通过基于固体支持膜（SSM）的电生理学选择转运蛋白靶向抑制纳米抗体

摘要

纳米抗体是结构生物学中的重要工具，对疗法的发展具有巨大的潜力。然而，选择具有抑制特性的纳米抗体可能具有挑战性。在这里，我们展示了使用基于固体负载膜（SSM）的电生理学对靶向电原膜转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体进行分类。

摘要

单域抗体（纳米抗体）已被广泛用于蛋白质的机制和结构研究，它们作为开发临床疗法的工具具有巨大的潜力，其中许多疗法依赖于膜蛋白（如转运蛋白）的抑制。然而，用于确定运输活性抑制的大多数方法在高通量例程中难以执行，并且依赖于标记底物的可用性，从而使大型纳米体库的筛选复杂化。固体支撑膜（SSM）电生理学是一种高通量方法，用于表征电生转运蛋白并测量其转运动力学和抑制作用。在这里，我们展示了基于SSM的电生理学的实现，以选择靶向电生二次转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体，并计算纳米抗体抑制常数。该技术对于选择靶向未获得标记底物的转运蛋白的抑制性纳米抗体可能特别有用。

引言

抗体由两个相同的重链和两个轻链组成，它们负责抗原结合。骆驼科动物具有仅重链抗体，与传统抗体^1，2相比^，它们对同源抗原表现出相似的亲和力。仅重链抗体的单变量结构域（VHH）保留了完整的抗原结合电位，并且已被证明非常稳定^1，2。这些分离的VHH分子或"纳米抗体"已经在与膜蛋白生物化学相关的研究中实现，作为稳定构象^3，4，作为抑制剂^5，6，作为稳定剂^7，以及作为结构测定的小工具^8，9，10 .纳米抗体可以通过对骆驼的免疫来产生，用于编码靶标特异性纳米体的B细胞的预富集和随后的B细胞的分离，然后克隆纳米体库并通过噬菌体显示^{选择11，12，13。}生成纳米抗体的另一种方法是基于体外选择方法，其依赖于文库的构建和通过噬菌体展示，核糖体展示或酵母展示14，15，16，17，18，19，20进行选择。这些体外方法需要大的文库尺寸，但受益于避免动物免疫，并且有利于选择靶向稳定性相对较低的蛋白质的纳米抗体。

纳米抗体体积小，稳定性和溶解性高，抗原亲和力强，免疫原性低，且相对容易生产，使它们成为开发治疗药物^21，22，23的有力候选者。特别是，抑制多种膜蛋白活性的纳米抗体是临床应用的潜在资产^{5、24、25、26。}在膜转运蛋白的情况下，为了评估纳米体是否具有抑制活性，有必要开发一种允许检测运输底物和/或共底物的测定。这种测定通常涉及标记分子或底物特异性检测方法的设计，这可能缺乏普遍应用。此外，抑制性纳米抗体的鉴定通常需要筛选大量粘合剂。因此，一种可以在高通量模式下使用并且不依赖于标记基质的方法对于这种选择至关重要。

基于SSM的电生理学是一种极其灵敏，高度时间分辨的技术，允许检测电荷在膜上的运动（例如，离子结合/传输^{）27，28。}该技术已应用于表征电生转运蛋白，由于这些蛋白质的周转率相对较低，因此很难使用其他电生理学技术进行研究29，30，31，32，33，34，35。SSM电生理学不需要使用标记的底物，它适用于高通量筛选，并且可以使用含有目标转运蛋白的蛋白脂质体或膜囊泡。在这里，我们证明了基于SSM的电生理学可用于对具有抑制性和非抑制性特性的转运蛋白靶向纳米抗体进行分类。作为原理验证，我们描述了细菌胆碱转运蛋白重建为脂质体的过程，然后是SSM传感器上蛋白脂质体固定化的详细步骤。接下来，我们将介绍如何对胆碱转运进行基于SSM的电生理学测量以及如何确定半最大有效浓度（EC_50）。然后，我们展示了如何使用基于SSM的电生理学来筛选多个纳米抗体并鉴定胆碱转运的抑制剂。最后，我们描述了如何确定所选抑制纳米抗体的半最大抑制浓度（IC_50）。

