抗菌免疫蛋白的鉴定 大肠杆菌 使用 MALDI-TOF-TOF-MS/MS 和自上而下蛋白质组学分析

摘要

本文介绍一种利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自主开发的软件进行自上而下蛋白质组学分析，快速鉴定基因组测序的致病菌所产生蛋白质的实验方案。由于天冬氨酸效应，亚稳态蛋白质离子发生断裂，该特异性被用于蛋白质鉴定。

摘要

本方案通过抗生素诱导，从致病性大肠杆菌（Escherichia coli）菌株中鉴定其杀菌酶——大肠杆菌素E3（colicin E3）和细菌素（bacteriocin）的免疫蛋白，并利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）及自研软件支持的自上而下蛋白质组学分析进行鉴定。大肠杆菌素E3的免疫蛋白（Im3）和细菌素的免疫蛋白（Im-Bac）通过天冬氨酸效应裂解机制，在天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺残基的C端侧发生多肽主链断裂（PBC），产生显著的b型和/或y型片段离子而得以鉴定。该软件可快速扫描由该菌株全基因组测序获得的in silico蛋白质序列，并在成熟蛋白序列发生截短的情况下，迭代去除蛋白质序列中的氨基酸残基。每种免疫蛋白均对应一条具有匹配质荷比及片段离子特征的单一蛋白质序列。随后通过人工核查，确认所有检测到的片段离子均可被合理指认。Im3的N端甲硫氨酸在翻译后被切除，而Im-Bac则保留完整序列。此外，我们发现仅需两个或三个由PBC产生的非互补片段离子即可准确鉴定正确的蛋白质序列。最后，在该菌株质粒基因组中，抗菌基因和免疫基因上游均鉴定出一个启动子（SOS box）。

引言

通过质谱法对未消化的蛋白质进行分析和鉴定被称为自上而下蛋白质组学分析^1,2,3,4。该技术现已成熟，采用电喷雾电离（ESI）⁵ 和高分辨率质谱分析器⁶，以及复杂的解离技术，例如电子转移解离（ETD）、电子捕获解离（ECD）⁷、紫外光解离（UV-PD）⁸ 等。

另一种软电离技术是基质辅助激光解吸/电离（matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI）^9,10,11，该技术在自上而下蛋白质分析中的应用相对较少，部分原因是它主要与飞行时间（time-of-flight, TOF）质谱分析器联用，而与其他质谱分析器相比，TOF的分辨率有限。尽管存在这些局限性，MALDI-TOF和MALDI-TOF-TOF....

方案

1. 微生物学样品制备

1. 用无菌的 1 µL 接种环从甘油菌种保存管中取 E. coli O113:H21 菌株 RM7788（或其他细菌菌株），接种于装有 25 mL LB 培养基的 50 mL 圆底离心管中。盖紧管盖，在 37 °C、200 rpm 振荡条件下预培养 4 小时。
2. 取 100 µL 预培养的菌液，涂布于添加了 400 或 800 ng/mL 丝裂霉素-C 的 LB 琼脂平板上。将琼脂平板置于 37 °C 培养箱中静置过夜培养。
   注意：STEC 菌株为致病性微生物，除常规培养外，所有微生物操作均须在 BSL-2 生物安全柜中进行。
3. 用无菌 1 μL 接种环挑取单个可见菌落的细菌细胞，转移至含有 300 μL HPLC 级水的 2.0 mL 带 O 型圈垫片的螺口微量离心管中。盖紧管盖，短暂涡旋振荡后，在 11,337 x g 离心 2 分钟，使细胞沉淀。

2. 质谱分析

1. 取0.75 μL样品上清液点样于不锈钢MALDI靶板上，待其自然干燥。在已干燥的样品点上覆盖0.75 μL的 芥子酸饱和溶液 ，该溶液由33%乙腈、67%水和0.2%三氟乙酸组成。让斑点自然干燥。
2. 使用MALDI-TOF-TOF质谱仪分析干燥后的样品点。
   1. 将MALDI靶板装入质谱仪后....

结果

图3（上图）显示了在添加了400 ng/mL丝裂霉素C的LBA培养基中过夜培养的STEC O113:H21菌株RM7788的质谱图。m/z 7276、7337和7841处的峰先前已被鉴定为冷休克蛋白C（CspC）、冷休克蛋白E（CspE）以及一种功能未知的质粒携带蛋白³³。m/z 9780处的蛋白离子[M+H]⁺通过MS/MS-PSD进行分析，结果如图3（下图）所示。前体离子使用时间离子选择器（TIS）窗口（±100 Da）进行分离。碎片离子以其m/z值及类型/编号标识。m/z 2675.9处的碎片离子（以星号标出）来自图3（上图）中m/z 9655处亚稳态蛋白离子解离产生的溢出信号。每个碎片离子的理论平均m/z值（括号内）基于上方所示的大肠杆菌素E3免疫蛋白（Im3）序列的肽键断裂（PBC）计算得出。PBC发生位点以红色星号标出，并对应生成的碎片离子。N端甲硫氨酸被加下划线，表示其在成熟蛋.......

讨论

实验方案注意事项
本实验方案的主要优势在于其速度快、样品制备简单，以及所用仪器相对易于操作、培训和维护。尽管液相色谱-电喷雾电离-高分辨质谱（LC-ESI-HR-MS）在自下而上和自上而下的蛋白质组学分析中应用广泛，且在许多方面均显著优于基质辅助激光解吸电离-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-TOF）的自上而下分析，但其耗时更长，需要更多人力和专业技术。仪器的复杂性常常会影响未经质谱学正式培训的科研人员是否愿意采用某些仪器平台。采用MALDI-TOF-TOF的自上而下方法旨在将MALDI-TOF-MS的应用范围扩展到临床微生物学实验室中目前用于细菌分类鉴定之外的领域，同时不会显著增加分析所需的工作量、操作复杂性或技术要求。

该方案不采用任何机械（或电学）细胞裂解步骤。尽管本方案也可用于检测分泌性或细胞外蛋白，但此方法的早期版本最初是为检测产志贺毒素大肠杆菌（STEC）菌株中的志贺毒素（Stx）而开发的，其中抗生素诱导会触发细菌的SOS反应，从而表达噬菌体基因，包括stx以及负责细菌细胞裂解的晚期噬菌体基因

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4000系列Explorer软件	AB Sciex	版本 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF 分析仪	AB Sciex
乙腈 Optima LC/MS 级	Fisher Chemical	A996-1
BSL-2 生物安全柜	The Baker Company	SG403A-HE
细胞色素-C	Sigma	C2867-10MG
Data Explorer 软件	AB Sciex	版本 4.9
Focus Protein 还原-烷基化试剂盒	G-Biosciences	786-231
GPMAW 软件	灯塔数据	版本 10.0
培养箱	VWR	9120973
LB 琼脂	Invitrogen	22700-025
LB肉汤	Invitrogen	12795-027
溶菌酶	Sigma	L4919-1G
2 mL 带螺口盖和O型圈的微量离心管	Fisher Scientific	02-681-343
MiniSpin Plus 离心机	Eppendorf	22620207
丝裂霉素-C（源自链霉菌）	Sigma-Aldrich	M0440-5MG
肌红蛋白	Sigma	M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP 型号 420	赛默飞世尔科技	Model 420
芥子酸	赛默飞世尔科技	1861580
无菌 1 μL 接种环	Fisher Scientific	22-363-595
硫氧还蛋白（大肠杆菌，重组）	Sigma	T0910-1MG
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	299537-100G
Optima LC/MS级水	Fisher Chemical	W6-4