本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。
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摘要
摘要
模型细胞膜是一种有用的筛选工具，其应用范围涵盖早期药物发现到毒性研究。细胞膜是所有细胞类型的关键保护屏障，将细胞内组分与细胞外环境分隔开来。这些膜主要由脂质双层构成，包含外侧的亲水性头部基团和内侧的疏水性尾部基团，并含有多种蛋白质和胆固醇。脂质本身的组成与结构在调控生物学功能中起着关键作用，包括细胞与细胞微环境之间的相互作用，而微环境中可能含有药物、生物毒素以及环境毒物。本研究描述了制备单一种类脂质和多种脂质组成的、支持型与悬浮型细胞模拟脂质双层的方法。此前，已开发出单一种类磷脂酰胆碱（PC）脂质双层以及受胎盘滋养层细胞启发的多种脂质组成的脂质双层，用于研究分子间相互作用。本文将介绍实现上述两类双层模型的实验方法。对于模拟细胞的多脂质双层，首先通过从原代细胞或细胞系中提取脂质，并结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）确定目标脂质组成。基于该组成，采用薄膜水化与挤出法制备脂质体，并对其流体动力学直径和泽塔电位进行表征。随后，分别利用带耗散监测功能的石英晶体微天平（QCM-D）在固体基底上形成支持型脂质双层，或在多孔膜上构建悬浮型脂质双层，以用于平行人工膜渗透性测定（PAMPA）。代表性结果突出了该方法的可重复性与多功能性 体外 细胞膜脂质双层模型。所介绍的方法有助于快速、简便地评估各种分子和大分子与细胞膜之间的相互作用机制（如渗透、吸附和嵌入），从而助力药物候选物的筛选及潜在细胞毒性的预测。
引言
细胞膜主要由磷脂、胆固醇和蛋白质组成，是所有活细胞的关键组分1由脂质两亲性驱动的结构组织使细胞膜发挥保护屏障功能，并调控细胞与其周围环境的相互作用2多种细胞过程依赖于膜的脂质和蛋白质组成1,2例如，细胞膜相互作用对于有效的药物递送至关重要3药物、生物制剂、纳米材料、生物毒素和环境毒物可能影响细胞膜的完整性，从而影响细胞功能4. 构建 体外 基于细胞膜脂质组成构建的细胞模拟膜模型有望为研究这些材料对细胞的潜在影响提供简便有效的工具。
模型脂质双层包括脂质体、支撑脂质双层和悬浮脂质双层。支撑脂质双层是磷脂细胞膜的一种模型，常用于生物技术应用中，其中脂质体在支撑基底材料上破裂形成双层结构5,6,7,8,9。一种常用于监测双层膜形成的技術是....
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方案
1. 制备单脂质囊泡
- 薄膜水化法
- 脂质储备液的制备与保存
注意：所有使用氯仿的步骤均须在化学通风橱中进行。应始终使用耐溶剂的碳纤维移液枪头吸取氯仿。含氯仿的溶液应始终储存于玻璃小瓶中。- 通过向含有脂质粉末的小瓶中加入适量氯仿并充分混合，制备10 mg/mL的脂质储备液。例如，将20 mL氯仿加入200 mg的L-α-磷脂酰胆碱（卵，鸡）（eggPC）中。根据需要，储备液也可配制成其他浓度。
注意：如果粉末脂质储存在安瓿瓶中，在加入氯仿后，将其转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖的玻璃小瓶中。 - 用封口膜密封离心管盖，并于 -20 °C 长达6个月。
- 通过向含有脂质粉末的小瓶中加入适量氯仿并充分混合，制备10 mg/mL的脂质储备液。例如，将20 mL氯仿加入200 mg的L-α-磷脂酰胆碱（卵，鸡）（eggPC）中。根据需要，储备液也可配制成其他浓度。
- 干脂膜的形成
- 将适量的脂质储备液加入洁净的玻璃小瓶中，以配制终浓度为 2.5 mg/mL 的囊泡。例如，若要制备 1 mL 浓度为 2.5 mg/mL 的蛋磷脂酰胆碱（egg PC）囊泡，用移液器吸取 250 µL 将卵磷脂PC储备液加入小瓶中。
注意：制备的体积可能取决于所使用的挤出机工艺（参见步骤 1.3）。微型挤出机推荐的最大体积为 1 mL，而大型挤出机的体积范围为 5–50 mL。 - 使用氮气流从脂质储备液中去除氯仿2 气体（超纯5.0级）
- 为确保完全去除氯仿，将干燥的脂质膜连接至真空泵，静....
- 将适量的脂质储备液加入洁净的玻璃小瓶中，以配制终浓度为 2.5 mg/mL 的囊泡。例如，若要制备 1 mL 浓度为 2.5 mg/mL 的蛋磷脂酰胆碱（egg PC）囊泡，用移液器吸取 250 µL 将卵磷脂PC储备液加入小瓶中。
- 脂质储备液的制备与保存
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结果
本方案详细介绍了形成支撑型和悬浮型脂双层的方法（图1）。形成支撑型脂双层的第一步是制备脂质囊泡。微型挤出器可用于制备小体积的脂质囊泡（1 mL 或更少），而大型挤出器则可在单次操作中制备 5–50 mL 的脂质囊泡。微型或大型挤出器所形成的单层脂质囊泡的尺寸分布如 图2A 所示。由于大型挤出器采用高压 N2 气体将囊泡溶液推过聚碳酸酯膜，所得脂质囊泡的平均流体动力学直径接近目标值 100 nm。微型挤出器同样可产生均一的尺寸分布，尽管囊泡的流体动力学直径略大于聚碳酸酯膜的孔径，这是此类手动挤出方法的典型特征。
图2B-D 比较了单一脂质卵磷脂PC囊泡与两种多脂质囊泡在粒径、多分散性及zeta电位方面的差异。表1 对比了每种脂质囊泡组成的平均流体动力学直径。第一种多脂质囊泡（ML1）的组成模拟胎盘滋养层来源的脂质囊泡，其组成为卵磷脂（PC）:磷脂酰乙醇胺（PE）:磷脂酰肌醇（P.......
