.oxinst.com/）。
    注：也可使用FIJI结合现成的免费插件，由z层扫图像重建三维细胞结构。此外，Simple Neurite Tracer本身具备体积渲染功能，但本研究采用Imaris，原因如下文所述。
  9. 将电穿孔CGN的z层扫图像导入Imaris。点击 Surpass 以进入3D重建工具包。
  10. 为重建CGN，点击 Surfaces，并在图像窗口中选择一个涵盖整个细胞的感兴趣区域。完成后，点击右下角 Create 下方的蓝色前进箭头。
  11. 若图像包含多个不同信号的通道，请选择包含电穿孔CGN的通道，然后点击蓝色前进箭头。
  12. 使用滑动条设置一个能最准确拟合电穿孔细胞信号的阈值。放大细胞表面以更精确地确定阈值。完成后，点击双绿色箭头以重建细胞，并从元数据中获取表面积和体积数值。

电穿孔和共聚焦显微镜下的神经元成像过程；B部分显示细胞层和GFP。
图3：电穿孔颗粒神经元的免疫组织化学分析与三维重建。 对P7期CD-1小鼠进行电穿孔，转入表达GFP的质粒。收集脑组织并进行免疫组织化学染色、共聚焦显微镜观察及三维重建，以进行形态学分析。（A）从电穿孔到10-DPI小鼠图像处理的时间线。（B）电穿孔后10天（10-DPI）小脑矢状切面的最大投影图像；白色线条标示小脑各层边界，比例尺为25 µm。（C）单个电穿孔颗粒神经元在10-DPI时的最大投影图像及其对应的三维轨迹，比例尺为10 µm。（D）使用FIJI插件Simple Neurite Tracer生成三维重建图像。所有测量均通过z轴堆栈追踪细胞填充信号完成。每个树突的主干和爪状突起分别进行追踪；虚线表示当前平面内的树突部分。缩写：3D = 三维；GFP = 绿色荧光蛋白；DPI = 注射后天数；PSD-95 = 突触后密度蛋白95；GNPs = 颗粒神经元前体细胞；PFA = 多聚甲醛。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

神经元发育时间线、树突形态参数及爪状突起生长图表；显微成像与数据分析。
图4小脑发育过程中颗粒神经元形态的分析 (A) 从3天电转后到14天电转后（出生后第10天至第21天）电穿孔的小脑颗粒神经元的最大投影图像，细胞核（蓝色）和GFP（绿色）；箭头指示单个树突，比例尺为 10 µm. (B) 平均树突数量。C从胞体基部到树突末端测量的平均树突长度。D含有爪状突的树突比例；1.00 表示 100%，即所有树突均具有爪状突。E树突爪的总长度。N > 每种条件下30个细胞，每种条件至少来自4只动物；所有测量数据均采用单因素方差分析...

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讨论

小脑颗粒神经元是哺乳动物大脑中最丰富的神经元，约占啮齿类动物大脑总神经元数量的60%至70%1,14。小脑已被广泛用于阐明细胞增殖、迁移、树突形成以及突触发育的机制6,9,10,11,15,16,17,18,19,20。此外，数十年的电生理学研究有助于明确...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01NS098804（A.E.W.）、F31NS113394（U.C.），以及杜克大学夏季神经科学项目（D.G.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚维酮碘Purdue Production67618-150-17
带水泥固定装置的10 µL针头Hamilton1701SN (80008)33号针，1.27 cm（0.5英寸），4点式
鸡抗GFP抗体Millipore SigmaAB16901本实验室使用该抗体的稀释比例为1:1000
棉签
驴抗鸡Cy2抗体Jackson ImmunoResearch703-225-155本实验室使用该抗体的稀释比例为1:500
乙醇（200度）KoptecV1016
电穿孔仪ECM 830BTX Harvard Apparatus45-0052
快绿FCFSigmaF7252-5G
FUGW质粒Addgene14883
载玻片VWR48311-703Superfrost plus
甘油Sigma-AldrichG5516
加热垫Softheat
Hoechst 33342荧光染料Invitrogen62249
ImarisBitplane
异氟烷Patterson Veterinary07-893-1389
显微盖玻片VWR48382-138
指甲油Sally HansenColor 109
正常山羊血清Gibco16210064
O.C.T.包埋剂Tissue-Tek4583
Olympus MVX10体视显微镜OlympusMVX10
P200移液器加长吸头Fisherbrand02-707-138用作针头间隔器
Parafilm封口膜BemisPM-996
PBS pH 7.4（10倍浓缩液）Gibco70011-044
Simple Neurite TracerFIJIhttps://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_
Instructions
蔗糖SigmaS0389
手术器械RWD Life Science小型剪刀和镊子
Triton X-100Roche11332481001非离子型去垢剂
Tweezertrodes镊状电极BTX Harvard Apparatus45-04895 mm，铂镀层镊状电极
超纯蒸馏水Invitrogen10977-015
Vectashield封片剂VectashieldH1000
Vetbond组织粘合剂3M1469SB
蔡司780直立共聚焦显微镜Zeiss780

参考文献

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申请许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.

Figure 2 was updated from:

Surgical technique for dye injection in animal model with anesthesia setup and electrode placement.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse surgery procedure, anesthesia, incision, electrode application steps, dye localization, experiment.
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.

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