一种由大鼠脊髓受压诱导的神经元凋亡模型

摘要

本文介绍了一种建立大鼠脊髓压迫模型的方法，并对其行为学评分及受压迫脊髓区域进行观察。行为学评估结果显示运动功能障碍明显减轻。苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色显示，脊髓受压区域存在显著的神经元凋亡现象。

摘要

颈椎病性脊髓病（CSM）是一种严重的进行性退行性疾病，预后较差，常伴随身体疼痛、僵硬、运动或感觉功能障碍，以及脊髓损伤和四肢瘫痪的高风险。因此，迫切需要能够促进这种慢性进行性疾病中脊髓有效再生的治疗策略。为了深入理解CSM复杂的生物学机制，需要建立有效且可重复的动物脊髓压迫模型。大多数脊髓损伤模型反映的是急性且具有结构性破坏的状况，而CSM的动物模型则表现为脊髓的慢性压迫。本文介绍了一种建立大鼠脊髓压迫模型的实验方案，并通过行为学评分和对受压脊髓区域的观察进行了进一步评估。行为学评估显示，动物的运动功能障碍明显减轻，包括关节活动、迈步能力、协调性、躯干稳定性以及肢体肌肉力量均有所改善。苏木精和伊红（H&E）染色及免疫组织化学染色结果显示，在脊髓受压区域存在显著的神经元凋亡现象。

引言

作为一种常见的进行性退行性疾病，脊髓型颈椎病占所有颈椎病的5%-10%¹。若脊髓型颈椎病患者忽视其症状，未能及时有效地进行治疗，可能导致严重并发症，如脊髓损伤和肢体瘫痪，且随着年龄增长病情将进一步恶化，给患者及其家庭带来沉重的经济和心理负担^2,3。脊髓型颈椎病的发病机制复杂，涉及静态和动态因素、缺氧-缺血学说、内皮细胞损伤、血-脊髓屏障破坏学说，以及炎症与凋亡学说^4,5,6,7。

脊髓受压的静态和动态机制可引起临床症状。椎间盘突出、椎体畸形以及韧带钙化可能导致脊髓长期受压，进而逐渐影响脊髓的血-脊髓屏障及局部微血管系统^4,8。继而，缺血、炎症和细胞凋亡会影响神经元、轴突和胶质细胞^6,9。

脊髓损伤的实验动物模型包括挫伤、压迫性损伤、牵拉性损伤、光化学诱导损伤以及缺血-再灌注损伤。其中大多数模型也能反映一些急性及结构性破坏性状况（如横断或化学毒性）。然而，这些脊髓型颈椎病（CSM）的动物模型无法呈现脊髓内进行性神经元凋亡的过程。

本文描述了一种建立大鼠脊髓压迫模型的详细方案，并通过评估行为学评分及观察脊髓受压区域对该模型进行了进一步验证。该大鼠脊髓压迫模型是研究脊髓型颈椎病（CSM）相关机制的可靠动物模型。

方案

本实验程序已获得上海中医药大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有存活手术均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南规定的无菌条件进行。通过使用适当的镇痛剂和抗生素来控制疼痛和感染风险，以确保手术成功。该手术程序针对12周龄、体重400 g的雄性Sprague-Dawley（SD）远交系大鼠进行了优化。

1. PVA-聚丙烯酰胺水凝胶的制备

注意：如图1G、1H所示，聚乙烯醇-聚丙烯酰胺水凝胶是一种吸水性高分子薄膜。在自然状态下，该凝胶极难切割成小块。制备方法如下所述。

1. 将聚乙烯醇-聚丙烯酰胺水凝胶置于水中浸泡24小时，使其充分吸水后更易于切割。
2. 使用自制切割工具（图1H）将整块水凝胶切成尺寸为2 mm × 2 mm × 2 mm的小块。
3. 将这些水凝胶小块转移至60 °C烘箱中干燥12小时，使其脱水收缩为尺寸约1 mm × 1 mm × 1 mm的植入材料。

