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方法文章

使用荧光相关光谱法检测蛋白质聚集

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DOI：

10.3791/62576

⸱

2021年4月25日

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

本文内容

摘要

本文介绍一种利用荧光相关光谱法在细胞裂解液和活细胞中检测蛋白质寡聚体及聚集物的实验方法。

摘要

蛋白质聚集是神经退行性疾病的一个标志性特征，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）等。为了检测和分析可溶性或弥散状态的蛋白质寡聚体或聚集体，已采用荧光相关光谱技术（FCS），该技术具有单分子灵敏度，可检测单个粒子的扩散速度和亮度。然而，用于蛋白质聚集检测的标准化操作流程和关键技术细节尚未被广泛共享。本文展示了在细胞裂解液和活细胞中，利用FCS测量易聚集蛋白质扩散特性的标准操作流程：以与ALS相关的TAR DNA/RNA结合蛋白43 kDa的25 kDa羧基末端片段（TDP25）和超氧化物歧化酶1（SOD1）为研究对象。代表性结果表明，在小鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞裂解液的可溶性组分中，部分绿色荧光蛋白（GFP）标记的TDP25聚集体仍轻微存在。此外，携带ALS相关突变的GFP标记SOD1在活细胞中表现出更慢的扩散速度。因此，本文介绍了利用FCS通过蛋白质扩散特性来检测其聚集状态的操作流程。

引言

涉及神经退行性疾病的蛋白质聚集，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等1 已知具有毒性，会扰乱细胞和器官中的蛋白质稳态（proteostasis），进而可能导致衰老2清除蛋白质聚集被视为一种潜在的治疗策略；然而，目前尚未建立能够有效抑制蛋白质聚集形成并降解已形成蛋白质聚集体的化合物（例如小分子或药物）。此外，蛋白质聚集产生毒性的具体机制仍不明确。因此，为了推动与蛋白质聚集相关的研究，建立可简便检测蛋白质聚集的高通量方法显得尤为重要。利用能够识别蛋白质聚集构象的抗体或聚集特异性荧光染料来检测蛋白质聚集的方法已被广泛使用。3然而，使用这些经典方法检测聚集现象尤其困难，特别是在活细胞中。

荧光共振能量转移（FRET）是一种用于检测蛋白质聚集和结构变化的方法。然而，FRET 无法分析蛋白质的动力学过程（例如活细胞中蛋白质的扩散和寡聚化）3。因此，本文介绍一种简单的方法，利用荧光相关光谱（FCS）在溶液（例如细胞裂解液）和活细胞中检测蛋白质聚集。FCS 能够以单分子灵敏度测量荧光分子的扩散特性和亮度4。FCS 是一种基于激光扫描共聚焦显微镜（LSM）的光子计数方法。通过使用高灵敏度的光子探测器，并计算光子到达时间的自相关函数（ACF），可测量荧光分子在检测体积内通过的时间和亮度。分子量增加时，扩散速度减慢；因此，可利用 FCS 估算分子间的相互作用。更有力的是，荧光分子亮度的增加表明分子发生了同源寡聚化。因此，FCS 是检测此类蛋白质聚集的有力工具。

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方案

1. 材料与试剂

  1. 使用无热原的溶液和培养基进行细胞培养（表1）。
  2. 使用超纯水配制生化实验所需的溶液，并确保其无DNase/RNase。
  3. 选择适合细胞培养的胎牛血清（FBS），并经过批次检测流程。由于所选FBS批次会定期更换，此处无法提供具体的目录号和批次编号。
  4. 质粒DNA
    1. 准备用于表达eGFP单体的pmeGFP-N15；用于表达GFP-TDP25的pmeGFP-C1-TDP256；用于表达SOD1-G85R-GFP的pmeGFP-N1-SOD1-G85R7；以及用作载体的pCAGGS8。
      注：meGFP是增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的单体变体，携带A206K突变。TDP25是与肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关的TDP-43蛋白C端片段。SOD1-G85R是与ALS相关的SOD1突变体。
  5. 细胞株
    1. 使用小鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞。
      ​注：Neuro2a细胞具有较高的转染效率，并能高效表达外源蛋白。对于TDP25的表达，需要选用表达效率高的细胞株，如Neuro2a或HEK293细胞。在HeLa细胞中，TDP25无法有效表达。

