减少小鼠应激的处理技术

摘要

本文介绍了一种在小鼠中应用的操作技术——3D操作技术，该技术通过减少类似焦虑的行为来促进常规操作，并详细描述了两种现有的相关技术（隧道操作和尾部操作）。

摘要

实验动物会经历科学家或动物护理人员的多次操作。这些操作所引发的压力可能对 动物福利产生深远影响，同时也可能成为焦虑等实验变量的混杂因素。多年来，人们已开发出多种旨在减少操作相关压力的抓取技术，但这些研究主要集中在大鼠，对小鼠的关注较少。然而，已有研究表明，通过适当的抓取技术，可以使小鼠逐步适应人为操作。使小鼠习惯于被抓取能够减轻其压力，便于日常操作，改善动物福利，降低数据变异性，并提高实验的可靠性。尽管温和抓取具有诸多益处，但目前仍广泛使用特别容易引发应激的提尾抓取法。本文详细介绍并演示了一种新开发的小鼠抓取技术，旨在最大限度地减少动物在与人类互动过程中所经历的压力。该手动操作技术需持续3天（简称3D抓取技术），重点在于促进动物对实验人员的适应能力。本研究还比较了既往建立的隧道抓取技术（使用聚碳酸酯隧道）和提尾抓取技术的效果，具体评估了这些方法对类焦虑行为（通过高架十字迷宫和新奇抑制摄食行为学测试）、小鼠与实验人员的自发互动行为以及生理指标（皮质酮水平）的影响。结果显示，3D抓取技术和隧道抓取技术均可减少类焦虑表型。在第一项实验中，使用6月龄雄性小鼠，3D抓取技术显著改善了小鼠与实验人员的互动行为；在第二项实验中，使用2.5月龄雌性小鼠，该技术降低了皮质酮水平。因此，3D抓取技术适用于需要或倾向于与实验人员进行互动的实验场景，或在实验过程中无法使用隧道抓取的情况。

引言

小鼠和大鼠是多种目的临床前研究中的重要资源^1,2，包括内分泌、生理、药理或行为学研究²。随着涉及动物的研究数量不断增加，人们发现包括人类互动在内的未受控环境变量会影响生物医学研究的多种结果^3,4,5。这导致不同实验和研究实验室之间出现显著的变异性^4,5，成为动物研究中的一个主要隐患。

已采用多种方法以期限制环境应激源的影响并降低动物对人类互动的反应性。例如，为减少环境应激源的影响，可对饲养条件进行标准化，并采用自动化饲养系统。^6,7 已在各实验室中实施。在涉及与人类互动方面，常用的动物抓取和运输方法很少考虑动物的不适和应激反应。例如，通过尾巴抓取动物或使用镊子⁸ 增加基线焦虑水平^9,

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得 CAMH 动物护理委员会的批准，并按照加拿大动物护理委员会的指南进行。

注意：此处描述的操作方法适用于多种小鼠品系，包括非转基因品系（C57/BL6、BalbC、CD1、SV129等）和转基因品系。该方法也可用于幼龄或老龄小鼠，需注意的是，年轻成年小鼠（4–6周龄）通常比成年或老龄小鼠活动性略高，尤其在第1天更为明显。

1. 实验准备

1. 根据ARRIVE指南²¹，在研究开始前将小鼠随机分配至各处理组（3D处理法、隧道处理法或抓尾处理法）。
2. 确定进行处理的房间。可在饲养室或独立房间内进行。若在需通过运输车转移动物的独立房间进行操作，应在开始处理程序前让动物在新环境中适应20-30分钟。
3. 对于群养动物，在处理后、重新放回原始饲养笼之前，应使用临时笼具暂养小鼠。此举可减少处理前动物间发生争斗的风险（尤其在雄性小鼠中）。
4. 应在操作台面（建议为清理干净的台面）或生物安全柜内进行操作，且将饲养笼置于远离正在处理动物的位置。靠近饲养笼会增加动物跳跃的风险。若动物为群养，正在被处理的小鼠跳入主笼可能对同笼伙伴造成应激。
   ​注意：在生物安全柜内操作可降低小鼠跳落到地面的风险，且某些设施可能对此有强制要求。本技术可在生物安全柜内使用，但须确保所有步骤均在柜....

