使用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化和偶联可溶性多糖

摘要

含有氨基的蛋白质和配体可通过氰化试剂1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化的多糖共价连接，形成共价的蛋白质（配体）-多糖偶联物。本文介绍了一种改进的实验方案，可在0 °C及不同pH条件下实现对CDAP活化过程的精确控制，并对活化后的多糖进行后续偶联反应。

摘要

结合疫苗是疫苗学领域的重大进步。在制备多糖结合疫苗时，可使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）这一易于操作的氰基化试剂，方便地对多糖进行功能化修饰，并将其连接至疫苗载体蛋白。CDAP在pH 7–9条件下与多糖的碳水化合物羟基反应，从而活化多糖。CDAP的稳定性和反应活性高度依赖于pH值。由于CDAP在活化过程中发生水解，反应体系的pH会随之下降，因此良好的pH控制是实现可重复活化的关键。最初的CDAP活化方案是在室温下、未缓冲的pH 9溶液中进行的。

由于在此条件下反应迅速（<3 分钟），且伴随CDAP快速水解导致pH迅速下降，因此在短时间内快速调节并维持目标反应pH具有挑战性。本文所述的改进方案在0 °C下进行，可减缓CDAP的水解，使活化时间从3分钟延长至约15分钟。此外，使用二甲基氨基吡啶（DMAP）作为缓冲剂，在加入CDAP试剂前预先将多糖溶液调节至目标活化pH。更长的反应时间，结合较慢的CDAP水解速率以及DMAP缓冲体系的使用，使得在整个活化过程中更容易维持活化pH。该改进方案使活化过程更为平稳、可重复性更高，并更易于放大操作。

引言

结合疫苗，例如由多糖共价连接至载体蛋白构成的疫苗，是疫苗学领域的重要进展之一^1,2。多糖作为T细胞非依赖性抗原，在婴儿中免疫原性较弱，且无法诱导免疫记忆、抗体类别转换或抗体亲和力成熟³。这些缺陷在多糖结合疫苗中得以克服⁴。由于大多数多糖缺乏便于偶联的化学基团，因此必须首先使其具有反应性，即"活化"。活化后的多糖可直接与蛋白质（或经修饰的蛋白质）连接，或在偶联前进一步功能化以实现额外衍生化⁴。目前大多数已获批准的多糖结合疫苗采用还原胺化法或氰化法来活化多糖中的羟基。溴化氰（CNBr）曾被用于活化层析树脂，最初也被用于多糖的衍生化。然而，CNBr需要高pH条件（通常约为pH 10.5或更高），以部分去质子化多糖的羟基，使其具有足够的亲核性以攻击氰基。这种高pH条件可能对碱不稳定的多糖造成损害，且CNBr本身以及最初形成的活性氰酯在如此高的pH下均不够稳定。

CDAP（1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐；图1）由Lees等人首次提出，用作多糖活化的氰基化试剂^5,6。CDAP为结晶性物质，易于操作，可在比CNBr更低的pH条件下活化多糖，且副反应更少。与CNBr不同，CDAP活化的多糖可直接与蛋白质偶联，从而简化了合成过程。CDAP活化的多糖可通过二胺（如己二胺）或二酰肼（如己二酸二酰肼，ADH）进行功能化修饰，生成氨基或酰肼基修饰的多糖。使用高浓度的同双功能试剂可抑制多糖之间的交联。氨基化多糖随后可通过多种已知的蛋白质偶联技术进行偶联。酰肼基修饰的多糖通常使用碳二亚胺试剂（如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDAC））与蛋白质偶联⁷。Lees等人已对CDAP介导的多糖活化方法进行了进一步优化⁸，本方案中已整合了这些优化步骤。

CDAP 偶联概述
CDAP 方法可分为两个阶段：（1）多糖的活化，以及（2）将活化的多糖与蛋白质或配体进行偶联（图 2）。第一步的目标是高效地活化多糖，第二步的目标则是高效地与活化的多糖发生偶联反应。活化的多糖将这两个步骤联系在一起。这种分步概念有助于聚焦每个步骤中的关键要素。图 2 进一步扩展了这一概念，展示了期望发生的活化与偶联反应，以及伴随发生的水解反应和副反应。

在活化阶段，主要关注三个问题：CDAP 的稳定性、CDAP 与多糖羟基的反应，以及活化多糖的稳定性（图3）。CDAP 的水解随 pH 升高而增加，活化多糖的水解及副反应亦如此。然而，提高 pH 有助于 CDAP 与多糖的反应。使用 CDAP 高效活化多糖需要在以下两方面之间取得平衡：1）多糖与 CDAP 的反应活性；2）试剂及活化多糖的水解与副反应。