2. 细胞培养与转染

  1. 在100 mm塑料培养皿中，使用正常生长培养基培养处于半汇合状态的Neuro2a细胞。
    注意：前次传代后需在37 °C孵育约48–72小时，直至达到半汇合状态。
  2. 移除培养基。
  3. 向细胞培养皿中加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C孵育1分钟。
  4. 向培养皿中加入9.5 mL正常生长培养基，重悬脱落的细胞。
  5. 使用台盼蓝染色死细胞，通过细胞计数仪或手动计数细胞数量，然后将细胞用培养基稀释至浓度为1.0 × 105/mL。
  6. 将2 mL细胞悬液加入35 mm塑料培养皿（用于细胞裂解）或玻璃底培养皿（用于活细胞检测）中。
  7. 将培养皿在37 °C孵育1天。
  8. 在转染当天前15分钟开始进行以下准备工作。
  9. 准备两个1.5 mL离心管，每管加入100 μL Opti-MEM I培养基。
  10. 在第一管中加入1.0 μg质粒DNA（溶液A）；在第二管中加入2.5 μL Lipofectamine 2000（溶液B）。
    注意：为保持转染效率，应维持总DNA量不变。若需降低活细胞FCS检测中的蛋白表达水平，应减少用于蛋白表达的质粒DNA比例（例如，pmeGFP-N1-SOD1-G85R为0.2 μg，pCAGGS混合物为0.8 μg）。此外，Lipofectamine 2000的体积与质粒DNA的量之间应保持相同比例。
  11. 将溶液A与溶液B轻轻混合（将其中一种加入另一管中），室温孵育1分钟，得到溶液C。
  12. 将溶液C加入培养基中，并在37 °C继续孵育细胞24小时。

3. 细胞裂解 & 培养基更换

  1. 使用普通显微镜检测GFP表达情况。
  2. 移除培养皿中的培养基。
  3. 加入2 mL 25 °C的PBS洗涤培养基，随后移除PBS。
  4. 将培养皿置于覆盖碎冰的铝板上。
    注意：我们使用在周日工具店购买或市售的实验室用1 mm厚铝板。
  5. 加入200 μL 4 °C的裂解缓冲液，轻轻摇动培养皿，使缓冲液均匀分布于皿底。
  6. 用细胞刮刀刮取培养皿中的细胞，并将含有未溶解细胞碎片的裂解液转移至新的1.5 mL离心管中。
  7. 在4 °C条件下，以20,400 x g离心5分钟。
  8. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，置于4 °C或冰上保存。
    注意：切勿冷冻裂解液。
  9. 进行活细胞检测时，应在检测前更换培养基。使用相差显微镜检查细胞贴壁情况，并通过荧光显微镜确认表达情况。