方案

1. 膜蛋白重构

1. 将 3 mL 极性大肠杆菌 脂质与 1 mL 磷脂酰胆碱混合在通风罩下的圆底烧瓶中。
2. 使用旋转蒸发器和37°C水浴在真空下干燥脂质混合物20分钟以除去氯仿。如果需要，在氮气或氩气下进一步干燥。
3. 使用含有2 mM β巯基乙醇的TS缓冲液（20mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl），将脂质重悬至25mg / mL。
4. 等分脂质在500μL等分试样中，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C。
5. 解冻一个500μL脂质等分试样，并使用含有2mM β巯基乙醇的TS缓冲液以1:1稀释。
6. 使用400nm膜挤出脂质悬浮液15次。
7. 稀释脂质悬浮液，最终脂质浓度为4.4mg / mL。
8. 加入正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）以达到0.2%的终浓度，并在室温（RT）下以200rpm旋转1小时。
9. 使用1:10至1:100（w:w）之间的脂质比将纯化的蛋白质添加到脂质中。
   注:该比率需要根据底物传输的SSM电生理学测量中检测到的信号的强度进行调整（见下文）。要获得较大的信号，请使用较小的脂蛋白比。
10. 将混合物在室温下以200rpm旋转1小时。
11. 加入30mg / mL聚苯乙烯吸附珠，在TS缓冲液中预洗。
    注:逐步添加聚苯乙烯珠。
12. 在缓慢搅拌下在室温下孵育珠子 - 脂质混合物30分钟。
13. 要去除珠子，让珠子 - 脂质混合物静置，以使珠子沉降下来。将溶液转移到新管中，并将珠子留在后面。将30mg / mL新鲜聚苯乙烯吸附珠加入分离的脂质混合物中。
14. 在缓慢搅拌下将混合物在4°C下孵育1小时。
15. 如步骤1.13所述，将珠子从混合物中分离出来，并加入30mg / mL新鲜聚苯乙烯吸附珠。
16. 将混合物在4°C下孵育16小时。
17. 如步骤13所述，将珠子从混合物中分离出来，并加入30mg / mL新鲜聚苯乙烯吸附珠。
18. 将混合物在4°C下孵育2小时，以进行第四次和最后一次洗涤。
19. 在4°C下以110，000×g离心30分钟。
20. 用含有2mM β巯基乙醇的500μLTS缓冲液洗涤沉淀。
21. 在4°C下以110，000×g再次离心30分钟。
22. 将沉淀重悬至TS缓冲液中25mg / mL的最终脂质浓度，其中2mM β巯基乙醇。
23. 使用凝胶内或酰胺黑测定^法36估计蛋白质浓度。
24. 等分蛋白脂质体，在液氮中快速冷冻，储存在-80°C。

2. 芯片准备

1. 用50-100μL的0.5mM 1-十八烷硫醇溶液（重悬于异丙醇中）填充单个传感器芯片。
2. 在室温下用溶液孵育芯片30分钟。
3. 通过在纸巾上敲击芯片来除去硫醇溶液。
4. 用5 mL纯异丙醇冲洗传感器3次。
5. 用 5 mL 双蒸馏水冲洗传感器 3 次。
6. 通过轻拍薄纸擦干传感器。
7. 应用1.5μL7.5μg/ μL 1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（脂质在旋转蒸发器中干燥并重悬于正癸烷中）。
8. 之后，立即用50μL非激活SSM缓冲液填充传感器，其中不含底物。这将导致SSM层的自发形成。
   注意:应事先优化 SSM 缓冲区，以确定具有低背景噪声的最佳条件。含有30 mM HEPES pH 7.4，5 mM MgCl_2，140mM NaCl的通用缓冲液可用作起点。不带底物的SSM缓冲液用于测量前后的洗涤（非激活缓冲液）。为避免缓冲液不匹配，请使用非激活缓冲液制备含有底物的缓冲液（激活缓冲液）。基材可以直接作为粉末添加，也可以从高浓度储液中以小体积添加，以避免稀释。
9. 在室温下解冻步骤1.24中的蛋白脂质。
10. 在非活化SSM缓冲液中稀释1:5至1:100之间的蛋白脂质体（蛋白脂质体:缓冲液，（v:v））（此处为1:20）。
11. 超声处理蛋白脂质体20-30秒或3次10秒，如有必要，在超声处理之间放在冰上。这里使用了45 kHz的水浴超声仪。
12. 将5-10μL稀释的超声蛋白脂体样品施加在传感器表面而不接触它。
13. 用溶液在室温下以2，000至3，000 x g之间的速度离心芯片30分钟。
    注意:使用 50 mL 平底试管。使用镊子小心地将传感器芯片竖直放置。也可以使用6孔板和带板架的离心机。
14. 在同一天使用传感器芯片。