在Lees等人⁵描述的原始CDAP活化方案中，多糖的CDAP活化是在未缓冲的pH 9溶液中于室温下进行的。在此条件下，活化反应速率较快，通常在3分钟内即可完成。然而，该反应伴随CDAP的快速水解，导致未缓冲反应体系的pH迅速下降。在如此短的时间内快速调节并维持反应pH至目标值具有较大挑战性。在该方案中，通过将CDAP从100 mg/mL的储备液加入未缓冲的多糖溶液中进行活化，30秒后加入"等体积的0.2 M三乙胺"以提高pH值，随后在活化反应进行2.5分钟后加入待偶联的蛋白质。值得注意的是，该活化步骤的pH控制并不理想，极有可能在初始阶段超过目标pH值。由于反应迅速且需及时调节pH，使得活化过程难以精确控制，并给放大生产带来困难。

与原始方案相比，此处描述的改进方案具有两项主要改进。首先，在加入CDAP之前，使用DMAP作为缓冲液，将多糖溶液的pH预先调节至目标活化pH。DMAP的pKa为9.5，因此在pH 9左右具有良好的缓冲能力；与其他许多缓冲液不同，DMAP不会促进CDAP的水解⁸。此外，DMAP本身已是反应过程中的中间体，因此不会向反应体系中引入新的组分。在加入CDAP前预先调节pH，可消除反应初期剧烈的pH波动，并使反应过程中目标pH的维持更加高效。第二项改进是将活化反应在0 °C下进行，此时CDAP的水解速率显著低于室温条件。由于在0 °C下试剂半衰期更长，活化时间从3分钟延长至15分钟，以补偿低温下较慢的活化速率。延长的反应时间反过来更有利于反应pH的稳定控制。采用0 °C还能减缓对pH敏感的多糖的降解，从而使得此类多糖的偶联物制备成为可能。这些方案改进使活化过程更为平稳、易于控制、可重复性更高，并更易于实现放大生产。

本文介绍了在0 °C及指定目标pH条件下进行多糖的CDAP可控活化，并随后用ADH对活化的多糖进行衍生化的改进方案。同时描述了一种基于Qi等⁹方法的三硝基苯磺酸（TNBS）测定法，用于测定修饰后多糖上的肼基含量。此外还介绍了一种基于间苯二酚和硫酸的己糖改良测定法¹⁰，可用于测定更广泛种类的多糖。有关CDAP活化与偶联的更多详细信息，读者可参考Lees等人的早期文献^5,6,8。

方案

注意：在进行多糖活化和功能化操作之前，预先配制好多糖溶液、ADH 溶液、DMAP 溶液和 CDAP 储备液。将这些溶液和设备放置在有序、方便且符合操作逻辑的位置。所述反应适用于 10 mg 多糖，可根据需要进行放大或缩小。建议在放大前先以小规模对方案进行评估。

1. 准备 2 mL 浓度为 5 mg/mL 的多糖溶液。

1. 对于冻干多糖
   1. 打开容器前，先将多糖样品置于室温下平衡。使用分析天平在螺口管中准确称取10 mg多糖粉末。建议使用静电消除器，以便更轻松地取样并提高粉末称量的准确性。
   2. 向管中加入2 mL 0.15 M氯化钠（NaCl）溶液以溶解多糖。盖紧管盖后涡旋混匀。
      注意：氯化钠不影响CDAP反应，但可能影响多糖的二级结构。某些多糖在不同盐浓度下的溶解度有所不同。
   3. 根据多糖的分子量，将管子置于翻转混合仪上旋转混合12–24小时，使多糖充分水合。如有必要，可轻微加热以促进溶解。
2. 对于已溶于缓冲液中的多糖溶液
   注意：为实现高效的CDAP活化，多糖溶液中不应含有任何缓冲液，尤其是磷酸根离子。请按照以下步骤将缓冲液置换为水或生理盐水，并将多糖浓度调整至5 mg/mL。
   1. 准备一个适当截留分子量（MWCO）的4 mL或15 mL离心过滤装置。
      注意：理想情况下，截留分子量应为多糖分子量的5–10倍。
   2. 向滤膜插入件中加入含有约20 mg多糖的缓冲液溶液。再加水或生理盐水至满刻度线。盖紧滤器盖子后，轻轻翻转混合数次。
   3. 按照制造商推荐的离心力进行离心。确保每次离心时间足够长，使滤液体积至少减少至原来的五分之一。弃去滤出液，重新组装过滤装置。
   4. 用新鲜的水或生理盐水重新加满滤膜插入件至满刻度线。盖紧盖子后，通过翻转混合约10次或轻柔涡旋混匀滤膜内的溶液，然后重复离心步骤。
      注意：多糖可能在离心装置滤膜插入件底部积聚，形成凝胶。建议在每次离心前，将滤膜插入件内的截留物与新加入的液体充分重新混匀。
   5. 重复加液和离心步骤至少3次。
   6. 按照以下操作从滤膜插入件中回收多糖截留物。
      1. 向滤膜插入件中加入新鲜水或生理盐水，使总体积约为1 mL。通过反复吹打或轻柔涡旋混匀。
      2. 将全部混匀后的截留物转移至一个5 mL离心管中。向滤膜插入件中再加入1 mL新鲜水或生理盐水，通过反复吹打或轻柔涡旋清洗滤膜。将所有清洗液转移并合并至已收集的多糖溶液中。
   7. 测定多糖浓度（参见第7.3节中的多糖检测方法）。根据测定结果，用额外的水或生理盐水将多糖溶液稀释至5 mg/mL。
3. 当多糖溶液制备完成后，将装有多糖溶液的管子置于冰浴中冷却。