4. 荧光相关光谱（FCS）校准

  1. 启动系统并运行操作软件。打开氩离子激光器（Argon+，458/477/488/514 nm）。系统至少稳定运行 30 分钟。
  2. 设置光路：主分光镜：HFT488；二向色镜：NFT600；荧光截止滤光片：带通滤光片 505–540（BP505–540）；探测器：雪崩光电二极管（APD）。
  3. 通过直接输入数值设置针孔大小（66 μm；1 个艾里单位）。
  4. 将罗丹明 6G（Rh6G）溶液加入载玻片腔室的孔中，并将腔室置于显微镜载物台上。
  5. 在物镜上添加浸没用超纯水。请勿使用浸油。
  6. 将腔室放置在显微镜载物台上，并移动载物台至合适位置。
  7. 通过检测玻璃表面散射光聚焦到上层玻璃表面。将物镜降至底部后，顺时针旋转调焦旋钮进行调节。
    注意：请确认调焦旋钮的旋转方向，因为日本和德国制造的设备方向相反。
  8. 将焦点向上提升 200 μm，以观察溶液内部。
  9. 点击 计数率，监测光子计数率。
  10. 逐步增加声光可调滤波器（AOTF）的数值（例如激发激光透射率），使计数率达到 10 kHz 以上。
  11. 点击 针孔调节，打开针孔调节向导。在 x 轴和 y 轴方向上分别找到光子数最高（峰值）的针孔位置。
  12. 调节物镜的校正环，使每分子计数（CPM）值达到最大。
    注意：由于本实验所用腔室盖玻片厚度为 0.12–0.17 mm，校正环应位于其最小值附近或仅稍作几圈调节，此时 CPM 值最高。
  13. 逐步降低 AOTF 数值，使 CPM 值降至 2–3 kHz。
  14. 采集 Rh6G 的自相关函数（ACF）信号，持续 90 秒。
  15. 测量完成后，点击 拟合 进行曲线拟合分析。
  16. 选择包含三重态的单组分三维（3D）扩散模型。
    注意：Rh6G 为单一分散体系，其扩散行为符合含三重态的单组分扩散模型。
  17. 通过移动红线设置拟合起始时间。点击 全部拟合 并检查拟合偏差。完成曲线拟合后，确保扩散时间（DT）和结构参数（SP）分别大致处于 20–30 μs 和 4–8 的范围内。
  18. 记录结构参数的数值。在同一天、相同光学条件下，使用相同类型的玻璃底培养皿或腔室化盖玻片进行所有 ACF 测量时，均应使用该 SP 值进行曲线拟合分析。

5. 细胞裂解液中的FCS测量

  1. 制备细胞裂解液（见上文）。
  2. 将裂解液置于盖玻片腔室中。加盖以防止干燥，并使用载物台盖板遮光。
  3. 设置采集条件，包括激光功率、测量时间和重复次数。
  4. 点击 计数率，调节激光的AOTF值，使CPM值超过1 kHz。
  5. 进行1分钟的预实验测量。检查计算得到的ACF是否呈现正向振幅且衰减平滑。
  6. 进行5分钟的正式测量。
    注意：总测量时间应逐步增加，直至ACF曲线形状不再随测量时间延长而改变。
  7. 点击“拟合”以执行曲线拟合分析。
  8. 选择包含三重态的双组分三维扩散模型。在点击“全部拟合”之前，务必输入SP值，并将其设置由“自由”更改为"固定"，而非"自由"。
  9. 将拟合结果表格导出为制表符分隔的文本文件。
  10. 如有需要，将ACF和计数率记录导出为制表符分隔的文本文件。

6. 活细胞中FCS测量

  1. 测量前更换为新鲜培养基。
  2. 使用加热台孵育器。将细胞培养皿放置在显微镜载物台上。
  3. 使用共聚焦显微镜确认焦平面和位置。选择待测细胞，放大并调整细胞位置。采用慢速扫描模式获取表达GFP的细胞的荧光图像。
  4. 在"FCS"部分中，使用Position选择FCS测量位置。
  5. 使用十字准线选择至少一个FCS测量点（图1）。
  6. 测量ACF持续1分钟。
    注意：由于荧光蛋白在活细胞中移动较慢，相较于溶液环境更容易发生光漂白，因此测量时间应尽可能短。通常难以像溶液测量那样获得平滑的细胞内ACF曲线，因为长时间测量会导致荧光蛋白的光漂白。
  7. 点击Fit，使用包含三重态的双组分三维扩散模型进行曲线拟合分析。
    注意：对于活细胞测量，使用包含三重态的双组分三维扩散模型更为合适，因为在活细胞中存在多种可移动组分，经验上很难通过单组分三维扩散模型将卡方值降至理想水平。但即使采用三组分三维扩散模型，其扩散组分的分离效果通常也不如双组分模型清晰。

