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方法文章

使用线性吻合器进行大鼠Roux-en-Y胃旁路术的操作方案

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DOI：

10.3791/62575

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2021年8月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Alberta, 2Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, 3Department of Medicine, University of Alberta

本文内容

摘要

Roux-en-Y 胃旁路术（RYGB）用于治疗肥胖症和糖尿病。然而，RYGB 疗效的潜在机制尚未完全明确，且由于技术难度较高，动物模型研究常因高死亡率而受限。本文提供了在大鼠中实施 RYGB 手术并获得高成功率的操作指南。

摘要

Roux-en-Y 胃旁路术（RYGB）常用于治疗重度肥胖和2型糖尿病。然而，其减重及代谢变化的机制尚不完全清楚。目前认为多种因素可能参与其中，包括热量摄入减少、营养吸收降低、饱腹感增强、促进饱腹感的激素释放、胆汁酸代谢的改变以及肠道微生物群的改变。

大鼠RYGB模型为研究这些机制提供了理想框架。既往小鼠模型的研究死亡率较高，范围在17%至52%之间，限制了其广泛应用。大鼠模型对手术刺激具有更强的生理耐受能力，且技术上更易于操作，因其可使用外科吻合器。然而，使用外科吻合器的一个挑战在于，其常导致较大的胃囊残留，不能真实反映人类RYGB手术后的实际情况。

在本实验方案中，我们介绍了一种在大鼠中使用外科吻合器进行Roux-en-Y胃旁路术（RYGB）的方法，该方法可形成一个较小的胃囊。通过两次使用吻合器切除大鼠的前胃，我们获得了一个类似于人类典型RYGB术后所形成的较小胃囊。与锐性切割相比，外科吻合还能实现更好的止血效果。此外，大鼠的前胃不含任何腺体，因此其切除不应改变RYGB术后的生理状态。

与假手术组相比，RYGB 组的体重减轻和代谢变化显著，并在 14 周时表现出显著降低的葡萄糖耐受性。此外，RYGB 术后该方案的存活率高达 88.9%。本方案中描述的技术无需显微外科经验即可掌握。一旦掌握，该手术将为研究 RYGB 的机制及效应提供一种可重复的工具。

引言

肥胖症和2型糖尿病已成为全球性流行病1。尽管医学减重可改善患者的糖尿病病情，但重度糖尿病患者从减重手术中获益最为显著。减重手术已被证实具有安全性和有效性，不仅能有效减轻体重，还能改善甚至治愈2型糖尿病2,3，即使在病程较长的患者中亦如此4。代谢性减重手术（如目前作为金标准的Roux-en-Y胃旁路术，RYGB）可迅速且持续地改善血糖稳态，同时减少对降糖药物的需求5,6,7。

RYGB 术后，葡萄糖稳态的改善迅速发生，且独立于体重减轻8。目前提出了两种主要理论，用以解释代谢手术后糖尿病缓解所伴随的代谢变化。首先，远端肠道假说认为，旁路术后更高浓度的未消化营养物质到达远端小肠，从而增强如 GLP-1 等激素的释放。另一方面，近端肠道假说则认为，跳过近端小肠可减少抗肠促胰岛素激素的分泌。这两种效应均可能导致葡萄糖代谢的早期改善9。

动物模型在研究这些机制方面具有重要潜力。然而，使用小鼠或大鼠模型的主要障碍在于实施这些手术操作的技术难度较高。大多数研究依赖于小鼠或大鼠模型10,11,12。由于小鼠胃体积过小，无法使用吻合器设备，因此小鼠模型存在较大困难11，且死亡率过高，范围在17%至52%之间，难以接受13。在大鼠模型中，由于在离断胃之前需对胃部血管进行复杂的结扎操作，部分实验方案仍存在技术上的困难12,14。其他模型虽使用吻合器离断胃，但所形成的胃囊较大，与RYGB术后人类解剖结构不一致11。在本模型中，我们提供了在大鼠模型中使用直线型吻合器实施RYGB手术的详细操作步骤，所形成的胃囊更接近人类解剖结构。总体而言，该手术具有优异的存活率和代谢效果。