2. 准备 10 mL 0.5 M 己二酸二酰肼（ADH）溶液。

1. 在分析天平上称取 0.87 g ADH，并溶于 8 mL 0.1 M HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）缓冲液中，pH 8。
2. 用 1 M 氢氧化钠（NaOH）调节至目标 pH 值，并用 pH 计监测。再用额外缓冲液定容至 10 mL，并重新确认 pH 值。

3. 配制 2.5 M DMAP 溶液，10 mL。

注意：DMAP 有毒，可穿透皮肤。操作时需佩戴腈类手套。

1. 将3 g DMAP小心称量至50 mL锥形管中。向DMAP中加入5 mL水，涡旋混合5分钟，得到浑浊溶液（约7 mL）。
2. 在混合过程中，以50 µL为增量逐次加入10 N盐酸（HCl），每次加入后充分混合。当溶液变为澄清时，停止加酸。
3. 以25 µL为增量逐次加入10 N NaOH，将DMAP溶液调至约pH 8。
4. 加水定容至10 mL，得到2.5 M的DMAP溶液。
5. 精细调节2.5 M DMAP溶液的pH值。
   注意：DMAP溶液的pH值随浓度和离子强度变化。此步骤旨在将2.5 M DMAP储备液调节至特定pH值，以便在与10倍体积的多糖溶液混合后，所得溶液的pH接近活化反应的目标pH值。
   1. 准备一系列含有1 mL水或NaCl溶液的1.5 mL离心管（所用溶液应与配制多糖溶液时一致），并将这些管置于冰上预冷。
   2. 向一支预冷的管中加入100 µL DMAP，涡旋混匀后用pH计测量pH值，随后弃去该管中的溶液。
   3. 若测得的pH值未接近目标值，则根据需要使用1 M NaOH或HCl调节DMAP储备液的pH值。重复步骤3.5.2和3.5.3，直至测得的pH值接近目标pH值。

4. 配制 100 mg/mL CDAP 储存液

注意：CDAP 粉末应密封保存于 -20 °C，使用前需恢复至室温，方可打开。操作时应佩戴腈类手套。

1. 在分析天平上对一个1.5 mL带盖离心管进行去皮归零。使用小药匙称取10–140 mg CDAP至管中。记录CDAP的实际重量。
2. 计算配制100 mg/mL CDAP溶液所需的乙腈体积。在通风橱中打开乙腈试剂瓶。
3. 使用适当体积的移液器，吸取并释放乙腈以平衡移液器吸头内的蒸气。数秒后待溶剂从吸头末端滴下时，准备直接将其转移至CDAP管中。吸取计算好的乙腈体积，并直接转移至CDAP管中。盖紧管盖。
   注：也可使用Hamilton注射器或相应合适规格的等效设备将乙腈转移至CDAP管中。
4. 涡旋振荡以充分溶解CDAP。将CDAP管置于冰桶中。
   ​注：CDAP在低温下于乙腈中稳定。可溶性储备液可在-20 °C保存>1周。但建议使用新鲜配制的CDAP溶液。

