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减少小鼠应激的处理技术

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DOI：

10.3791/62593

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2021年9月25日

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1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

本文内容

摘要

本文介绍了一种在小鼠中应用的操作技术——3D操作技术，该技术通过减少类似焦虑的行为来促进常规操作，并详细描述了两种现有的相关技术（隧道操作和尾部操作）。

摘要

实验动物会经历科学家或动物护理人员的多次操作。这些操作所引发的压力可能对 动物福利产生深远影响，同时也可能成为焦虑等实验变量的混杂因素。多年来，人们已开发出多种旨在减少操作相关压力的抓取技术，但这些研究主要集中在大鼠，对小鼠的关注较少。然而，已有研究表明，通过适当的抓取技术，可以使小鼠逐步适应人为操作。使小鼠习惯于被抓取能够减轻其压力，便于日常操作，改善动物福利，降低数据变异性，并提高实验的可靠性。尽管温和抓取具有诸多益处，但目前仍广泛使用特别容易引发应激的提尾抓取法。本文详细介绍并演示了一种新开发的小鼠抓取技术，旨在最大限度地减少动物在与人类互动过程中所经历的压力。该手动操作技术需持续3天（简称3D抓取技术），重点在于促进动物对实验人员的适应能力。本研究还比较了既往建立的隧道抓取技术（使用聚碳酸酯隧道）和提尾抓取技术的效果，具体评估了这些方法对类焦虑行为（通过高架十字迷宫和新奇抑制摄食行为学测试）、小鼠与实验人员的自发互动行为以及生理指标（皮质酮水平）的影响。结果显示，3D抓取技术和隧道抓取技术均可减少类焦虑表型。在第一项实验中，使用6月龄雄性小鼠，3D抓取技术显著改善了小鼠与实验人员的互动行为；在第二项实验中，使用2.5月龄雌性小鼠，该技术降低了皮质酮水平。因此，3D抓取技术适用于需要或倾向于与实验人员进行互动的实验场景，或在实验过程中无法使用隧道抓取的情况。

引言

小鼠和大鼠是多种目的临床前研究中的重要资源1,2，包括内分泌、生理、药理或行为学研究2。随着涉及动物的研究数量不断增加，人们发现包括人类互动在内的未受控环境变量会影响生物医学研究的多种结果3,4,5。这导致不同实验和研究实验室之间出现显著的变异性4,5，成为动物研究中的一个主要隐患。

已采用多种方法以期限制环境应激源的影响并降低动物对人类互动的反应性。例如，为减少环境应激源的影响，可对饲养条件进行标准化，并采用自动化饲养系统。6,7 已在各实验室中实施。在涉及与人类互动方面，常用的动物抓取和运输方法很少考虑动物的不适和应激反应。例如，通过尾巴抓取动物或使用镊子8 增加基线焦虑水平9,10,11，减少探索行为9,12 并对研究内部及研究之间的个体间差异具有重要影响13,14因此，其他方法被相继开发出来，例如 杯具操作 技术，适用于小鼠和大鼠。在此方法中，动物被 "凹陷的" 从笼子中取出，并由实验人员用手掌呈杯状握住9,10,11另一种有用的替代尾部抓取的方法是使用聚碳酸酯隧道来转移小鼠9,10,15该方法避免了小鼠与实验人员之间的直接接触。杯式和隧道式操作方法均能有效减少焦虑样行为以及因厌恶性抓取技术（如抓尾法）可能加剧的对实验人员的恐惧。9,10.

因此，越来越多的证据表明，正确的实验小鼠操作方法有助于减少个体间的差异性9,11，并改善动物福利10。然而，上述技术仍存在一定的局限性。杯式操作法的实施周期从10天（2周内进行10次操作16）到长达15周不等17，这对于动物设施工作人员和实验人员而言耗时较长。此外，杯式操作的效果因品系而异9，且在开放手掌中进行常规杯式操作时，未经训练的小鼠或特别易跳跃的品系可能会从小鼠手中跳脱9,18。相比之下，隧道操作法在温和驯化方面通常能获得更一致且更快的效果19。隧道还可作为笼内环境丰富化装置，有助于动物快速适应操作，并提供额外的丰富化益处。然而，隧道操作在将动物转移至不同实验装置时存在一定限制。有趣的是，Hurst 和 West9 以及 Henderson 等人20 证明，采用轻柔且短暂的手动操作将动物从隧道转移至实验装置，不会影响其表型。