3. 测量溶质输送:测定饱和条件

注意:作为原理证明，这些实验是使用按照上述方案在脂质体中重建的细菌胆碱转运蛋白进行的。这里显示了在纳米抗体测量抑制之前确定底物胆碱饱和条件的分步过程。

1. 准备 1-2 L 非激活 SSM 缓冲液。
   注意:在所有测量过程中，为所有激活和非激活缓冲液准备并使用相同的 SSM 缓冲液。
2. 取10个干净的试管，并将10 mL非激活的SSM缓冲液转移到每个管中。
3. 使用一系列围绕预期最大浓度半浓度（此处为15，10，5，1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.005，0.001mM胆碱）的浓度将底物加入管中，以制备活化SSM缓冲液。使用高浓度的储备液以避免稀释。
4. 打开 SSM 计算机。
5. 启动 SSM 软件并让计算机自动初始化。设置数据的保存路径，然后单击"确定"按钮进行确认。在工作流选项中选择标准的初始清理协议，然后单击运行。
6. 将蛋白脂体涂层芯片安装在插座上，移动手臂锁定芯片，并用盖子关闭安装的芯片。
7. 在工作流程中选择 CapCom 程序，然后让它 运行 以确定电导率和电容。在将其用于测量之前，请确认电导率低于5 nS，电容在15至35 nF之间。
   注:使用3 mm芯片时，制造商建议电容值为15-35 nF，电导率低于5 nS。
8. 将活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。
9. 将非激活缓冲液转移到储液槽中，并将其放置在右侧储液器位置的切屑座旁边。
10. 使用一系列非激活 （B）、激活 （A） 和未激活 （B） 溶液（B-A-B 序列）以及一个循环为工作流程创建一个协议，该循环执行三次测量并移动到步骤 3.3 中制备的所有 10 个缓冲液的下一个激活缓冲液。使用 200 μL/s 的默认流速，B-A-B 序列使用 1 s - 1 s - 1 s 的流速。单击 播放 以开始测量。
    注:典型的实验包括非激活（B），激活（A）和非激活（B）溶液（写为B-A-B;见 图1A）的顺序流。传感器上固定的蛋白脂体将用溶液洗涤。因此，B-A溶液交换产生底物浓度梯度，从而驱动电原转运反应。
11. 保存协议，并通过单击"播放"按钮让工作流运行。执行相同类型的实验，但使用无蛋白脂质体。这非常重要，因为它将显示背景电流的强度。在分析用蛋白脂质体测量的电原转运数据时，应考虑这一点（图1C）。
12. 使用任何首选软件进行数据分析，以绘制测量的电流与时间的关系。手动读出峰值电流，或者如果使用软件，则使用该功能在添加激活缓冲区的范围内进行峰值高度估计。
13. 绘制峰值电流与底物浓度的关系图，通过非线性回归确定底物的EC_50（图1B，C）。读出峰值电流达到最大值的最低浓度，该浓度对应于饱和条件。
    注意:重要的是要考虑到保持固定的蛋白脂质体的数量因芯片而异。这种变化是显而易见的，因为在相同的测量条件下，峰值电流将显示不同的振幅。因此，在比较不同芯片制备的测量值之前，有必要分别对每个芯片上进行的测量的电流幅度进行归一化。