5. 多糖活化与肼基功能化

1. 开始活化前，请确保准备好以下所有物品，并将溶液置于冰上预冷：一个平底广口容器中装有2 mL浓度为5 mg/mL的多糖溶液，内含搅拌子，放置于磁力搅拌器上；100 mg/mL的CDAP储存液；2.5 M的DMAP储存液；一支配备半微量pH探针（例如直径6 mm）的pH计，已根据制造商说明校准至0 °C；一支可立即使用的100 µL移液器；一个已清零并可使用的计时器；自动滴定仪分配头已就位，或一支可立即使用的10 µL移液器；0.5 M的ADH溶液。
2. 使用DMAP预先调节多糖溶液的pH至目标pH。
   1. 将pH探针插入多糖溶液中，并在整个活化过程中保持其浸没在溶液中。
   2. 在搅拌条件下逐滴加入200 µL DMAP储存液至多糖溶液中。调节溶液pH至目标活化pH值。使用0.1 M HCl降低pH，使用0.1 M NaOH升高pH。避免pH超过目标值0.1个单位以上，并在整个活化过程中将反应体系置于冰水浴中保持低温。
3. CDAP活化
   1. 用移液器吸取100 µL CDAP溶液上下吹打数次，以平衡移液器吸头内的蒸气。在搅拌条件下，将100 µL CDAP加入多糖溶液中。
      注：本活化步骤初始采用每1 mg多糖使用1 mg CDAP的比例。在优化活化条件时，该比例可适当提高或降低。
   2. 启动计时器，并在整个活化过程中监测pH变化。通过自动滴定仪分配装置（或移液器）及时添加10 µL的0.1 M NaOH，以维持反应体系在目标pH值。
      注：轻轻用pH探针搅拌可能有助于缩短pH响应时间。反应初期pH下降较快，可能需要更频繁地添加0.1 M NaOH；随着反应进行，pH下降速度减缓，添加频率也随之降低。当接近最佳活化时间（pH 9活化时为10–15分钟）时，pH应基本保持稳定。
4. ADH功能化
   1. 当达到最佳活化时间后，在搅拌条件下一次性加入2 mL 0.5 M ADH溶液至已活化的多糖溶液中。检查pH是否处于目标范围（ADH反应的适宜pH为8–9）。
      注：一次性快速混合可最大程度减少二酰肼两端同时与活化多糖反应的可能性，从而避免多糖交联。
   2. 继续搅拌反应混合物至少1小时。将反应混合物转移至4 °C保存，但0–20 °C也可接受。
      ​注：ADH功能化反应对温度依赖性不强。由于过量的二酰肼本身可作为淬灭试剂，因此无需额外淬灭活化多糖。然而，在直接偶联蛋白质时，应使用典型淬灭剂（如1 M甘氨酸，pH 8–9）进行淬灭。

6. 透析法纯化ADH功能化的多糖

注意：ADH 功能化反应的粗产物中含有高浓度的 ADH（0.5 M），通过长时间透析可最有效地去除。凝胶过滤（无论是使用层析柱还是离心脱盐装置）效率较低，尤其是在需要去除残留 ADH 污染物时。

1. 确定透析膜的截留分子量（MWCO）。对于较小的多糖，使用3 kDa截断值。
   注意：透析膜的截留分子量（MWCO） ideally 应比多糖的分子量小5-10倍。
2. 选择所需的透析形式（透析盒或透析管）及合适的装置容量。确保装置容量是样品体积的2倍以上。请参考制造商提供的使用说明来操作该装置。
3. 使用前将透析膜在水中充分水化。根据制造商的说明，将粗制的衍生化多糖溶液转移至透析装置中。
   注意：佩戴腈类手套，避免接触DMAP。
4. 将装置置于含有2-4 L的1 M NaCl溶液并配有搅拌子的容器中进行透析。将容器放置在冷室或冰箱内的搅拌器上。透析过程中持续轻柔搅拌透析液。
5. 至少透析4小时后，更换为新鲜的1 M NaCl溶液，并继续透析至少12小时。随后用两次0.15 M生理盐水透析，每次至少12小时。如有需要，再用水更换透析两次。
6. 通过快速TNBS检测过夜透析液，验证是否已完全去除ADH。
   1. 取3支硼硅酸盐试管，分别标记为阴性对照（ctrl）、阳性对照（ctrl）和样品管。
   2. 向阴性对照管中加入975 µL 0.1 M 硼酸盐缓冲液，pH 9。
   3. 向阳性对照管中加入100 µL 0.05 mM ADH（0.1 mM 肼基）和875 µL 0.1 M 硼酸盐缓冲液，pH 9。
   4. 向样品管中加入500 µL 过夜透析液和475 µL 0.1 M 硼酸盐缓冲液，pH 9。
   5. 向所有三支试管中各加入25 µL 1% TNBS溶液，充分混匀，避光放置1小时。
   6. 1小时后比较三支试管的颜色强度。确保样品管的颜色强度介于阳性对照与阴性对照之间，表明ADH污染物浓度已降至0.01 mM或更低。再进行一次透析。
      ​注意：应尽可能降低ADH污染物的水平，使ADH肼基在纯化的肼基-多糖产物中所占比例低于1%。
   7. 从透析装置中回收衍生化多糖。测定多糖和肼基的浓度。计算肼基/多糖的摩尔比（见第7节）。如果透析后的多糖需要浓缩至5-10 mg/mL，请参见第1.2节。