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方案

动物使用方案已获得阿尔伯塔大学健康科学动物护理与使用委员会（AUP00003000）的批准。参见图1以查看展示RYGB解剖结构的示意图。

1. Roux-en-Y 胃旁路术

  1. 动物准备与手术设置
    1. 手术前一周，除常规的固体食物和饮水外，为大鼠提供口服补液疗法及液体饮食，以使其适应这种新的饮食模式。
    2. 手术前12-18小时内仅提供水的快速禁食大鼠。
      1. 确保大鼠在抬高的金属丝平台上禁食，以防止其摄入垫料。
    3. 手术前立即按1 mg/kg剂量对大鼠皮下注射长效缓释布托啡诺（buprenorphine sustained release, SR）。
    4. 对所有手术器械、毛巾和手术单进行高压灭菌。
    5. 用70%乙醇清洁操作台面、加热垫和麻醉鼻罩。
    6. 在手术区域设置手术显微镜、麻醉机及所需器械，布局应符合手术操作者的符合人体工学要求。
    7. 使用温度可控的加热垫，并设置为 37 °C。
    8. 在加热垫上覆盖无菌铺巾或毛巾。
    9. 用0.9%生理盐水填充一个50 mL无菌锥形管。
  2. 麻醉诱导与准备
    1. 根据既往 established 方案，使用 4% 异氟烷诱导麻醉15.
    2. 对四肢的后足施加压力，以确保无疼痛反应。
    3. 每5分钟检查一次麻醉深度和呼吸频率。
    4. 在双眼内涂抹润滑剂，以防止干燥。
    5. 剃除腹部的毛发。
    6. 用聚维酮碘溶液清洁腹部。待溶液干燥后，更换为无菌手套。
    7. 用手术巾覆盖大鼠，使腹部区域的手术巾留有开口以暴露腹部。
    8. 将器械、缝线、棉签和10 mL注射器放置在术中便于取用的位置。
  3. 中线腹切开术
    1. 使用手术刀在腹部正中线上方作一个3 cm的切口，切口位置位于剑突下方，以剑突作为解剖标志。
    2. 使用剪刀沿腹白线中线位置切开筋膜和腹膜，注意保持居中以减少腹直肌出血。若出现出血，应使用热凝或电凝止血。
  4. 游离胃部
    1. 使用两根湿润的棉签，钝性分离胃部附着组织。
    2. 遇到致密粘连时，应小心使用电凝灼切分离胃部附着组织，避免灼伤胃壁。锐性分离胃与副肝叶之间的韧带，以降低胃游离过程中肝脏撕裂的风险。
    3. 对于较大的血管，尤其是胃短动脉，使用6-0聚丙烯缝线进行结扎。
    4. 在食管右侧远端、左胃动脉近端处创建一个窗口。确保棉签可从后方到达该区域。当胃能够被充分游离并移出腹腔外时，即表明胃的游离已足够。
  5. 识别并分离空肠
    1. 通过向近端追踪空肠，直至观察到其与横结肠系膜的附着处，以辨认屈氏韧带。
    2. 从远端测量7 cm，于肠系膜血管之间确定位置，使用显微剪刀剪断肠管。剪断肠管时应避开派伊尔结。注意仅剪断肠管，避免损伤肠系膜。
    3. 在离断肠管前，放置一块清洁的、生理盐水浸湿的纱布垫，以尽量减少污染。
    4. 检查小肠边缘系膜处是否存在细小的横行血管，若存在则使用电凝将其切断，以避免出血。
    5. 继续向肠系膜根部方向分离肠系膜1 cm。
    6. 确定近端和远端空肠。将近端空肠置于大鼠右侧的湿纱布下，远端空肠置于大鼠左侧。
  6. 胃部固定术
    1. 在前胃的白线上插入一把45 mm线性切割吻合器，使用3.5 mm钉高，以形成一个较小的胃囊。吻合器激发前等待10秒。
    2. 使用纱布在缝钉线处施加压力1分钟，以确保止血。若仅通过压迫无法止血，则使用6-0聚丙烯缝线以八字缝合法缝合缝钉线上的出血部位。
    3. 在胃部先前创建的窗口处进行第二次钉合。钉合前等待10秒。沿钉合线施加压力以确保止血，必要时可加缝针。
  7. 胃空肠吻合术
    1. 在胃部钉合后立即进行胃切开术。若延迟操作，由于第二次胃钉合后胃的连续性已中断，可能导致胃扩张和误吸。
    2. 使用11号刀片在远端胃囊处切开一个胃造口。通过胃造口排出胃内容物，以防止胃部膨胀和误吸。使用显微剪将胃造口延长至约5 mm，切口大小以刚好能通过棉签头为宜。
    3. 游离靠近胃切口处的空肠远端，并将其放置到位，确保肠系膜无扭转。
    4. 缝合吻合口时，应使用浸有生理盐水的纱布覆盖肠管，并定期补充生理盐水，以保持肠管湿润。
    5. 使用6-0聚对二氧环己酮或聚丙烯缝线，在吻合口下缘放置牵引缝线，并用止血夹轻轻牵拉。打三个结固定。
    6. 在吻合口上缘放置一根固定缝线，使用止血夹轻轻牵拉，打六个结固定。
    7. 以连续缝合方式缝合吻合口前侧，进针时每针宽1 mm，间距1 mm，注意避免穿透对侧壁。
    8. 当缝线到达下部固定缝线时，用额外的六个结将其与之打结固定。
    9. 前侧操作完成后，翻转肠管和胃，将下方固定缝线穿过肠系膜缺损处。重新安装夹子，并向下牵引。
    10. 在吻合口后侧，使用6-0间断全层缝合，缝针间距1 mm，进针宽度1 mm，注意避免穿透后壁。每针以六个结扎紧。
      注意：吻合口的前壁采用连续缝合，而后壁采用间断缝合。此种缝合方式可避免因全周连续缝合导致的潜在狭窄或梗阻。
    11. 通过轻柔推动管腔内容物穿过吻合口来检查是否存在渗漏。若发现渗漏区域，需仔细使用间断缝线进行加固。在使用额外缝线加固时，应注意避免缝及后壁。
  8. 空肠-空肠吻合术
    1. 从胃空肠吻合口向远端测量20 cm。
    2. 使用11号刀片在空肠对系膜侧做空肠切开术。避免在派尔集合淋巴结上方进行空肠切开。
    3. 使用显微剪刀扩大该空肠切口，使其大小与胆胰支长度相同，确保棉签恰好能够进入。
    4. 放置胆胰支肠段，确保肠系膜无扭转。
    5. 使用6-0缝线在上方和下方放置固定缝线，以类似胃空肠吻合的方式进行吻合。前壁采用连续缝合，后壁采用间断缝合。
    6. 在进行吻合时，需用生理盐水保持肠管湿润。
    7. 通过轻推管腔内容物穿过吻合口以检查是否存在渗漏。若发现渗漏区域，需用间断缝合线进行加固。
  9. 重新定位肠管和胃
    1. 确保食管囊袋、残胃或肝脏无扭曲。确保肝脏左叶位于胃的前方，而非受困于囊袋后方，以免造成压迫性肝缺血。
    2. 将肠管置于腹腔内自然位置，确保无扭曲。
  10. 腹部关闭
    1. 用3-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物以连续缝合法关闭筋膜，也可使用3-0聚对二氧环己酮。
    2. 用2-0丝线连续缝合皮肤。
  11. 麻醉苏醒
    1. 将异氟烷减至零，但继续给予辅助氧气。
    2. 在切口处给予局部麻醉剂进行喷洒式阻滞。
    3. 在颈后皮下组织注射10 mL 5%葡萄糖生理盐水（D5NS）。
    4. 在大鼠完全清醒前戴上伊丽莎白式大鼠颈圈。注意将其佩戴贴合，但不可过紧以免造成不适。
      ​注意：为防止伤口裂开，颈圈需保留至第5天。