4. 抑制性和非抑制性纳米抗体的连续分类

注意:本节说明如何在存在特异性结合细菌胆碱转运蛋白的纳米抗体的情况下测量胆碱转运。纳米体存在时较小的峰值电流表明传输抑制。非抑制性纳米抗体不会影响底物运输，即峰值电流信号不会减少。

1. 准备1-2 L非激活SSM缓冲液。
2. 将50 mL非激活SSM缓冲液转移到干净的管中。将底物胆碱加入至终浓度为5mM（饱和条件）。将其用于阳性对照测量。
3. 将10 mL非激活SSM缓冲液转移到干净的管中。将底物胆碱加入至终浓度为5mM（饱和条件），并将纳米体加入至终浓度为500nM。
4. 对每个纳米体重复步骤4.3以制备活化溶液。
   注意:如果纯化的纳米抗体重悬在与SSM缓冲液不同的缓冲液中，则它们添加到激活和非激活缓冲液中将导致缓冲液不匹配。应避免缓冲器不匹配，因为这会导致高噪声。将纯化纳米抗体的缓冲液与SSM缓冲液交换可以帮助避免此问题。此外，建议使用允许达到饱和条件的纳米体浓度。考虑到纳米抗体的结合常数一般在100 nM以下，本实验建议纳米体浓度为500 nM。但是，重要的是要预先筛选最佳浓度。
5. 启动SSM机器并测量蛋白脂体涂层芯片的电容和电导率，如步骤3.4-3.7中所述。
6. 将没有纳米体的活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液置于探针采样器中。将没有纳米体的非活化缓冲液转移到储液器中，并将其定位在探针采样器中。
7. 将含有纳米抗体的活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。将含有纳米抗体的非活化缓冲液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。
8. 使用一系列非激活 （B）、激活 （A） 和非激活 （B） 解决方案（B-A-B 序列）为工作流创建协议。
9. 创建一个执行以下操作的循环:使用不含纳米体的缓冲液对B-A-B序列进行三次测量，使用含有纳米体的缓冲液对B-A-B序列进行两次测量，与纳米体孵育的延迟时间为120秒，然后使用含有纳米体的缓冲液对B-A-B序列进行3次测量。
10. 保存工作流，并通过单击" 播放 "按钮让它运行。
    注意:该工作流程将通过使用不使用纳米体的非激活（B）和激活缓冲液（A）运行B-A-B协议3次来测量无抑制的运输的初始条件（图1B，C），然后通过运行B-A-B协议5次测量纳米体对运输的影响，非激活和激活缓冲液含有纳米体（图2A).二阶结合动力学决定了纳米抗体及其靶蛋白的相互作用。因此，重要的是在B-A步骤中使用时间延迟，以便为纳米体提供足够的时间与芯片上蛋白脂质体中的转运蛋白结合。最佳时间取决于纳米体浓度，即在较低浓度下需要更长的时间。前两次测量需要使系统适应新条件，第二次运行应在120 s的延迟时间后进行。只有以下三个测量值应用于数据分析。
11. 使用非激活（B），激活（A）和非激活（B）溶液序列（B-A-B序列）和5个测量环为工作流程创建新实验方案，以冲洗掉可逆结合的纳米体。
    注意:可选地，包括一个孵育步骤，以允许具有缓慢动力学的纳米体的解离。
12. 保存工作流，并通过单击" 播放 "按钮让它运行。
13. 将测量值的最后一个峰值电流与步骤 4.10 中仅基板的初始测量值进行比较。如果峰值电流达到初始值，纳米体已被成功洗掉，并且初始条件已重新建立，否则重复步骤4.12-4.13或更改为新芯片。
14. 重复步骤4.6-4.13，并对每个纳米体屏幕使用单独的芯片（图2C），或者使用相同的芯片对多个纳米体重复（图2D）。
15. 使用任何首选软件进行数据分析，以绘制测量的电流与时间的关系。手动读出峰值电流，或者如果可用，在所使用的软件中，自动选择在添加激活缓冲区的范围内进行峰值高度估计的功能。
16. 根据前面的仅基板测量，在纳米体存在的情况下对峰值电流进行归一化。在直方图中绘制峰值电流，并将仅测量基底的峰值电流与在纳米体存在下测量的峰值电流进行比较（图2C，D），以识别抑制性纳米抗体。
    注意:对于使用纳米体的每次单独运行的确定峰值电流，应考虑在前面测量中没有纳米体的情况下的峰值电流进行归一化。此外，由于保持固定状态的蛋白脂质体数量因芯片而异，因此在比较不同芯片制备之间的测量值之前，分别对每个芯片上执行的测量的当前幅度进行归一化非常重要。