为了提供一种可在较短时间内实现有效适应的替代方法，本文介绍了一种基于杯式抓握技术的创新方法，因此无需使用特殊设备。该方法通过设定关键阶段来评估小鼠对抓握操作的适应程度。该技术在降低小鼠应激反应和压力（包括行为学和激素水平）方面具有显著效果，有助于日常操作，并有助于减少个体间的差异。本文详细阐述了该技术的具体操作步骤，并通过两项独立研究（针对雄性和雌性小鼠）证明了其在减少焦虑样行为、改善与实验人员互动以及抑制外周应激激素（皮质酮）释放方面的有效性，同时与隧道抓握法（阳性对照）和尾部抓握法（阴性对照）进行了比较。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得 CAMH 动物护理委员会的批准，并按照加拿大动物护理委员会的指南进行。

注意：此处描述的操作方法适用于多种小鼠品系，包括非转基因品系（C57/BL6、BalbC、CD1、SV129等）和转基因品系。该方法也可用于幼龄或老龄小鼠，需注意的是，年轻成年小鼠（4–6周龄）通常比成年或老龄小鼠活动性略高，尤其在第1天更为明显。

1. 实验准备

  1. 根据ARRIVE指南21，在研究开始前将小鼠随机分配至各处理组（3D处理法、隧道处理法或抓尾处理法）。
  2. 确定进行处理的房间。可在饲养室或独立房间内进行。若在需通过运输车转移动物的独立房间进行操作，应在开始处理程序前让动物在新环境中适应20-30分钟。
  3. 对于群养动物，在处理后、重新放回原始饲养笼之前，应使用临时笼具暂养小鼠。此举可减少处理前动物间发生争斗的风险（尤其在雄性小鼠中）。
  4. 应在操作台面（建议为清理干净的台面）或生物安全柜内进行操作，且将饲养笼置于远离正在处理动物的位置。靠近饲养笼会增加动物跳跃的风险。若动物为群养，正在被处理的小鼠跳入主笼可能对同笼伙伴造成应激。
    ​注意：在生物安全柜内操作可降低小鼠跳落到地面的风险，且某些设施可能对此有强制要求。本技术可在生物安全柜内使用，但须确保所有步骤均在柜内完成，并避免小鼠在操作者前臂上行走。

