使用荧光相关光谱检测蛋白质聚合

Summary

我们在这里介绍了一个程序，以测量蛋白质寡聚物和聚合在细胞溶解和活细胞使用荧光相关性光谱。

Abstract

蛋白质聚集是神经退行性疾病（如肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）、阿尔茨海默病 （AD）、帕金森病 （PD）、亨廷顿舞蹈症 （HD） 等的标志。为了检测和分析可溶性或扩散的蛋白质寡聚物或聚合物，已经使用了荧光相关光谱（FCS），它可以检测具有单分子灵敏度的单个粒子的扩散速度和亮度。然而，蛋白质聚合检测的适当程序和专有知识尚未得到广泛推广。在这里，我们展示了FCS测量细胞裂解和活细胞中容易聚集的蛋白质扩散特性的标准程序:TAR DNA/RNA结合蛋白43 kDa（TDP25）和超氧化物分解酶1（SOD1）的ALS相关25 kDa盒式终端片段。代表性结果表明，绿色荧光蛋白（GFP）标签TDP25的聚合部分被稍微包含在穆林神经母细胞神经母细胞核糖核酸的可溶性部分。此外，带有ALS相关突变的GFP标记SD1显示活细胞的扩散速度较慢。因此，我们介绍使用FCS通过其扩散特性检测蛋白质聚合的程序。

Introduction

蛋白质聚集涉及神经退行性疾病，如肌萎缩性侧索硬化症（ALS），阿尔茨海默病，帕金森病，亨廷顿舞蹈症等¹ 已知是有毒的，并会扰乱蛋白质平衡（蛋白酶），然后可能导致老化^2。蛋白质聚集的清除有望作为一种治疗策略:然而，防止蛋白质聚集形成和降解蛋白质聚合物（如小分子或药物）的化学物质尚未确定。此外，蛋白质聚合如何产生毒性仍然难以捉摸。因此，为了促进与蛋白质聚集相关的研究项目，必须引入高吞吐量程序，以简单地检测蛋白质聚合。蛋白质聚合检测使用抗体识别蛋白质聚合和聚合特异性荧光染料的一致性已被广泛使用^3。然而，很难检测聚合，特别是在使用这种经典程序的活细胞中。

弗斯特共振能量转移 （FRET） 是检测蛋白质聚合和结构变化的程序。然而，FRET无法分析蛋白质动力学（例如，活细胞中蛋白质的扩散和寡聚化^）3。因此，我们在这里引入了一个简单的协议，使用荧光相关光谱（FCS）检测溶液（如细胞裂解）和活细胞中的蛋白质聚合，该光谱学测量荧光分子的扩散特性和亮度，具有单分子灵敏度^4。FCS 是一种使用激光扫描对焦显微镜 （LSM） 进行光子计数的方法。利用高度灵敏的光子探测器和光子到达时间的自相关函数（ACF）计算，测量检测体积中荧光分子的通过时间和亮度。随着分子量的....

Protocol

1. 材料和试剂

1. 使用热源性免费解决方案和细胞培养介质 （表 1）。
2. 使用超纯水为生化实验准备解决方案，并作为无 DNase/RNase 使用。
3. 选择适合细胞培养的 FBS，并具有大量的检查过程。由于所选的 FBS 批次会定期更改，此处无法在此处表示 FBS 的目录和批号。
4. 普拉斯米德DNA
   1. 为电子GFP单体表达准备pmeGFP-N1^5; pmeGFP-C1-TDP25⁶ 表示 GFP-TDP25 表示:pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ 表示 SOD1-G85R-GFP 表达:和pCAGGS⁸ 作为载体。
      注:meGFP是携带增强GFP（eGFP）A206K突变的单体变种。TDP25 是 TDP-43 的 ALS 相关 C 端片段。SOD1-G85R 是 SOD1 的 ALS 相关突变体。
5. 细胞应变
   1. 使用穆林神经母细胞神经2a细胞。
      注:Neuro2a细胞具有很高的转染效率和高度表达的外源性蛋白质。对于TDP25表达，需要具有高表达效率的细胞菌株，如神经2a或 HEK293细胞。在 HeLa 细胞中，TDP25 无法有效表达。

Results

我们在活细胞中对细胞裂解剂中的GFP-TDP25和SOD1-G85R-GFP进行了FCS测量。在这两种情况下，都能够获得正振幅和光滑的ACF。我们已经表明，在神经2a细胞中表达的GFP-TDP25的一部分在指示条件⁶下的可溶性部分被恢复。在细胞裂解物的可溶性部分，使用FCS（图2A，顶部，箭头）在光子计数速率记录中检测到极亮的荧光分子。在GFP单体和单散射化学荧光染料溶液中未观察到这种"尖峰（也称为爆裂）"，这表明尖峰表示寡糖蛋白^9。曲线拟合分析使用模型假设双组件3D扩散与三胞胎状态显示，快速扩散分子（DT_快速= 186 μs）是~90%，其余10%是2.3毫秒（图2A，底部;表2）。

在活细胞的SOT1-G85R-GFP测量过程中，光子计数率记录显示逐渐下降，表明其光在检测量（

Discussion

关于测量前的系统校准，应使用与用于测量样品的玻璃器皿相同的玻璃器皿（例如，8 井盖玻璃室用于细胞测定，35 毫米玻璃底盘用于活细胞）。由于 Rh6G 吸附在玻璃上，其有效浓度有时可能会降低。如果是这样，应该只用于针孔调整的高度浓缩 Rh6G 解决方案，如 1 μM。必须避免极高的光子计数率以保护探测器（例如，超过 1000 kHz）。此外，集中解决方案不适用于获取自动关系功能（保持小于 100 kHz）。针孔位置的校准很重要。如果频繁使用光学系统，针孔的戏剧性错位是罕见的:因此，在开始使用"精细"往往没有问题，找到合适的位置。如果未找到使用"精细"的计数速率的峰值位置，则使用"粗"将针孔从运动范围的一端移动到另一端，然后使用"精细"进行位置查找。如果 ACF 的振幅为平缓，请检查焦点和位置是否合适。

在 Rh6G 测量及其安装后，如果 DT 和/或 SP 未达到指示范围，请重新尝试针孔和校正环调整。当仍然显示范围外时，我们建议联系制造商的支持，因为它可能是由于光学系统的疑似缺陷。使用测量的DT和SP，除了已知的Rh6G（414μm^2/s）在水中的扩散系数，有效.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% （w/v） 胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA·酚红的 4Na 溶液（胰蛋白酶-EDTA）Fujifilm	Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
100 mm 塑料培养皿	CORNING	430167
35 mm 玻璃底培养皿	IWAKI	3910-035	用于活细胞测量
35 mm 塑料培养皿	Thermo Fisher Scientific	150460
铝板	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr.UV-VIS-IR M27	卡尔蔡司		Objective
Cell 刮刀	住友电木有限公司	MS-93100
醋酸纤维素滤膜 （0.22 mm）	研华 东洋	25CS020AS
盖玻片腔 8 孔	IWAKI	5232-008	用于溶液测量
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Sigma-Aldrich	D5796	基础培养基
胎牛血清 （FBS）	生物血清		需要进行批次检查
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS 系统
小鼠神经母细胞瘤 Neuro2a 细胞	ATCC	CCL-131	细胞系
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	用于转染载体的质粒 DNA
青霉素-链霉素溶液（&次;100 ）	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			单体 eGFP
			用于 eGFP 单体表达
粒 DNA pmeGFP-N1-SOD1-G85R			标记的 SOD1 的 ALS 连接 G85R 突变体的质粒 DNA