2. 假手术

注意：假手术的操作与RYGB类似，但不进行任何吻合术。

  1. 行胃切开术，然后用6-0聚对二氧环己酮或聚丙烯缝线关闭。
  2. 在屈氏韧带远端7 cm处行空肠切开术，然后用6-0聚对二氧环己酮或聚丙烯缝线关闭。

3. 术后护理

  1. 术后护理
    1. 将大鼠单独饲养，并将其置于抬高的金属丝网平台上，直至重新引入固体食物，以防止其摄入垫料并导致管腔阻塞。
      注意：由于胃空肠吻合处的水肿可能在过早恢复固体饮食时引起梗阻，因此术后饮食需逐步恢复。
    2. 当大鼠处于抬高的金属丝网平台时，每日检查足部，观察是否存在皮肤改变。
    3. 术后前72小时内，仅提供饮水和口服补液疗法饮食。
    4. 术后前72小时内，每12小时给予10 mL的5%葡萄糖生理盐水（D5NS）。
    5. 若大鼠表现出疼痛迹象，可皮下注射短效丁丙诺啡，剂量为0.01 mg/kg。疼痛评估采用大鼠面部表情评分量表（Rat Grimace Scale）16。
    6. 术后第3天，添加啮齿类动物液体饮食。继续提供饮水和口服补液疗法。
    7. 术后第5天，重新开始高脂饮食。继续提供饮水和液体饮食。移除伊丽莎白圈。
    8. 术后第7天，停止液体饮食。
    9. 术后第10至14天拆除皮肤缝线。