第2天：每只小鼠5分钟

  1. 轻轻打开笼子，将笼盖放在一侧，移除垫料及其他丰富化物品（如跑轮或遮蔽物）。
  2. 将戴着手套的开放手掌引入动物的家笼中，缓慢地将手沿笼壁一侧放置（靠近操作者的一侧，图1A）。
    1. 不要立即尝试抓起小鼠。
  3. 保持静止不动，让动物适应手在笼内的存在，持续约30秒。
  4. 尝试用手掌抓起小鼠（即避免通过尾巴抓取动物）。
    1. 若经过3次尝试后仍无法轻松抓起小鼠，可引导小鼠至笼角，并用双手合拢的方式将其围住。
    2. 轻轻移动合拢的双手靠近小鼠，尝试将其抓起。
    3. 若使用双手最多尝试3次仍未成功，则轻柔地抓住小鼠尾根部，将其转移至前臂或平展的手掌上。
  5. 当小鼠在手中时，尽量保持手掌平坦且张开。
    注：这为小鼠提供了一个可踏足的平坦平台，并降低被咬伤的风险。
  6. 保持手掌向上、张开且平坦，将另一只手置于握有小鼠的手旁，允许小鼠在双手之间自由移动而不受限制（图1B）。
  7. 让小鼠在双手之间探索并自由移动1分钟。
    1. 此时小鼠可能试图跳离。应调整双手位置，确保即使小鼠跳下，也会落在实验台面上而非地面。
    2. 若观察到小鼠准备跳跃（如向手边缘移动并以后肢直立），应缓慢将另一只手置于其前方，尝试引导其走入该手中。避免突然动作，以免增加其跳跃风险。
    3. 若小鼠确实跳下，应尝试在不抓尾的情况下重新抓起，并继续操作过程。若小鼠停留在地面或脱离双手超过10秒，应在操作过程中额外延长时间，以弥补其脱离双手的时间。
    4. 记录跳跃情况。总跳跃次数可用于评估个体间潜在的变异性。
  8. 经过1分钟的平展手掌操作后，放松手掌，轻微合拢将小鼠包裹在手中，随后轻柔地在双手之间翻转小鼠（图1C）。
    1. 进行“翻转”操作时，将小鼠置于手掌中，手掌平展，小鼠身体方向与手指垂直。
    2. 缓慢合拢手掌，将手指轻放在小鼠背部。
    3. 将空闲的手直接置于握有小鼠的手下方。
    4. 缓慢翻转/旋转握有小鼠的手，轻柔地将小鼠转移至另一只手（完成180°翻转）。
    5. 在双手之间重复此来回翻转动作。
  9. 交替进行双手间轻柔翻转与在张开手掌上的自由探索，持续60秒，每种技术交替约每20秒一次。
  10. 执行“遮蔽测试”（图1D）。
    1. 让小鼠移动至手边缘，然后将两只手靠拢。
    2. 非常缓慢地合拢双手，使小鼠处于由双手形成的“遮蔽”空间内。需留出开口，以便小鼠在需要时可自行逃脱。
    3. 目标是让小鼠在无约束状态下停留在遮蔽空间内5–10秒。
    4. 在遮蔽测试、双手间翻转及张开手掌上的自由探索之间交替进行，再持续60秒，并确保遮蔽步骤至少执行3次。
  11. 在2.10所述的所有操作中，不得急于求成。若小鼠表现出应激迹象（如试图逃离、从手中跳下、回避与手接触等），应继续进行双手间翻转和自由探索20秒后，再重新尝试。
  12. 关键节点：完成第1天操作前，至少成功执行一次持续10秒的遮蔽测试。
    1. 当小鼠停留在手中时，视为遮蔽测试成功。若小鼠探出头部后又返回遮蔽空间内，仍视为成功。若动物完全脱离遮蔽空间，则视为失败。
  13. 允许小鼠在手中自由探索30秒。
  14. 轻柔地将小鼠放回其笼中。若为群养，应先将小鼠暂时放入临时笼中，待同笼所有个体均完成操作后再一并返回原笼。返回时应用手掌抓取小鼠，不得使用抓尾方式。
  15. 使用70%乙醇清洁实验台面上可能残留的粪便和尿液。
  16. 用70%乙醇（或适当的清洁液）彻底冲洗手套，或在处理下一只小鼠前更换手套（同笼个体可继续使用同一副手套）。
    ​注：建议每次操作适量动物，以避免操作者疲劳。处理24只小鼠约需2小时，建议单人操作不超过24只。若需处理更多动物，建议安排多名操作者，或将操作分批在多个日期完成。

第2天：每只小鼠3至5分钟

  1. 尝试用手掌拾起小鼠。在此阶段，应已能够顺利操作，且小鼠不应从手中跳脱。
  2. 开始时手掌张开，如第1天所示，允许小鼠自由探索20秒。
  3. 然后在双手之间来回滚动小鼠数次（4-5次）。
  4. 进行“遮蔽测试”5秒。
  5. 在2至3分钟内重复该遮蔽测试约5-6次。
  6. 在同一2至3分钟期间，交替进行双手间滚动操作与第1天的张开手掌自由探索步骤，以增强习惯化效果。
    1. 触碰小鼠头部和背部（图1E），5-6次。习惯化的表现是小鼠允许触碰而不试图逃脱。
    2. 进行“鼻部触探”：尝试触碰小鼠鼻部2至3次（图1F）。
      1. 如果小鼠试图咬人或在被触碰时表现出明显应激迹象，不应立即再次尝试鼻部触探，而应交替进行手掌自由探索和双手间滚动操作。“习惯化”表现为动物在与人接触时不逃跑或不转头回避。
  7. 在3.4-3.6所述的所有操作中，切勿急于求成。若小鼠在被手包裹时表现出应激，或不愿被触碰，可继续进行双手间滚动20-30秒，再尝试上述操作。
  8. 里程碑：完成第2天操作需至少成功完成一次持续2-3秒的鼻部触探。
  9. 若动物对“遮蔽测试”、“头部抚摸”和“鼻部触探”反应良好，且表现出愿意在无应激迹象的情况下探索手掌，则处理约3分钟后可结束本次操作。
  10. 若小鼠仍持续表现出应激迹象，或对“遮蔽测试”或“鼻部触探”反应不佳，则应将操作延长至5分钟，如第1天所示。
  11. 将小鼠放回其笼中，并如第1天所示清洁实验台面和手套。

