从人类原代来源或分化样本中对人巨核细胞进行免疫表型分析和细胞分选 体外 来自造血祖细胞

摘要

在此，我们介绍一种用于表征巨核细胞分化的免疫表型分析策略，并展示该策略如何利用荧光激活细胞分选仪对处于不同发育阶段的巨核细胞进行分选。该方法可应用于人类原代组织，也可用于体外培养生成的巨核细胞 体外.

摘要

巨核细胞（MK）分化包含多个内有丝分裂周期，最终形成高度多倍体（甚至可达 >64N）且体积极大的细胞（40–60 µm）。尽管在细胞生物学和分子水平上对巨核细胞生成的研究进展迅速，但通过流式细胞术对巨核细胞生成过程的表征仍局限于利用谱系特异性表面标志物鉴定成熟巨核细胞，而对早期巨核细胞分化阶段的研究仍属空白。本文介绍一种免疫表型分析策略，可在人原代样本中识别出伴随倍性逐步增加的连续巨核细胞分化阶段 体外 利用包含巨核细胞特异性与非特异性表面标志物的抗体组合对细胞进行表型分析。尽管巨核细胞体积较大且较为脆弱，仍可使用上述抗体组合，并在特定压力和喷嘴直径条件下通过荧光激活细胞分选技术对其进行富集。该方法有助于开展多组学研究，旨在更深入地理解人类巨核细胞生成及血小板产生的复杂过程。对巨核细胞生成过程的更精确表征，可能在谱系相关性疾病及恶性肿瘤的诊断或预后评估中发挥重要作用。

引言

巨核细胞（MK）由造血干细胞（HSC）经过一个称为巨核细胞生成（megakaryopoiesis）的复杂过程发育而来，该过程主要由激素血小板生成素（TPO）调控。传统的巨核细胞生成观点描述了细胞从HSC出发，依次经历一系列层级分明的定向前体细胞和祖细胞阶段，最终形成成熟的MK。在成熟过程中，MK经历多轮内有丝分裂，形成复杂的细胞内分界膜系统（DMS），从而为血小板生成提供足够的膜表面积，并高效地合成和储存成熟血小板所继承的各种颗粒中包含的大量因子^1,2,3。因此，成熟的MK是体积较大的细胞（40–60 µm），其特征为高度多倍体的细胞核（甚至可达>64N）。近期研究表明，在特定生理-病理条件下，HSC可绕过传统的谱系定commitment检查点，通过其他途径分化为MK^{4,5,6,7,8,9,....}

方案

全血和骨髓样本的采集与处理均遵循1964年《赫尔辛基宣言》。全血样本来自健康供者，在签署知情同意书（ISPA）后采集，该研究已获本院医学伦理委员会（阿斯图里亚斯中央大学医院 -HUCA-）批准。骨髓样本来自圣卡洛斯临床医院（HCSC）血液科患者骨髓穿刺剩余的废弃材料。

图1：本论文所记录方案的示意图。 图中指出了可用于通过免疫表型分析对巨核细胞（MK）分化进行分期的主要人源样本或原代培养物。该免疫表型分析策略可应用于研究不同谱系相关病理状态或恶性疾病中巨核细胞的分化过程。此外，该方法还可利用荧光激活细胞分选仪对巨核细胞及其前体细胞进行分选，从而实现对富集细胞组分的进一步分析。所使用的图片来源于Servier公司提供的Servier医学艺术图库（SMART），遵循CC BY 3.0许可协议。请点击此....

结果

骨髓与倍性
在 图4中，我们展示了来自患者骨髓样本（穿刺抽吸物）中巨核细胞生成过程的代表性免疫表型分析。当以CD71和CD31为参数绘制细胞群比例时，我们设定了六个主要细胞群：CD31^- CD71^-（红色）、CD31^- CD71⁺（蓝色）、CD31⁺ CD71^-（橙色）、CD31⁺ CD71^mid（浅绿色）、CD31⁺ CD71⁺（深绿色）以及CD31⁺⁺ CD71^mid（奶油色）。这些细胞群的位置并非始终一致（在流式细胞仪设置恒定的前提下），如图所示，这一点应予以考虑。这种差异可能与疾病的病理状态及骨髓整体状况本身有关。将上述六个细胞群反向设门，并叠加显示在针对 panel 中包含的成熟标志物（CD42A/CD42B）以及前向散射光（Fo.......