7. 肼基衍生化多糖的分析

注意：此处所述分析的目的是确定多糖浓度、肼基浓度，以及以肼基/多糖比率表示的肼基化修饰程度。

1. 样品制备
   注意：待检测的多糖必须不含低分子量碳水化合物、胺类或肼类杂质。冻干样品应干燥且无盐，以确保称量准确。通常，1-2 mg/mL的溶液约1 mL即可满足检测需求。
   1. 使用分析天平，采用防静电刮勺或静电消除器，称取至少10 mg冻干多糖样品。将多糖溶解于水或生理盐水中，配制成适当浓度（例如2 mg/mL），使检测信号落在标准曲线的线性范围内。
   2. 将样品上下颠倒混合，并留出足够时间使其完全溶解。根据多糖的分子量决定是否进行过夜水化。
2. 多糖测定：间苯二酚/硫酸法
   注意：多糖的合适检测方法取决于聚合物的碳水化合物组成。最初的间苯二酚/硫酸检测法是针对己糖设计的。¹⁰将加热步骤的温度从90 °C提高至140 °C，对此检测方法进行了改进。在较高温度下，该检测的特异性有所降低，但可用于检测多种糖类。然而，仍需确定该方法是否适用于特定的多糖。建议每个数据点设置三个重复，但根据加热块的容量，可能需要适当调整。
   1. 配制75%硫酸
      注意：浓硫酸具有极强腐蚀性，可导致严重灼伤。该操作须在化学通风橱中进行。务必将浓酸缓慢加入水中，切勿将水倒入浓酸中 反之亦然!
      1. 向一个200 mL玻璃瓶中加入50 mL水。将瓶子置于冷水浴中。缓慢加入150 mL硫酸。盖上瓶盖，确保瓶口通风。
      2. 让溶液平衡至室温。溶液需在3个月内使用。
   2. 制备碳水化合物标准品
      1. 将未修饰的多糖溶液配制为1 mg/mL，用作标准品。或者，也可使用按多糖重复单元中各单糖比例配制的单糖混合物，总糖浓度为1 mg/mL，作为标准品。
         注意：尽管糖混合物通常会得到与具有相同糖组成的碳水化合物聚合物相同的结果，但仍需通过实验加以验证。
   3. 确保用于13 x 100硼硅酸盐试管的加热块及其试管架正常工作。在加热块的底部及周围放置防护垫，以防酸液溢出。将加热块预热至140 °C，并持续至少1 h，以确保所用加热块各部位温度稳定且均匀。
   4. 标记13支10 x 100硼硅酸盐试管，每个标准品和每个样品均设三个重复。向相应标记的标准品管中分别加入0、2.5、5、7.5、10 µg（或µL）的1 mg/mL碳水化合物标准品溶液。向每支试管中加水至总体积为100 µL。
      注意：生成的颜色取决于特定的糖类。由于某些糖需要更大的质量才能产生完整的吸光度范围，因此用于标准曲线的实际用量可能有所不同。
   5. 在三个样品管中分别加入含有约 5 µg 衍生化多糖的溶液，用水将总体积调至 100 µL，以建立样品检测体系。或者，若样品中多糖浓度未知，可进行一系列 4 倍稀释。每种稀释液取 100 µL，设三个重复进行检测。
   6. 使用去离子水（dI水）在使用前立即配制6 mg/mL的新鲜间苯二酚溶液，涡旋振荡至间苯二酚完全溶解。每管加入100 µL 6 mg/mL的间苯二酚溶液。
   7. 将估算量的75%硫酸小心倒入一个小烧杯中。
      注意：穿戴实验服、腈类手套和护目镜。注意防止滴漏、泼洒和飞溅。准备湿纸巾以便及时擦拭任何滴落物。由于硫酸在长时间暴露于空气中后活性会发生变化，因此整个检测过程中应使用均匀一致的硫酸混合液。
   8. 使用多通道移液器，向每支试管中均匀加入 300 µL 的 75% 硫酸。剧烈振荡混匀，振荡时试管口应朝向远离操作者的方向。按顺序以稳定的速度将试管放入加热块中。待所有试管放入后，立即设置计时器为 3 分钟。
   9. 3分钟时，以稳定的速度按相同顺序取出试管，立即放入盛有冰水的烧杯中的试管架里，保持至试管完全冷却。取出试管，室温平衡约5分钟，以防止比色皿在测定过程中产生冷凝水。
   10. 将紫外/可见分光光度计设置为使用10 mm光程长度的比色皿，在430 nm处测定吸光度。用零标准管调零。测定所有试管在430 nm处的吸光度。
       注意：一次性塑料比色皿使用方便。
   11. 通过绘制碳水化合物标准品的微克数（µg）与吸光度（A）的关系图，构建标准曲线。₄₃₀参见 图4 使用葡萄糖作为参考标准品绘制典型标准曲线。
   12. 使用含有A的样品测定管₄₃₀ 根据标准曲线方程，计算样品检测管中未知多糖的微克（µg）含量，所用数据应落在标准曲线的线性范围内。根据所加入未知样品的体积，并考虑稀释倍数，确定未知多糖的浓度。按需将浓度转换为毫克/毫升（mg/mL）或微摩尔/升（µM）重复单元。
3. 使用三硝基苯磺酸（TNBS）的酰肼测定法
   1. 将9 g NaCl和200 mg叠氮化钠溶解于去离子水中，配制含0.02%叠氮化钠的0.9% NaCl溶液（样品缓冲液）₂定容至 1 L。
   2. 将100 mL 0.5 M 硼砂缓冲液（pH 9）与400 mL去离子水混合，配制0.1 M 硼砂缓冲液（pH 9）（测定缓冲液）₂O. 确认溶液 pH 为 9 ± 0.1；必要时进行调节。