第4天：每只小鼠约3分钟

  1. 第三天，按照第二天的相同步骤进行操作，持续2至3分钟。
    1. 用手掌抓起小鼠。
    2. 在双手之间转移并轻轻滚动小鼠。
    3. 进行躲避测试。
    4. 尝试抚摸小鼠的背部和头部。
  2. 在约1至2分钟内交替执行上述步骤。
  3. 持续操作，直到小鼠足够放松，能够安静地停留在手掌中而不试图逃脱。
  4. 在第三天结束前，重复进行躲避测试和鼻触测试，以评估习惯化效果。
    1. 如果两项测试在首次尝试时即可顺利完成，则表明习惯化过程已完成。随后继续轻柔地抓握小鼠30秒至1分钟。
    2. 如果小鼠最初对任一测试表现出抗拒，应在重新尝试鼻触测试和躲避测试前，重复步骤4.1–4.3，持续20–30秒。
    3. 如果小鼠在3分钟后仍对这些测试表现出持续抗拒，可重复第三天的操作。
  5. 关键节点：完成第三天及整个3D抓握操作程序的标准为，至少成功完成两次持续10秒的躲避测试和两次成功的鼻触测试。
  6. 将小鼠放回笼中，清洁实验台面和手套。

5. 适用于需进行固定以实施注射或灌胃的动物的可选方法

注意：在第3天，如果动物因实验目的需要被固定（如灌胃、腹腔注射等），可对小鼠进行颈背部捏握测试。

  1. 用拇指和食指捏住小鼠颈背部（图 1G）。
  2. 将小鼠提起至手上方 3–5 cm 处，持续 2–3 秒。
    注意：这对成年小鼠而言通常是一种非自然姿势；若小鼠保持几乎不动，说明其已良好适应抓握操作，便于后续实验中的固定操作。
  3. 将小鼠放回手掌平面；若小鼠对颈背部夹捏有反应，可考虑将其置于实验者袖口、笼盖或台面上
    注意：若在生物安全柜内操作，不应将小鼠放在袖口上，以防其爬行并逃出生物安全柜。建议将小鼠放置在生物安全柜内的台面上。
  4. 让小鼠在实验者手上自由探索 1 分钟。

6. 额外处理天数的可选方法

  1. 对于应激反应较强的转基因小鼠品系，可额外增加天数，采用第2/3天所述方法进一步降低动物的应激反应性和应激水平。
    ​注意：多种因素可能影响动物的基础应激水平，包括品系、是否携带转基因修饰、年龄、性别及饲养条件。若实验组之间这些因素不一致（例如老年动物与年轻对照组比较，或转基因动物与野生型对照组比较），建议各组采用相同的习惯化天数。

7. 隧道法抓取

注意：该技术仅适用于使用隧道法抓取的小鼠。隧道为长约13 cm、直径约5 cm的聚碳酸酯管。

  1. 将隧道装置放入小鼠的笼子中。
  2. 在开始抓取操作前，将隧道装置置于笼内 7 天。
  3. 打开笼盖，并将其放置在旁边。
  4. 轻柔地引导小鼠进入笼内已有的聚碳酸酯隧道中。
  5. 水平地将隧道从笼中提起。如有必要，可松松地遮盖隧道两端，以防止动物跳出或滑出隧道，避免其可能掉回笼内或落在地面上。
  6. 将装有动物的隧道移离家园笼，并使其远离任何表面，保持 30 秒。
  7. 将隧道放回家园笼中，允许小鼠自行离开隧道。
  8. 等待 60 秒，然后重复步骤 7.4–7.7 一次。
  9. 在对下一只小鼠进行驯化前，需用 70% 乙醇彻底冲洗手套或更换新手套。
  10. 连续 10 天重复此操作程序。

8. 尾部抓取法

注意：该技术仅适用于尾部抓取的小鼠。用于将小鼠从笼子转移到实验装置，或反向转移。

  1. 打开笼子，将笼盖放在一侧。
  2. 用拇指和食指捏住小鼠尾巴根部。
  3. 将小鼠从笼中提起。
  4. 在2-3秒内，保持对尾巴的抓握，将小鼠转移到实验者的对侧前臂，以避免小鼠悬空。
  5. 当实验操作中需要使用抓尾法（例如，在进行皮质醇检测采血前），应通过抓尾法将动物转移到实验者前臂，并保持15秒后再放回笼中。