讨论

迄今为止，大多数通过流式细胞术研究巨核细胞生成的研究仅局限于使用谱系特异性表面标志物来鉴定巨核细胞亚群即，CD42A/CD42B，CD41/CD61），而对更早期的巨核细胞分化阶段的研究则较为有限。本文展示了一种免疫表型分析策略，可用于对人类巨核细胞生成过程进行系统的流式细胞术表征。总体而言，我们希望强调在同一套流式细胞术抗体组合中联合使用巨核细胞特异性与非特异性表面标志物（表1和表2）的重要性，以更细致地研究巨核细胞生成过程。我们的新方法可作为辅助血液系统疾病诊断和/或预后的有力工具。我们认为，本文所提出的抗体组合及搭配方案并非最终定论。我们在人类原代样本（主要为骨髓样本）中观察到表面标志物具有高度动态的变化特征，且该特征还依赖于潜在的病理状态。未来仍需开展更多研究，我们期望科学界能逐步应用此方法，并结合针对单一疾病的研究所提供的反馈，进一步探讨巨核细胞生成分期在疾病诊断或预后判断中的价值。正如引言部分所述，考虑到巨核细胞分化的多种路径，在原代组织中同时开展造血干细胞（HSC）与巨核细胞的联合表征具有重要意义，值得进一步深入探索。值得注意的是，我们还能够在外周血单个核细胞（PBMCs）中检测到巨核细胞，这一发现颇具意.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
130 微米喷嘴	BD	643943	MK 分选所需
5810R 离心机	Eppendorf		细胞分离与洗涤
A-4-62 摆桶转子	Eppendorf		细胞分离与洗涤
Aerospray Pro 血液学载片染色仪 / 细胞离心涂片机	ELITech Group		自动化细胞学设备，载片使用 Mat-Grünwald Giemsa 染色
CO2 培养箱 Galaxy 170 S	Eppendorf		细胞培养
Cytospin 4 细胞离心涂片机	Thermo Scientific		用于制备细胞涂片
FACSAria IIu 分选仪	BD		激光波长：488 nm 和 633 nm
FACSCanto II 流式细胞仪	BD		激光波长：488 nm、633 nm 和 405 nm
Olympus 显微镜 BX 41	Olympus		显微摄影
Olympus 显微镜 BX 61	Olympus		显微摄影
Zoe 荧光细胞成像仪	BioRad		显微摄影
获取 PBMCs
富含胆固醇的成年牛血清脂质	Sigma-Aldrich	L4646	或类似产品
Lymphoprep	Stem Cell Technologies	#07801	或类似产品
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333	或类似产品
重组人促红细胞生成素（EPO）	R&D Systems	287-TC-500	或类似产品
重组人干细胞因子（SCF）	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	或类似产品
重组人血小板生成素（TPO）	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	或 TPO 受体激动剂
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
流式细胞术分析
牛血清白蛋白	Merck	A7906-100G	或类似产品
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/阴性对照补偿微球套装	BD	552843	针对人细胞的抗体通常来源于小鼠
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	或类似产品
BD FACS Accudrop 微球	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	小鼠抗人
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	小鼠抗人
CD41 PE	BD	555467	小鼠抗人
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	小鼠抗人
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	我们观察到非特异性结合……需进行评估
CD42A PE	BD	558819	小鼠抗人
CD42B PerCP	Biolegend	303910	小鼠抗人
CD49B PE	BD	555669	小鼠抗人
CD61 FITC	BD	555753	小鼠抗人
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	小鼠抗人
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
人源 BD Fc 封闭剂	BD	564219	Fc 封闭对照
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	小鼠抗人
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	小鼠抗人
RNase	Merck	R6513	或类似产品
Triton X-500	Merck	93443-500ML	或类似产品
用于分选的细胞筛
CellTrics 滤器 100 微米	Sysmex	04-004-2328	细胞筛
注：我们未列出通用试剂/化学品（如 PBS、EDTA 等）、一次性耗材（如离心管等）或已在先前发表的标准方案中指定的试剂 ——除非另有说明。