2. 麻醉与准备

注意：在整个无菌手术过程中，务必佩戴手术帽、一次性医用口罩和无菌外科手套。

1. 将大鼠置于加热垫上，并在麻醉期间确保直肠温度维持在 37±1 °C。
2. 将大鼠放入充满 3% 异氟烷的麻醉舱中，持续 3 分钟。
3. 用镊子轻轻夹捏大鼠的四肢和脚趾，检测其是否失去回缩反应，以确认麻醉成功。
4. 将大鼠以俯卧位固定于手术台上，确保其四肢和头部牢固固定。
5. 将麻醉面罩固定在大鼠面部，通过标准大鼠鼻罩以氧气/空气混合气体输送 2% 异氟烷，维持大鼠在整个脊髓压迫手术过程中的麻醉状态。
6. 在大鼠与手术台之间放置一个圆柱形纱布垫（尺寸约为 30 mm × 20 mm × 60 mm）（图 1A），以确保手术全程气道通畅且手术区域充分暴露。
7. 使用电动剃须刀剃除大鼠颈部手术区域周围的毛发。
8. 涂抹脱毛膏以去除残留毛发，并暴露皮肤。
9. 使用碘伏对手术区域进行消毒。
10. 用带孔的无菌毛巾覆盖已消毒区域，仅暴露大鼠颈部背侧的手术区域。

3. 手术入路

1. 在体表定位第二颈椎棘突和第二胸椎棘突后，用手术刀从第二颈椎棘突至第二胸椎棘突沿背侧正中线做一纵行切口。
2. 用止血钳钝性分离两侧肌肉，逐层切开皮下组织和筋膜后暴露C2-T2椎板。
3. 在颈椎板上钻一个孔（1 mm × 1 mm） (图1B).
   注意：为避免对脊髓造成过度损伤，应保持大鼠颈部处于背侧弓形状态，以确保颈椎椎板之间有足够的空间。
4. 使用显微外科镊夹取一块尺寸为1 mm × 1 mm × 1 mm的PVA-聚丙烯酰胺水凝胶，插入先前钻好的孔中（图1C，1D). 
   注意：短暂性抽搐表现表明脊髓压迫模型已成功建立。
5. 使用三角针和5-0缝线，逐层缝合肌肉、筋膜、皮下组织及皮肤。
6. 消毒后，将动物转移回笼中并保持其温暖。
7. 术后每6小时皮下注射盐酸丁丙诺啡镇痛剂（0.03 mg/kg），持续3天，之后根据需要使用。

4. 术后管理

1. 每天一次向大鼠腹腔注射相当于 100,000 单位的青霉素，以预防术后感染并缓解疼痛。
2. 将大鼠转移至已持续用红外灯加热的新笼子中，以确保术后充分保温。
   注意：待大鼠意识恢复后，移除加热灯
3. 保持大鼠饲养笼的卫生与通风。
4. 每日协助大鼠进食和饮水两次。必要时进行膀胱按摩以帮助排尿，直至排尿功能恢复。

5. 行为学评估

1. 使用 Basso、Beattie 和 Bresnahan (BBB) 评分量表评估术后行为。
   ​注意：BBB 评分量表是评估大鼠脊髓相关功能的金标准（表 1），根据评分对大鼠运动功能进行评估，评分范围为 0（未观察到后肢运动）至 21（步态协调、脚趾间距一致、主要爪子位置在整个姿势中保持平行、躯干稳定性一致以及尾巴抬高程度一致）。

6. 握力测试

1. 使用电子握力计测量握力。
2. 抓住大鼠的后半部分使其悬空，并让其前肢抓住前部握力计的金属杆。
3. 当大鼠抓紧金属杆时，将其向后拉并记录握力值。
4. 每只大鼠测量三次握力，记录其中最高的一次数值。

7. 斜板试验

1. 将大鼠放置在带有可调节角度的橡胶板上。
2. 每次逐渐将倾斜板的角度增加 5°，直至大鼠能够保持平衡并稳定站立 5 秒。
3. 记录大鼠在倾斜板上能够保持平衡的最大角度。
4. 对每只大鼠测量三次最大角度，并记录其中的最高值。