9. 高架十字迷宫

  1. 实验房间设置
    1. 将迷宫置于房间中央，正上方放置配备存储卡的数码相机。
    2. 使用放置在迷宫后方的两盏立式灯，将房间光照强度调节至约 60 勒克斯（Lux）。
    3. 关闭所有顶灯，以避免光线直射迷宫表面产生反光，干扰对动物在迷宫中位置的检测。
    4. 所有设备设置完毕后，将动物转移至房间内，使其适应光照条件和新环境 30 分钟。
  2. 测试过程
    1. 使用 70% 乙醇清洁迷宫，以消除灰尘或先前测试动物留下的气味干扰。
    2. 启动相机开始录像。
    3. 在将动物放入迷宫前，使用带有动物编号的纸张在视频中记录其编号（这有助于准确识别每段视频中对应的实验小鼠）。
    4. 采用适合每只动物的抓取方法，将其转移至迷宫中。
    5. 将小鼠放置于迷宫中央平台，使其面朝开放臂。
    6. 让小鼠在装置中自由探索 10 分钟，期间不加干扰。
    7. 10 分钟后，停止录像。
    8. 从迷宫中取出小鼠，并将其放回笼中。
    9. 使用 70% 乙醇清除迷宫中的粪便和尿液残留。
    10. 所有小鼠测试完成后，将存储卡中的视频转移至计算机，用于后续视频追踪分析。
    11. 使用自动化动物行为追踪软件，记录进入开放臂和闭合臂的次数，以及在开放臂和闭合臂中停留的时间（本实验使用 Ethovision XT 14）。

10. 实验人员互动（源自 Hurst 和 West9）

  1. 实验环境设置
    1. 在测试房间中央放置一张桌子，桌子上方安装一台配备存储卡的数码相机。
    2. 使用4个位于房间角落、灯头朝向天花板的灯泡，将光照强度调节至50–70勒克斯（Lux）。关闭顶灯照明，以避免光线直接照射到迷宫产生反光，干扰对实验动物在实验区域内的检测。
    3. 将动物带入房间。
    4. 让动物在房间内适应环境30分钟。
  2. 实验操作
    1. 将动物的家鼠笼放置在数码相机正下方。
    2. 打开笼盖。
    3. 移除垫料及其他可能干扰动物追踪的丰富化物品。
    4. 启动相机。
    5. 使用带有动物编号的笼卡，在视频中识别该动物。
    6. 将一只手沿着鼠笼前右侧的笼壁伸入家鼠笼内。
      1. 确保操作者头部不会遮挡相机对小鼠的拍摄。
    7. 启动计时器。
    8. 保持手部静止2分钟，让小鼠自由探索手部。
    9. 将手从鼠笼中移出15秒。
    10. 尝试用合拢的双手抓取小鼠，并记录小鼠是否逃跑。
    11. 重复上一步骤最多五次，每次间隔5秒，或直至小鼠允许被抓取为止。
    12. 记录成功抓取小鼠所需的尝试次数。
    13. 将垫料和丰富化物品重新放回鼠笼。
    14. 在进行下一只动物实验前，使用70%乙醇清洁手套或更换新手套。
    15. 实验结束后，将存储卡中的视频转移至计算机。
    16. 使用自动化视频追踪软件，将鼠笼划分为四个相等的象限，并记录小鼠在每个象限中停留的时间（此处使用 Ethovision XT 14）。