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结果

动物与饲养
36只雄性Wistar大鼠以每笼两只的方式饲养，并从6周龄开始喂食60%无菌高脂饲料（图2）。在16周龄时，这些大鼠接受Roux-en-Y胃旁路术（RYGB）或假手术。术后第一周后，大鼠恢复高脂饮食。其中一半大鼠在术后2周被实施安乐死，另一半则在术后14周被实施安乐死。

死亡率
总体而言，33只（91.7%）大鼠存活至预定的研究终点。所有提前实施安乐死的大鼠均由兽医进行尸检。有2只大鼠在24小时内被实施安乐死：其中1只接受RYGB手术的大鼠出现吸入性肺炎，另1只假手术大鼠出现筋膜裂开并伴有无法挽救的肠管损伤。另1只接受RYGB手术的大鼠在术后两周因胃空肠吻合口漏而被实施安乐死。总体而言，88.9%的RYGB手术大鼠存活至研究终点。

体重
接受RYGB手术的大鼠术后体重低于假手术组大鼠。图3<...

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讨论

RYGB 手术包括创建一个较小的胃囊（小于 30 mL），并构建一条胆胰支和一条空肠支（图 1）。在人体中，胆胰支通常长 30 至 50 cm，用于输送来自残余胃、肝脏和胰腺的分泌物。空肠支通常长 75 至 150 cm，是摄入食物的主要通道。共同通道是指两支汇合处远端的剩余小肠部分，大部分消化和吸收在此进行，胰酶和胆汁在此处与摄入的食物混合17。

RYGB 减重的机制是多模式的。小胃囊通过机械性限制减少食物摄入量。由于小肠的大部分不再吸收热量和营养物质，旁路结构导致了吸收不良的成分。最近的研究表明，肠道激素在 RYGB 术后的减重中也起着重要作用，主要涉及饥饿素、肽酪氨酸酪氨酸（PYY）、胆囊收缩素（CCK）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）激素通路18。

大鼠模型为研究RYGB手术对体重和代谢效应的机制提供了有力的方法。本文介绍了一种RYGB手术方案，该方案死亡率低，且...

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披露

Ethicon 提供了两把 45 mm 线性切割吻合器、多个 3.5 mm 吻合器钉仓以及 6-0 聚丙烯缝合线。作者声明无其他利益冲突。

致谢

本研究由美国代谢与减重手术学会研究奖资助。Ethicon 公司慷慨提供了缝线、吻合器和夹子。主要作者的博士研究由阿尔伯塔大学临床研究员项目和阿尔伯塔创新临床研究员奖学金资助。我们还要感谢 Michelle Tran 为 RYGB 解剖结构提供的医学插图。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-0 丝线缝合线EthiconK533
3-0 Vicryl 缝合线EthiconJ219H
4% 异氟烷N/AN/A
5% 葡萄糖和0.9%氯化钠溶液 - 1000 mLBaxter2B1064
50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
6-0 Prolene 缝合线Ethicon8805H
麻醉机N/AN/A
动物毛发剃毛器N/AN/A
聚维酮碘溶液N/AN/A
Castrojievo 针持（带锁，14 cm，光滑弯曲）World Precision Instruments503258
ECHELON FLEX 可调节内窥镜线性切割器EthiconEC45A
经济型镊子 #4World Precision Instruments501978
ENDOPATH ETS 可调节线性切割器 45 mm 装填组件Ethicon6R45B
远红外加热垫控制器（含加热垫（15.2 cm 宽 × 20.3 cm 长）、垫温探头和10个一次性非无菌保护套）Kent ScientificRT-0515
大型大鼠伊丽莎白圈Kent ScientificEC404VL-10
液体饮食饲管（150 mL）Bio-Serv9007
液体饮食饲管支架（短款可调）Bio-Serv9015
微型蚊式止血钳World Precision Instruments500452
微型剪刀World Precision Instruments503365
小鼠饮食，高脂肪热量（60%），软颗粒Bio-ServS3282
11号刀片及手术刀柄N/AN/A
OPMI Vario 外科手术显微镜ZEISSS88
抬高式地板网格TecniplastGM500150 Raised Floor Grid
啮齿类动物液体饮食，Lieber-DeCarli '82，对照型，4 升/袋Bio-ServF1259
0.9% 氯化钠冲洗液 - 500 mLBaxterJF7633
无菌棉签N/AN/A
无菌手术单N/AN/A
无菌毛巾N/AN/A
热电灼仪World Precision Instruments501293

参考文献

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