纳米抗体是结构生物学中的重要工具，在治疗手段的开发中具有巨大潜力。然而，筛选具有抑制特性的纳米抗体可能具有挑战性。本文展示了基于固态支撑膜（SSM）的电生理学技术，用于对靶向电驱动膜转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体进行分类。
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本文内容
摘要
摘要
单域抗体（纳米抗体）已广泛应用于蛋白质的机制和结构研究，并在开发临床治疗手段方面展现出巨大潜力，其中许多应用依赖于对转运蛋白等膜蛋白的抑制。然而，目前用于测定转运活性抑制作用的大多数方法难以实现高通量操作，且依赖于标记底物的可获得性，从而限制了对大型纳米抗体文库的筛选。固相支撑膜（SSM）电生理学是一种高通量方法，可用于表征生电型转运蛋白并测定其转运动力学及抑制效应。本文展示了基于SSM的电生理技术在筛选靶向生电型次级转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体中的应用，并可用于计算纳米抗体的抑制常数。该技术在筛选靶向缺乏标记底物的转运蛋白的抑制性纳米抗体时尤其具有应用价值。
引言
抗体由两条相同的重链和两条轻链组成，其中轻链负责抗原结合。骆驼科动物具有仅含重链的抗体，其对相应抗原的亲和力与传统抗体相似1,2仅含重链抗体的单变量结构域（VHH）保留了完整的抗原结合能力，并已被证明具有很高的稳定性1,2这些分离的VHH分子或 "纳米抗体" 已应用于膜蛋白生物化学相关研究中，作为稳定构象的工具3,4，作为抑制剂5,6，作为稳定剂7，以及作为小工具用于 结构测定8,9,10纳米抗体可通过免疫骆驼科动物，富集编码靶标特异性纳米抗体的B细胞，随后分离B细胞，构建纳米抗体文库，并利用噬菌体展示技术进行筛选获得。11,
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方案
1. 膜蛋白的重建
- 在通风橱中，将 3 mL 大肠杆菌（E. coli）极性脂质与 1 mL 磷脂酰胆碱加入圆底烧瓶中混合。
- 使用旋转蒸发仪和 37 °C 水浴，在减压条件下干燥脂质混合物 20 分钟，以去除氯仿。如有需要，可在氮气或氩气氛围下进一步干燥。
- 使用含 2 mM β-巯基乙醇的 TS 缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl），将脂质重悬至浓度为 25 mg/mL。
- 将脂质分装为每份 500 µL，液氮中速冻后于 -80 °C 保存。
- 取出一份 500 µL 脂质分装样品，用含 2 mM β-巯基乙醇的 TS 缓冲液按 1:1 比例稀释。
- 使用 400 nm 孔径膜，将脂质悬浮液挤出 15 次。
- 稀释脂质悬浮液，使最终脂质浓度为 4.4 mg/mL。
- 加入正十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM），使其终浓度为 0.2%，并在室温（RT）下以 200 rpm 转速旋转孵育 1 小时。
- 按照脂质与蛋白质量比 1:10 至 1:100（w:w）的比例，将纯化的蛋白加入脂质中。
注意：该比例需根据 SSM 电生理测量中底物转运信号的强弱进行调整（见下文）。为获得更强信号，应使用较小的脂质与蛋白比例。 - 将混合物在室温下以 200 rpm 转速旋转孵育 1 小时。
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结果
基于固持化膜（SSM）的电生理学技术已被广泛用于电致转运蛋白的表征。在本方案中，我们展示了如何利用基于SSM的电生理学方法，根据纳米抗体对次级转运蛋白（此处为细菌胆碱同向转运蛋白）的抑制性或非抑制性特性，对其进行分类。该技术最有用的特点之一是能够对多种缓冲条件进行高通量筛选。这一特性对于纳米抗体文库的分析尤为有利，因为在筛选出结合子后，文库可能包含从数个到数十个不等的纳米抗体。在标准实验中，首先在传感器芯片上构建稳定的单层脂质膜。随后加入含有胆碱转运蛋白的蛋白脂质体，并检测良好的导电性和电容性，这对实验的成功至关重要。若实验过程中膜完整性受损（可通过背景电流噪声显著升高而轻易察觉），建议更换新的芯片，因为恢复低噪声状态较为困难。总体而言，我们在使用不同芯片进行转运及纳米抗体抑制效应的测量时，观察到了非常好的可重复性。
为了确定纳米抗体筛选过程中所用的底物浓度，首先在不同底物浓度下测量了电生运输以确定 EC50（图 1B、C）。选择一个对应于饱和条件的底物浓度（
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讨论
本文介绍的技术可用于对靶向生电型转运蛋白的抑制性和非抑制性纳米抗体进行分类。由于能够检测穿过蛋白脂质体膜中嵌入的转运蛋白的电荷移动，因此可以评估底物的转运情况。实验设置过程中的一些关键步骤包括：将活性蛋白重组到脂质体中、在固持单层膜（SSM）芯片上制备稳定的单分子层，以及在应用洗涤程序以去除结合的纳米抗体分子后恢复初始条件。一旦膜蛋白以适当的脂质-蛋白比例完成重组，即可使用天然底物建立通用的SSM实验方案。必须使用不含蛋白的脂质体进行对照实验，以识别需要从蛋白脂质体测得的电流中扣除的噪声电流。然而，如果噪声电流过大，建议尝试使用不同的脂质进行蛋白重组，或筛选能够最小化这些有害信号的缓冲条件。在成功建立SSM检测条件后，便可开展纳米抗体的筛选。一种有助于加快纳米抗体筛选速度的有效方法是使用单个SSM传感器芯片进行高通量检测。这种方法可减少芯片和缓冲液的操作时间，并降低实验成本。但是，由于在此类检测中需依次施加多种纳米抗体，因此必须确保每次测量后能够彻底洗脱已施加的纳米抗体。若在未添加纳米抗体的情况下检测到峰值电流幅度降低，则可能需要实施更严格的洗涤程序，以解离某些难以脱离的纳米抗体。我们建议以本文所述的洗涤条件作为起始点。如果增加洗涤体积.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢苏黎世大学医学微生物学研究所的 Cedric A. J. Hutter 和 Markus A. Seeger，以及巴塞尔大学生物中心的 Gonzalo Cebrero 在合成纳米抗体（sybodies）构建方面的合作。感谢 NANION Technologies 公司的 Maria Barthmes 和 Andre Bazzone 提供的技术支持。本研究得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）（项目编号 PP00P3_170607 以及授予 C.P. 的 NANION 研究资助计划）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-十八硫醇溶液 | Sigma Aldrich | O1858-25ML | |
| 1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | 850356C-25mg | |
| Bio-Beads SM-2 吸附剂（聚苯乙烯吸附珠） | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 脱盐柱 | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| 200 nm 滤膜 | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-丙醇 | Merck | 33539-1L-R | |
| 正癸烷 | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-十二烷基-ß-D-麦芽糖苷（DDM） | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| 氯化钠 | AppliChem | 131659.1211 | |
| （SSM 装置）SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 单传感器芯片 | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| 大肠杆菌极性脂质提取物 | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| 蛋磷脂酰胆碱 L-α-磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | 840051C |
参考文献
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al.
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重印与许可