8. 安乐死、脊髓分离和冷冻包埋

注意：为保护眼睛、面部及呼吸道免受多聚甲醛和甲醛气体的伤害，务必佩戴适当的护目镜和面罩/口罩。

1. 在暴露心脏前，向大鼠腹腔注射相当于10%水合氯醛的剂量以进行麻醉。
2. 将灌注针插入心脏心尖部位，用止血钳固定，并缓慢灌注生理盐水。
3. 在右心耳处钻孔，直至右心房流出清澈的生理盐水，表明灌注成功。
4. 当肝脏变为白色后，停止生理盐水灌注。
5. 灌注相当于10%多聚甲醛溶液，直至大鼠身体变僵硬。
6. 多聚甲醛灌注完成后，去除脊柱周围的皮肤、肌肉和软组织；分离颈椎C2-C7节段；并将该节段浸入10%多聚甲醛中，固定过夜。
7. 将颈段脊髓从脊柱中分离出来，依次置于10%、20%和30%的蔗糖溶液中进行梯度脱水。
8. 将高度为2 mm的压缩脊髓组织与OCT包埋剂一同放入-80 °C冰箱中冷冻。
9. 切片厚度为7 µm，染色后（H&E染色及dUTP缺口末端标记法（TUNEL）/神经元核抗原（NeuN）染色，见第9节），分别观察脊髓组织病理学变化及神经元凋亡情况。

9. TUNEL/NeuN 免疫染色

1. 将脊髓切片浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温下孵育10分钟，然后用含0.3% Triton X-100和5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭1小时。
2. 将脊髓切片与兔多克隆抗NeuN抗体（1:200稀释）在4 °C下孵育过夜。
3. 用PBS缓冲液清洗脊髓切片三次，随后在室温下与Alexa Fluor 594标记的二抗孵育2小时。 
4. 使用一步法TUNEL凋亡检测试剂盒（绿色荧光）对脊髓切片中的凋亡细胞核进行染色。

结果

脊髓压迫性损伤可能导致肢体神经肌肉功能障碍
随着水凝胶逐渐膨胀，对脊髓区域产生持续且长时间的压迫，从而模拟颈椎脊髓疾病引起的前肢功能障碍^8,10。在本模型中，模型组大多数大鼠（10只中的9只）均出现明显的同侧前爪挛缩（图2A）。进一步在带有网格线的纸上对前爪的长度和宽度进行测量与分析（图2B）。数据显示，术后1天，模型组同侧前爪的长度和宽度显著减小（P < 0.01）。然而，对照组与模型组之间的对侧前爪在长度和宽度上均未检测到显著差异（图2C）。

为评估术后肢体功能恢复及神经肌肉功能障碍程度，于术后第1、3、7、14、21和28天采用BBB评分量表、斜板实验和前肢抓握力实验进行观察。对符合正态分布的数据采用单因素或双因素方差分析，结合Tuke...

讨论

该手术的目标是产生可重复且持续时间较长的神经元凋亡 在大鼠脊髓中。该模型的一个关键优势在于可膨胀的水凝胶植入物能够对脊髓施加持续性压迫，从而引发渐进性的神经细胞凋亡反应（图 2C），这与脊髓型颈椎病（CSM）的病理过程一致。在本研究中，脊髓损伤所致的死亡率极低（约2/50），而该模型的可重复性 > 50 例中有 45 例。水凝胶片尺寸不当以及手术过程中剧烈植入可能引起脊髓急性损伤^12,13.

一项未发表的研究¹⁴发现，以350%的扩张率植入会导致暂时性和急性脊髓压迫症（CSM），并在数周内逐渐恢复。200%的扩张率则因植入物硬度高于脊髓组织，导致CSM模型中出现缓慢进行性瘫痪。然而，在本模型中，我们并不关注植入材料的硬度，而仅关注植入物的最终尺寸。4周后观察到脊髓表面出现压痕（图3A...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗生素软膏			预防伤口感染
Buprenorphine-SR			镇痛
异氟烷	Veteasy		麻醉
吸入式麻醉设备			麻醉
微型眼科镊	明仁医疗设备	长度：11 cm，头部直径：0.3 mm	夹持肌肉
眼科镊	上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂	JD1050	夹持皮肤
眼科剪刀（10 cm）	上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂	Y00030	皮肤切口
SD雄性大鼠	上海斯莱克实验动物有限责任公司	SCXK2018-0004	动物模型
无菌手术刀片（22#）	上海浦东金环医疗用品有限公司	35T0707	肌肉切口
小型动物剃毛器			脱毛
薇婷脱毛膏	RECKITT BENCKISER (India) Ltd		脱毛
维纳斯剪刀	明仁医疗设备	长度：12.5 cm	肌肉切口