11. 新奇抑制摄食

  1. 食物剥夺
    1. 测试前3天，进行完整的换笼操作，并将动物单只饲养（单只饲养更有利于进行笼内测试）。
      注意：更换新鲜垫料可清除自上次换笼以来积聚在垫料中的潜在粉尘或细小食物残渣。
    2. 测试前一天，于下午6点左右称量所有动物的体重。
    3. 从饲料盒中移除所有食物，并确保笼内及垫料中无任何食物残渣。
  2. 房间设置
    1. 将NSF实验箱放置在桌面上。
    2. 在实验箱中铺上一层薄薄的玉米芯垫料（或其他与动物饲养笼内所用垫料不同的垫料）。
    3. 将4个灯泡放置在放置实验箱的桌子角落，灯泡朝上对准天花板，调节光照至70勒克斯。关闭顶灯以保持室内低照度环境。
    4. 将一粒该实验机构常用的标准化饲料颗粒放置于实验箱靠近实验操作者的一侧（≈距墙壁10 cm
  3. 测试
    1. 在禁食后的早晨，于测试前30分钟将动物带入实验房间，使其适应光照条件和新环境。
    2. 称重所有动物，根据前一天测得的体重计算其体重减轻情况。动物应隔夜减重8-12%，以确保能够正常执行任务。
    3. 按体重减轻程度对动物进行排序，并从体重减轻最多的个体开始，至体重减轻最少的个体结束，依次进行筛选。
    4. 确保笼盒内铺有垫料，并放入一粒食物颗粒。
    5. 将动物放置在远离食物颗粒的笼箱对侧。
    6. 立即启动计时器。
    7. 让小鼠在箱内探索最多12分钟。
    8. 测量动物接近并啃食（动物必须咬食并进食）食物颗粒的潜伏期。
      1. 当动物靠近颗粒、嗅闻但不啃咬时，应将其视为一种处理方法。
      2. 将“啃食”定义为动物开始消耗颗粒饲料的行为。
    9. 记录小鼠接近并进食颗粒饲料的潜伏期（单位：秒）。
    10. 小鼠进食完食物颗粒后，将其从实验舱中移出。
    11. 丢弃垫料，但保留将用于在小鼠家笼中测试食欲驱动的颗粒饲料。
    12. 为下一只动物重置实验箱，并继续测试下一只动物。
    13. 测试结束后15分钟，将测试中使用过的颗粒饲料轻轻放入小鼠的饲养笼内，并将其置于笼子前壁的笼壁处。
    14. 测量小鼠在饲养笼中开始摄食颗粒饲料的潜伏期，以此评估食欲驱动力。
      1. 最好移除垫料，以确保小鼠能看到食丸被放入笼中。

12. 血清采集与皮质酮测定

  1. 使用指定技术对动物进行1分钟操作，持续15分钟 在采血前（此操作可对群养或单养动物进行，但需注意重新分组小鼠时可能发生争斗的风险）。
    1. 对于使用隧道法处理的小鼠，引导其进入隧道，将隧道从笼中提起1分钟，然后将小鼠放回 cage。
    2. 对于尾部抓取处理的小鼠，抓住小鼠尾根部，将其从笼中取出。将小鼠转移到实验者袖口处保持1分钟，然后通过尾部抓取方式将其放回笼中。
    3. 对于采用3D法处理的小鼠，用手掌拢成杯状将其从笼中取出。将小鼠置于杯状手掌中保持1分钟，然后将其放回笼中。
  2. 15 分钟 处理后，从下颌静脉采血22.
  3. 牢固地捏住小鼠的颈背部皮肤，使小鼠头部被稳定固定。
  4. 确定穿刺部位。
    1. 面部下颌处有一个小的无毛凹陷，可作为定位穿刺点的解剖标志。从下颌底部到该凹陷画一条线，穿刺点位于该凹陷后方约5 mm处，靠近耳朵方向，恰好在下颌关节后方。
  5. 将一根洁净的23 G针头垂直置于穿刺部位，快速而有力地进行刺入。针尖应刺入1-2 mm深度，一旦刺破静脉，血液将立即流出。
  6. 收集约150 µ在EDTA包被的采血管中采集血液并置于冰上保存。
  7. 用无菌纱布垫对穿刺部位施加轻微压力，持续5秒或更长时间，以使血液凝固。
  8. 血液凝固后，将小鼠放回其原代饲养笼中。
  9. 4 ℃下离心血液 °3,500 × g 离心 10 分钟
  10. 弃去上清液。
  11. 将上清液在 -20 ℃ 保存 °C 用于后续分析。
  12. 使用皮质酮ELISA试剂盒，按照制造商说明书测定皮质酮水平。
  13. 使用分光光度计读取ELISA结果。