   3. 将200 µL的5% 2,4,6-三硝基苯磺酸溶液用去离子水定容至1 mL，配制1% TNBS溶液₂O. 将试管标记为1% TNBS，并在避光条件下于4 °C保存一周。
   4. 配制 50 mM ADH 储存液（相当于 100 mM 肼基）。
      1. 使用分析天平称取871 mg 己二酸二酰肼（ADH）粉末。将粉末转移至试剂瓶中，借助电子台秤加入样品缓冲液至总体积100 mL，溶解粉末。
      2. 将瓶子标记为100 mM 肼/50 mM ADH。盖紧瓶盖，于4 °C保存1年。
   5. 配制肼类标准品（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和 0.6 mM 肼类）。
      1. 使用顶部加载天平，用样品缓冲液稀释100 mM肼类储备液，配制6种肼类标准品。每种标准品配制100 mL，以最小化浓度误差。将瓶盖拧紧，于4 °C保存，可稳定存放1年。
   6. 建立检测反应体系
      注意：TNBS 检测的反应体系总体积为 1 mL。每个检测管中包含 100 µL 样品（或标准品）、875 µL 检测缓冲液和 25 µL 1% TNBS 溶液。所有检测反应（包括样品和标准品）均设置三个重复。
      1. 为每种标准品（包括零标准品）标记3个硼硅酸盐玻璃管（12 × 75 mm）。将标准品管按浓度递增顺序在试管架中排列整齐。使用经校准的100 µL或200 µL微量移液器，准确向各对应试管中加入100 µL标准品溶液。对于零标准品，加入100 µL样品缓冲液。
      2. 为每份待检测的稀释样品标记3个硼硅酸盐玻璃管（12 × 75 mm），并按相应顺序将样品管排列在试管架中。使用经校准的100 µL或200 µL微量移液器，准确向每个对应的样品管中加入100 µL样品。
      3. 使用校准过的1000 µL移液器，向所有检测管（包括标准品和样品）中准确加入875 µL的检测缓冲液。
   7. 为启动测定反应，使用经校准的100 µL微量移液器准确向每支测定管中加入25 µL的1% TNBS。操作顺序应从零标准管开始，按浓度递增顺序依次加入标准管，然后按照预先确定的顺序加入样品管。每次开始加入新一种标准品或新一样品时均需更换吸头，并确保向所有试管中添加TNBS的过程在5分钟内完成。
      1. 将所有检测管在高速下涡旋震荡2秒，或调节速度使管内液体旋转上升至距管口1/2英寸的高度。
      2. 记录检测开始时间，并将计时器设定为2小时。将检测管架置于室温避光处孵育2小时。时间结束后，再次涡旋振荡所有试管，然后进行数据采集。
   8. 数据采集
      1. 让紫外/可见分光光度计预热并使基线稳定。将检测波长设置为500 nm，用于肼测定。整个测定过程中所有吸光度测量均使用1 mL石英比色皿，光程为1 cm。
      2. 通过将零标准测定液转移至比色皿中开始数据采集；对仪器进行空白校准（将吸光度设为零）。
      3. 对每支试管进行一次读数，并将吸光度值记录在数据表中。读取新样品前，清除比色皿中残留的液体。从零标准品开始，依次测定浓度递增的标准品，然后测定样品。一旦开始，应高效连续地完成所有步骤，并在10分钟内完成所有试管的读数。
   9. 分析样本数据
      1. 通过绘制 mM 肼标准品与 A 的关系曲线，建立标准曲线₅₀₀. 找到标准曲线方程，形式为 y = ax + b，其中 y 代表 mM 肼 x 代表 A₅₀₀参见 图4 用于典型的标准曲线。
      2. 使用标准曲线方程计算样品中肼基的毫摩尔浓度（mM），并根据稀释倍数进行校正。仅选择吸光度 A₅₀₀ 落在标准曲线线性范围内的数值用于计算。
      3. 使用公式（计算酰肼基团与多糖的摩尔比1).
         肼/多糖 = h / c × MW (1)
         何处 h 是 mM 肼类化合物， c 为多糖的 mg/mL 浓度，以及 MW 是多糖的分子量，单位为kDa。
      4. 使用公式（计算每100 kDa多糖的肼基标记密度2).
         每100 kDa多糖的标记密度 = h / c × 100 (2)
         何处 h 是 mM 肼 c 多糖的浓度，单位为 mg/mL。
         ​注意：为方便起见，可将多糖的分子量视为 100,000 道尔顿。这使得人们可以将其视为一种 "标记密度" 在比较不同多糖的衍生化程度时。
      5. 以ADH的重量百分比计算酰肼标记密度。
         1. 使用方程（确定ADH的有效mg/mL浓度3).
            mg/mL ADH = (mM 肼 / 1000) × 1743)
            ​其中174为ADH的分子量（MW）。
         2. 使用公式（计算ADH的重量百分比4).
            重量百分比 ADH = (mg/mL ADH) / (mg/mL 多糖) × 1004)