结果

分别对C57BL/6小鼠开展了两项独立研究。研究#1包括来自杰克逊实验室（货号：000664）的6月龄雄性小鼠，研究#2包括同来源的2.5月龄雌性小鼠（每项研究N=36）。小鼠在2月龄时抵达实验动物设施。研究#2的雌性小鼠在到达后两周即开始进行操作与测试，而研究#1的雄性小鼠由于全球大流行导致的实验室关闭，延迟至6月龄时才开始操作与测试。在此期间，研究#2中有一只小鼠在开始操作实验前死亡。研究#1的雄性小鼠由动物设施工作人员负责饲养。所有小鼠均维持在12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间：7:00，关闭时间：19:00）条件下，自由获取食物和水 随意摄取它们的笼舍中填充了再生报纸作为垫料，同时也用作筑巢材料。小鼠被单独饲养，以限制群养雄性在操作过程或采血、行为学测试等实验操作后可能出现的攻击性行为。小鼠被随机分为三组： 尾部抓取，隧道式抓取 和 3D操作，并根据各自分组的设计在开放房间内进行处理（图2）。隧道管养组在开始抓取操作前1周先接触隧道作为环境丰容。随后，在行为学测试前连续10天进行抓取操作。不同抓取操作结束后.......

讨论

本研究及方法开发基于以下观察：小鼠的操作技术目前仍被科学界忽视，一些实验室仍不愿意在实验前采用适应性训练或操作技术来降低动物的应激反应和过度敏感性。尽管动物操作需要投入一定时间，但它对动物具有积极影响，有助于提高后续实验的成功率，并避免因数据变异性或动物过度反应而导致实验需重复进行。采用3D操作技术可减少小鼠的逃脱尝试。在我们6月龄的雄性小鼠中，该技术还增加了其与实验人员的互动，并减少了类似焦虑的行为表型。此外，在仅经过最初3天的操作后，3D操作技术即可降低2.5月龄雌性小鼠的数据变异性及其皮质酮水平。该方法依赖于轻柔的操作方式，使小鼠逐步适应实验人员的接触，从而实现更顺畅的转移和更便捷的干预操作。

从三维操作技术中值得强调的一点是，操作方法的逐步推进应根据小鼠的反应性而定，具体取决于上述内容及表1中所述各阶段目标的达成情况。动物在进入下一步操作之前，应已对当前操作步骤表现出较低的反应性。若对尚未充分适应的小鼠过早推进至"遮蔽"或"鼻触"步骤，可能会导致应激反应增加，进而降低该操作程序的有效性。同样，在每次操作过程中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
23 G x 1 英寸 BD PrecisionGlide 普通用途无菌皮下注射针头。普通管壁类型和普通斜面。	BD	2546-CABD305145	用于血液采集的针头
BD Vacutainer® 静脉血采集 EDTA 管，带紫色 BD Hemogard™ 盖，2.0 ml（13 x 75 mm），每包 100 支	BD	367841	用于血液采集的 EDTA 涂层管
Bed’o cobs ¼” 玉米芯实验室动物垫料	Bed-O-Cobs	BEDO1/4	用于新奇抑制摄食实验的新型垫料
离心机	Eppendorf	Centrifuge 5424 R	用于血液离心
皮质酮 ELISA 试剂盒	Arbor Assays	K003-H1W
数码相机	Panasonic	HC-V770	用于记录高架十字迷宫/实验者交互行为
高架十字迷宫	自制	n/a	定制迷宫，由四个黑色聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）臂组成（两个开放臂（29 cm 长 × 7 cm 宽）和两个封闭臂（29 cm 长 × 7 cm 宽，带 16 cm 高侧壁）），呈十字形排列，两个开放臂相对，整体离地 55 cm
乙醇	Medstore 自有品牌	39753-P016-EA95	用蒸馏水稀释至 70%，用于清洁
Ethovision XT 15	Noldus	n/a	自动化动物追踪软件
实验室啮齿动物饲料	LabDiet	啮齿动物饲料 5001	标准啮齿动物饲料
存储卡	Kingston Technology	SDA3/64GB	用于视频录制和文件传输
新奇抑制摄食实验箱	自制	n/a	定制透明聚甲基丙烯酸甲酯实验箱，底部和侧壁透明，尺寸为长 62 cm、宽 31 cm、高 40 cm
聚碳酸酯管	自制	n/a	长 13 cm，直径 5 cm
Purina Yesterday’s News 再生纸屑垫料	Purina	n/a	标准垫料
分光光度计	Biotek	Epoch 微孔板读板仪