5. IC₅₀ 测量抑制性纳米抗体

注意:在鉴定抑制性纳米抗体后，可以确定其最大抑制浓度的一半（IC_50）。这是通过测量恒定浓度下胆碱的运输，同时改变抑制纳米体浓度来完成的。

1. 准备 1-2 L 非激活 SSM 缓冲液。
2. 将50 mL非激活SSM缓冲液转移到干净的管中。将底物胆碱加入至终浓度为5mM（饱和条件）。将其用作阳性对照的激活溶液。
3. 取8个干净的试管，并在每个试管中加入5毫升非激活溶液。将底物胆碱加入至终浓度为5mM（饱和条件）。将抑制性纳米体以预期IC 50范围内的浓度（此处为₅₀₀ nM - 1 nM）添加到管中。
4. 取8个干净的管，并在每个管中加入10 mL非激活溶液。以与步骤5.3相同的浓度分别向每个试管添加抑制性纳米体。这对应于非激活缓冲区。
   注意:这将在相同抑制性纳米体的不同浓度下产生一系列激活和非激活缓冲液对。
5. 启动SSM设置并测量蛋白脂体涂层芯片的电容和电导率，如步骤3.4-3.7中所述。
6. 将不含纳米体的活化溶液转移到小瓶中，并将其置于探针采样器中。将不含纳米体的非活化缓冲液转移到储液槽中，并将其放置在右侧芯片支架旁边的储液槽位置。
7. 将含有纳米抗体的活化溶液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。将含有纳米抗体的非活化缓冲液转移到小瓶中，并将缓冲液定位在探针采样器中。
8. 使用一系列非激活 （B）、激活 （A） 和非激活 （B） 解决方案（B-A-B 序列）为工作流创建协议。包括一个环，测量每个浓度2次，孵化120秒，再测量3次。工作流程将从仅对底物进行正对照开始，然后是纳米体的最低浓度。每次纳米体测量之后，将进行后续的阳性对照测量，仅使用底物以恢复初始峰值振幅，然后移动到下一个更高的纳米体浓度。
   注:二阶动力学决定了纳米体的结合。因此，在 B-A 步骤中使用时间延迟非常重要。最佳时间取决于纳米体浓度，即在较低浓度下需要更长的时间;在这里使用120秒，结果令人满意。
9. 使用任何首选软件进行数据分析，以绘制测量的电流与时间的关系。手动读出峰值电流，或者如果使用软件，则选择在添加激活缓冲器的范围内进行峰值高度估计的功能（图3A）。绘制峰值电流与纳米体浓度的关系，通过非线性回归确定IC_50（图3B）。
   注:在比较不同芯片制备的测量值之前，对每个芯片执行的测量的电流幅度进行归一化。

6. 传感器清洁

1. 使用后用10 mL蒸馏水冲洗单个传感器芯片。
2. 通过在薄纸上敲击芯片来干燥芯片。
3. 用100μL纯异丙醇填充芯片的传感器腔，并在室温下孵育10分钟。
4. 将棉签放入纯异丙醇中，孵育1-3分钟。
5. 使用预先浸泡的棉签，在传感器表面轻轻旋转，无需压力即可清除残留物。
6. 用5 mL纯异丙醇冲洗传感器。
7. 用 10 mL 蒸馏水冲洗传感器。
8. 通过在纸巾上敲击芯片来干燥传感器。
9. 让传感器在室温下干燥过夜，并在干燥条件下在室温下储存。
   注:正确清洁和存放后，传感器最多可重复使用 4-5 次。