结果

为了说明使用CDAP化学法对多糖进行活化和衍生化的过程，分别以0.25和0.5 mg CDAP/mg葡聚糖的剂量对葡聚糖进行活化。每次反应中，将10 mg/mL的葡聚糖水溶液置于冰上冷却，并加入1/10^th 加入2.5 M DMAP储备液（按第3节所述方法配制）的适量体积。逐次加入10 µL 0.1 M NaOH，将最终溶液pH调至9。将溶液冷却并搅拌，加入CDAP，并在15分钟内通过添加10 µL等份的0.1 M NaOH维持pH为9。仅加入0.25 mL pH 9的0.5 M ADH（少于常规用量），反应在4 °C下过夜进行。

然后按照第6节所述，将标记的葡聚糖依次用1 M NaCl、0.15 M NaCl和水进行透析。随后采用间苯二酚/硫酸法测定（第7.2节）检测ADH-葡聚糖中的葡聚糖含量。以葡萄糖作为糖标准品绘制的典型标准曲线如图4A所示。采用第7.3节所述TNBS法测定腙基含量。以ADH作为标准品绘制的典型腙基标准曲线见图4B。

在图4A、B中展示了葡聚糖在两种活化水平下的代表性计算结果。数据以每100 kDa葡聚糖聚合物所含的肼基数以及ADH与葡聚糖的重量百分比形式呈现，分别如图4C中第7.9.3.4节和第7.9.3.5节所述。随着CDAP比例加倍，衍生化程度也大约增加了一倍。

图1：CDAP的化学结构。CDAP = 1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：CDAP活化与偶联过程。 该过程在概念上分为两个阶段，两者均以活化的多糖为共同中间体。在碱性条件下，CDAP活化多糖上的羟基，释放DMAP（反应1）。CDAP的水解也会释放DMAP（反应3）。尽管图中显示了氰基酯中间体，但其可能并非真实的中间产物。因此，该中间体被称为（CDAP）“活化”的多糖。在第一阶段的活化过程中，活化的多糖可能发生水解（反应4）或副反应（反应5）。在第二阶段的偶联过程（反应2）中，活化的多糖与胺反应，除了发生反应4和5外，还形成稳定的异脲键。缩写：CDAP = 1-氰基-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐；DMAP = 4-二甲基氨基吡啶；R-NH₂ = 胺。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：CDAP活化与偶联。该过程需要平衡CDAP与多糖之间的反应性、CDAP及活化多糖的稳定性，以及活化多糖与胺之间的反应性。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：CDAP活化葡聚糖的代表性结果。（A）间苯二酚/硫酸法和（B）TNBS法测定的典型标准曲线。结果显示了以0.25和0.5 mg CDAP/mg葡聚糖活化的葡聚糖测定结果。间苯二酚法测定以葡萄糖作为标准品。葡聚糖浓度（mg/mL）除以100 kDa，得到摩尔浓度。酰肼浓度以ADH为标准品测定，结果以µM Hz表示。（C）酰肼：葡聚糖比例的计算。为便于比较不同平均分子量的聚合物，衍生化程度以每100 kDa葡聚糖所含的酰肼数量表示。g ADH/g葡聚糖的重量百分比是根据ADH的分子量为174 g/mol计算得出的。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