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结果

我们在细胞裂解液中对GFP-TDP25以及在活细胞中对SOD1-G85R-GFP进行了FCS测量。在这两种情况下，均获得了正振幅且平滑的自相关曲线（ACF）。我们此前已证明，在指定条件下，Neuro2a细胞中表达的GFP-TDP25部分可在可溶性组分中回收6。在细胞裂解液的可溶性组分中，利用FCS在光子计数率记录中检测到极强的荧光分子信号（图2A，上方，箭头所示）。此类“尖峰（也称为爆发信号）”在GFP单体及单分散化学荧光染料溶液中均未观察到，提示这些尖峰代表寡聚化蛋白9。采用包含三重态的双组分三维扩散模型进行曲线拟合分析显示，快速扩散组分（DTFast = 186 μs）约占90%，其余10%的扩散时间为2.3 ms（图2A，下方；以及表2）。

在活细胞中进行 SOD1-G85R-GFP 测量时，光子计数率记录显...

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讨论

在测量前进行系统校准时，应使用与样品测量相同的玻璃器皿（例如，用于细胞裂解液的8孔盖玻片培养皿和用于活细胞的35 mm玻璃底培养皿）。由于罗丹明6G（Rh6G）会吸附在玻璃表面，其有效浓度有时会降低。若出现此情况，仅用于针孔调整时可使用较高浓度的Rh6G溶液（如1 μM）。必须避免过高的光子计数率，以保护探测器（例如，超过1000 kHz）。此外，高浓度溶液不适用于自相关函数的采集（应保持低于100 kHz）。针孔位置的校准至关重要。若光学系统使用频繁，针孔发生显著位移的情况较为罕见；因此，通常开始时使用"Fine"即可找到合适的位置。若使用"Fine"无法找到计数率的峰值位置，应先使用"Coarse"将针孔从运动范围的一端移动到另一端，再通过"Fine"进行定位。若自相关函数（ACF）的幅度呈平坦状，需检查焦点和位置是否合适。

在完成 Rh6G 测量及其拟合后，如果 DT 和/或 SP 超出指定范围，应重新调整针孔和校正环。若仍超出范围，建议联系设备制造商的技术支持，因为这可能是光学系统存在缺陷所致。利用测得的 DT...

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披露

这些作者没有利益冲突。

致谢

A.K. 获得日本学术振兴会（JSPS）科学研究费助成项目（C）（#18K06201）、中谷基金会针对新型冠状病毒感染对策的助成金、北海道大学未来研究领袖培养办公室（L-Station）的资助，以及好庵社基金会的助成金支持。M.K. 部分获得日本学术振兴会（JSPS）创新领域科学研究费助成项目的支持。 "用于多分子拥挤生物系统的化学" （#20H04686）以及日本学术振兴会（JSPS）创新领域科学研究费补助金 "生命物质的信息物理学" (#20H05522)

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含酚红的 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA·4Na 溶液（胰蛋白酶-EDTA）Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
100 mm 塑料培养皿CORNING430167
35 mm 玻璃底培养皿IWAKI3910-035用于活细胞检测
35 mm 塑料培养皿Thermo Fisher Scientific150460
铝制板Bio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl Zeiss物镜
细胞刮刀Sumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
醋酸纤维素滤膜（0.22 mm）Advantech Toyo25CS020AS
8 孔盖玻片培养板IWAKI5232-008用于溶液检测
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Sigma-AldrichD5796基础培养基
胎牛血清（FBS）biosera需进行批号检测
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS 系统
小鼠神经母细胞瘤 Neuro2a 细胞ATCCCCL-131细胞系
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938转染载体用质粒 DNA
青霉素-链霉素溶液（×100）Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25编码单体 eGFP 标记的 TDP25 的质粒 DNA
pmeGFP-N1编码单体 eGFP 表达的质粒 DNA
pmeGFP-N1-SOD1-G85R编码与单体 eGFP 融合的 ALS 相关 SOD1 G85R 突变体的质粒 DNA
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP8304

参考文献

  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
  3. Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
  4. Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background - Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
  5. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  6. Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230(2016).
  7. Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
  8. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  9. Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
  10. Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
  11. Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
  12. Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
  13. Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
  14. Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).
  15. Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
  17. Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
  18. Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
  19. Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).

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