结果

基于SSM的电生理学已被广泛用于表征电生转运蛋白。在这里介绍的方案中，我们展示了如何使用基于SSM的电生理学根据其抑制性和非抑制性特性对靶向二级转运蛋白（此处为细菌胆碱共装运蛋白）的纳米抗体进行分类。该技术最有用的功能之一是它允许对多个缓冲液条件进行高通量筛选。这种特殊特性有利于纳米体库的分析，其在选择粘合剂后可以构成从几个到几十个纳米体。在标准实验中，稳定的脂质单层组装在传感器芯片上。在应用含有胆碱转运蛋白的蛋白脂质体制剂后，进行良好的电导率和电容检查，因为这对于实验的成功至关重要。如果在实验过程中膜的完整性受到损害，由于高噪声背景电流很容易观察到，则建议改用新芯片，因为恢复低噪声条件相当困难。总的来说，当使用不同的芯片时，我们已经观察到纳米抗体的运输和抑制测量具有非常好的再现性。

为了确定在纳米抗体筛选期间要使用的底物浓度，首先在不同的底物浓度下测量电生转运以确定EC_50（图1B，C）。选择对应于饱和条件的底物浓度（图1C...

讨论

这里介绍的技术对具有抑制性和非抑制性特性的纳米抗体进行分类，以靶向电原转运蛋白。由于检测电荷通过嵌入在蛋白脂小体膜中的转运蛋白的运动，因此可以评估底物运输。在实验过程中，一些关键步骤是重建脂质体中的活性蛋白，在SSM芯片上制备稳定的单层，以及在应用洗涤方案以去除结合的纳米体分子后恢复初始条件。一旦膜蛋白以适当的脂蛋白比重构，就可以使用天然底物建立一般的SSM方案。使用无蛋白脂质体进行对照实验以揭示需要从使用蛋白脂质体测量的电流中减去的噪声电流至关重要。但是，如果噪声电流太大，我们建议尝试使用不同的脂质进行蛋白质复构，或筛选缓冲液条件以最大限度地减少这些有害信号。在成功为SSM测定建立条件后，可以进行纳米抗体的筛选。一个非常有用的选择，可能有助于更快地筛选纳米抗体，是使用单个SSM传感器芯片执行高通量测定。这减少了操作芯片和缓冲器的时间，并降低了成本。然而，由于在这种类型的测定过程中，多个纳米抗体依次被施用，因此重要的是要确保所施加的纳米体可以在测量后被洗掉。可能需要实施严格的洗涤循环来解开某些纳米体的束缚，以防在没有纳米体的情况下检测到降低的峰值电流幅度。我们建议使用此处描述的洗涤条件作为起点。如果增加洗涤量或循环次数没有帮助，则需要使...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-十八烷醇溶液	Sigma Aldrich	O1858-25ML
1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱	Avanti 极性脂质	850356C-25mg
Bio-Beads SM-2 吸附剂（聚苯乙烯吸附珠）	BioRad	#152-3920
PD 10 脱盐柱	GE Healthcare	GE17-0851-01
过滤器 200 nm 膜	Whatman Nucleopore	WHA800282
2-丙醇	Merck	33539-1L-R
n-Decane	Sigma Aldrich	8034051000
n-十二烷基-szlig;-D-麦芽糖苷 （DDM）	Avanti 极性脂质	850520P-25g
氯化钠	AppliChem	131659.1211
（SSM 设置） SURFE2R N1	Nanion	-----
SURFE2R N1 单传感器芯片	Nanion	# 161001
Trizma Base	Sigma Aldrich	T1503
大肠杆菌 极性脂质提取物	Avanti 极性脂质	100600C
蛋 PC L-&α;-磷脂酰胆碱	Avanti 极性脂质	840051C