CDAP 是一种用于衍生化和偶联多糖的便捷试剂。本文描述了使用 CDAP 将多糖与酰肼基团进行衍生化（PS-ADH）的通用方法，并纳入了近期发表的改进措施⁸。首先，该技术强调了维持目标 pH 值以控制活化过程的重要性。我们发现，尽管许多常用缓冲液会干扰 CDAP 活化反应，但 DMAP 可成功用作调节 pH 的缓冲剂⁸。此外，DMAP 本身就是 CDAP 活化反应的副产物。最后，在加入 CDAP 前先用 DMAP 对多糖溶液进行缓冲，有助于精确调控并维持反应体系的 pH 值。如文中所述，调整浓储备 DMAP 溶液的 pH 值是可取的，以便在稀释后达到目标 pH 值。其次，在低温条件下进行该过程可减缓反应速度，使活化过程更为平缓且容错性更高。较低温度降低了 CDAP 水解的速率，在 pH 9 条件下的最佳活化时间从约 3 分钟延长至约 15 分钟。此外，与室温下操作相比，达到相同活化程度所需的 CDAP 用量更少。

ADH 衍生化的多糖可使用碳二亚胺类试剂（例如 EDAC）与蛋白质偶联⁷。例如，多种已获许可的b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae b，Hib）疫苗即采用经ADH衍生化的聚核糖基核糖醇磷酸酯（PRP），并通过EDAC将其与破伤风类毒素偶联。早期曾使用CNBr，但CDAP作为该用途的试剂操作简便得多。根据我们的经验，ADH衍生化的理想目标范围为每100 kDa多糖引入10–30个肼基，或按重量计约含1–3%的ADH。

通过将ADH替换为二胺，可采用相同的方法使含有伯胺的多糖发生衍生化。建议使用己二胺对多糖进行胺基衍生化⁸。胺基化多糖（PS-NH₂）可利用专为蛋白质偶联开发的试剂进行偶联¹¹。通常，将PS-NH₂用马来酰亚胺试剂衍生化（例如：琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯（SMCC）或N-γ-马来酰亚胺丁酰基-氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS）），同时对蛋白质进行巯基化处理（例如：使用琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯（SPDP））。巯基-马来酰亚胺化学反应效率非常高。

蛋白质也可通过赖氨酸残基上的ε-氨基直接偶联到CDAP活化的多糖上。尽管所用的活化方案通常与本文所述相似，但仍需优化活化程度、多糖和蛋白质浓度，以及蛋白质与多糖的比例^5,6,8。

由于葡聚糖含有相对高密度的羟基，因此它是使用CDAP活化最简便的多糖之一，但某些多糖（如Vi抗原）则较难处理。因此，并不存在一种适用于所有蛋白质的CDAP直接偶联“最佳”方案。我们建议首先建立一个能够实现适当活化程度（通过肼基衍生化程度确定）的方案，然后进行蛋白质与CDAP活化多糖的直接偶联。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙腈	Sigma	34851
己二酸二酰肼	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Millipore	UFC901008	分子量截留值对于200 kDa PS可为30 kDa
分析天平
自动滴定器或电子移液器
烧杯  2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122.2
片冰
1 M HCl	VWR	BDH7202-1
微型搅拌子	VWR	76001-878
微型离心管（用于CDAP）	VWR	87003-294
NaCl	VWR	BDH9286
1 M NaOH	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Sigma	SX0607N-6
pH计
pH 探针	Cole Parmer	55510-22	6 mm × 110 mm 环氧单结
pH 温度探针
移液器 &和技巧
生理盐水或 PBS
5-20 mL 小烧杯	VWR	10754-696	10 mL 烧杯为 pH 探针留出空间 &和移液器
小型冰桶
小型刮勺
搅拌器
<强>间苯二酚测定法
Combitip	Eppendorf	10 ml
去离子水
透析管	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8 kDa
透析袋夹子	Repligen	142150
加热块
腈类手套	VWR
重复移液器	Eppendorf	M4
间苯二酚	Sigma	398047
糖标准品		视情况而定
75% 硫酸	VWR	BT126355-1L
计时器
<强>TNBS 测定
己二酸二酰肼	Sigma	A0638	MW 174
硼硅酸盐试管 12 x 75	VWR	47729-570
0.5 M pH 9 硼酸钠	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% w/v	Sigma	P2297	MW 293.17