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讨论
本方案可用于制备脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层。本文介绍了形成这三种结构的关键步骤。在制备脂质囊泡时，必须在脂质的相变温度以上进行挤出39。当温度低于相变温度时，脂质以有序的凝胶相物理存在39。在此有序相中，脂质的烃链完全伸展，能够紧密堆积，导致挤出困难39。当加热至相变温度以上时，脂质分子排列变得更加无序，形成液晶相39。在此温度下，脂质的烃链流动性增强，有利于成功挤出39。脂质的特性，如头部基团组成、饱和度和电荷，均会影响其相变温度。此外，在形成脂质膜时彻底去除氯仿至关重要，因为残留的氯仿会在再水化后对囊泡的形成及其性质产生不利影响。
使用QCM-D技术形成支撑脂双层时，确保涂有二氧化硅的石英晶体传感器处于完美状态至关重要。传感器可重复使用，但每次使用前必须检查是否存在划痕、碎屑或其他磨损，一旦发现任何缺陷即应弃用，因为传感器的缺陷会影响.......
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披露
作者声明不存在利益冲突或竞争性经济利益。
致谢
本材料基于美国国家科学基金会（National Science Foundation）资助项目（授予 A.S.，项目编号 1942418）以及授予 C.M.B.H. 的美国国家科学基金会研究生研究奖学金（项目编号 1644760）所支持的工作。本文中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。作者感谢 Noel Vera-González 博士在脂质囊泡表征数据采集方面的帮助。作者感谢布朗大学 Robert Hurt 教授提供 Zetasizer 仪器的使用。作者感谢布朗大学质谱中心，特别是 Tun-Li Shen 博士，在脂质组成定量分析方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱 （POPC，16:0-18:1 PC） | Avanti Polar Lipids | 850457 | |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂-L-丝氨酸（钠盐）（POPS，16:0-18:1 PS） | Avanti Polar Lipids | 840034 | |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（16:0-18:1 PE） | Avanti Polar Lipids | 850757 | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-2-磷脂-L-丝氨酸（DOPS，18:1 PS） | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DOPC，18:1 (Δ9-顺式) PC） | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺（DOPE，18:1 (Δ9-顺式) PE） | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷脂胆碱（氯化物盐）（18:0 EPC (Cl Salt)） | Avanti Polar Lipids | 890703 | |
| 3 mL 鲁尔锁注射器 | BD | 309657 | |
| 40 mL 样品瓶，琥珀色，带聚四氟乙烯（PTFE）/橡胶衬垫 | Duran Wheaton Kimble | W224605 | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 271004 | |
| Alconox | Fisher Scientific | 50-821-781 | |
| 甲酸铵 | Millipore Sigma | LSAC70221 | |
| C18，3.5 µm × 50 mm 色谱柱，SunFire | Waters | 186002551 | |
| 氯仿 | Millipore Sigma | LSAC288306 | |
| UV 微量比色皿 LCH 8.5 mm，50 µm，RPK | Sarstedt | 67.758.001 | |
| 邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP） | Millipore Sigma | 36735 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Millipore Sigma | LSAC472301 | |
| 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| 滤膜支撑片，10 mm | Avanti Polar Lipids | 610014 | 适用于小型挤出器 |
| 折叠毛细管ζ电位池 | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 190764-4L | |
| Kimwipes 擦拭纸 | Kimberly Clark | 34256 | |
| L-α-磷脂酰肌醇（大豆）（Soy PI） | Avanti Polar Lipids | 840044 | |
| L-α-磷脂酰胆碱（蛋黄，鸡源） | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| LiposoFast ® LF-50 | Avestin, Inc. | ||
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 179337 - 4L | |
| 带支架/加热块的小型挤出装置套装 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MultiScreen-IP 滤膜板，0.45 µm，透明，无菌 | Millipore Sigma | MAIPS4510 | 用于PAMPA研究 |
| 高纯氮气 | TechAir | NI T5.0 | |
| Nuclepore 亲水性膜，聚碳酸酯，19 mm，0.1 µm | Whatman | 800309 | 适用于小型挤出器 |
| Nuclepore 亲水性膜，聚碳酸酯，25 mm，0.1 µm | Whatman | 110605 | 适用于大型挤出器 |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM999 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩液 | Genesee Scientific | 25-507X | 稀释至1倍使用 |
| Qsoft 401 软件 | Biolin Scientific | ||
| 带耗散检测的石英晶体微天平 Q-Sense 分析仪 | Biolin Scientific | ||
| 闪烁瓶，硼硅酸盐玻璃瓶，20 mL | Duran Wheaton Kimble | 986561 | |
| 二氧化硅，薄层Q传感器 | Biolin Scientific | QSX 303 | |
| 氯化钠（NaCl） | Millipore Sigma | LSACS5886 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| 耐溶剂移液器吸头 | Sigma-Aldrich | S8064 | |
| 鞘磷脂（蛋黄，鸡源） | Avanti Polar Lipids | 860061 | |
| Trizma 基础缓冲液 | Millipore Sigma | LSACT1503 | |
| 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 | Caisson Labs | TRL01-6X100ML | |
| Whatman 排液盘，25 mm | Whatman | 230600 | 适用于大型挤出器 |
| Zetasizer ZS90 | Malvern Panalytical | ||
| Zetasizer 7.01 软件 | Malvern Panalytical |
参考文献
- Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
- Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as....
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