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结果

分别对C57BL/6小鼠开展了两项独立研究。研究#1包括来自杰克逊实验室（货号：000664）的6月龄雄性小鼠，研究#2包括同来源的2.5月龄雌性小鼠（每项研究N=36）。小鼠在2月龄时抵达实验动物设施。研究#2的雌性小鼠在到达后两周即开始进行操作与测试，而研究#1的雄性小鼠由于全球大流行导致的实验室关闭，延迟至6月龄时才开始操作与测试。在此期间，研究#2中有一只小鼠在开始操作实验前死亡。研究#1的雄性小鼠由动物设施工作人员负责饲养。所有小鼠均维持在12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间：7:00，关闭时间：19:00）条件下，自由获取食物和水 随意摄取它们的笼舍中填充了再生报纸作为垫料，同时也用作筑巢材料。小鼠被单独饲养，以限制群养雄性在操作过程或采血、行为学测试等实验操作后可能出现的攻击性行为。小鼠被随机分为三组： 尾部抓取，隧道式抓取 和 3D操作，并根据各自分组的设计在开放房间内进行处理（图2）。隧道管养组在开始抓取操作前1周先接触隧道作为环境丰容。随后，在行为学测试前连续10天进行抓取操作。不同抓取操作结束后...

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讨论

本研究及方法开发基于以下观察：小鼠的操作技术目前仍被科学界忽视，一些实验室仍不愿意在实验前采用适应性训练或操作技术来降低动物的应激反应和过度敏感性。尽管动物操作需要投入一定时间，但它对动物具有积极影响，有助于提高后续实验的成功率，并避免因数据变异性或动物过度反应而导致实验需重复进行。采用3D操作技术可减少小鼠的逃脱尝试。在我们6月龄的雄性小鼠中，该技术还增加了其与实验人员的互动，并减少了类似焦虑的行为表型。此外，在仅经过最初3天的操作后，3D操作技术即可降低2.5月龄雌性小鼠的数据变异性及其皮质酮水平。该方法依赖于轻柔的操作方式，使小鼠逐步适应实验人员的接触，从而实现更顺畅的转移和更便捷的干预操作。

从三维操作技术中值得强调的一点是，操作方法的逐步推进应根据小鼠的反应性而定，具体取决于上述内容及表1中所述各阶段目标的达成情况。动物在进入下一步操作之前，应已对当前操作步骤表现出较低的反应性。若对尚未充分适应的小鼠过早推进至"遮蔽"或"鼻触"步骤，可能会导致应激反应增加，进而降低该操作程序的有效性。同样，在每次操作过程中...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢CAMH动物护理委员会对本工作的支持，以及CAMH的动物护理人员，他们就该操作的实用性提供了大量反馈意见，推动了所述实验的实施，并促使本详细方案提交供其他用户使用。本工作部分由授予TP的CAMH BreakThrough挑战基金以及CAMH的内部资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
23 G x 1 英寸 BD PrecisionGlide 普通用途无菌皮下注射针头。普通管壁类型和普通斜面。BD2546-CABD305145用于血液采集的针头
BD Vacutainer® 静脉血采集 EDTA 管，带紫色 BD Hemogard™ 盖，2.0 ml（13 x 75 mm），每包 100 支BD367841用于血液采集的 EDTA 涂层管
Bed’o cobs ¼” 玉米芯实验室动物垫料Bed-O-CobsBEDO1/4用于新奇抑制摄食实验的新型垫料
离心机EppendorfCentrifuge 5424 R用于血液离心
皮质酮 ELISA 试剂盒Arbor AssaysK003-H1W
数码相机PanasonicHC-V770用于记录高架十字迷宫/实验者交互行为
高架十字迷宫自制n/a定制迷宫，由四个黑色聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）臂组成（两个开放臂（29 cm 长 × 7 cm 宽）和两个封闭臂（29 cm 长 × 7 cm 宽，带 16 cm 高侧壁）），呈十字形排列，两个开放臂相对，整体离地 55 cm
乙醇Medstore 自有品牌39753-P016-EA95用蒸馏水稀释至 70%，用于清洁
Ethovision XT 15Noldusn/a自动化动物追踪软件
实验室啮齿动物饲料LabDiet啮齿动物饲料 5001标准啮齿动物饲料
存储卡Kingston TechnologySDA3/64GB用于视频录制和文件传输
新奇抑制摄食实验箱自制n/a定制透明聚甲基丙烯酸甲酯实验箱，底部和侧壁透明，尺寸为长 62 cm、宽 31 cm、高 40 cm
聚碳酸酯管自制n/a长 13 cm，直径 5 cm
Purina Yesterday’s News 再生纸屑垫料Purinan/a标准垫料
分光光度计BiotekEpoch 微孔板读板仪

参考文献

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936(2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26(2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751(2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305(2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075(2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281(2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718(2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401(2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454(2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410(2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649(2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

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