半翅目昆虫肠道中植物病毒与昆虫媒介蛋白的免疫荧光标记

摘要

本实验方案可用于对离体昆虫肠道中的植物病毒蛋白和媒介昆虫蛋白进行免疫荧光标记，从而研究病毒与媒介昆虫之间的相互作用、昆虫蛋白功能以及病毒传播背后的分子机制。

摘要

自然界中大多数植物病毒通过半翅目昆虫在植株间传播。高效传播病毒的媒介昆虫若种群密度较高，是导致田间病毒病流行的关键因素。研究病毒与媒介昆虫之间的相互作用，有助于深入理解病毒的传播机制和流行规律，从而为设计防控植物病毒及其媒介昆虫的新策略提供依据。免疫荧光标记技术已被广泛用于分析病原体与宿主之间的相互作用，本文将其应用于能高效传播南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV，斐济病毒属 Fijivirus，呼肠孤病毒科 Reoviridae）的白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera），以定位病毒粒子和昆虫蛋白在中肠上皮细胞中的分布。利用激光共聚焦显微镜，我们研究了中肠上皮细胞的形态特征、昆虫蛋白的细胞定位，以及病毒粒子与某种昆虫蛋白的共定位情况。本实验方案可用于研究病毒在昆虫体内的活动、昆虫蛋白的功能，以及病毒与媒介昆虫之间的相互作用。

引言

大多数已描述的植物病毒由半翅目（Hemiptera）昆虫传播，其中包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马^1,2。半翅目昆虫具有刺吸式口器，可刺入植物组织以取食并分泌唾液，同时高效地传播病毒²。目前已描述了多种植物病毒由媒介昆虫传播的机制，包括非持久性传播、半持久性传播和持久性传播。其中，持久性传播又可分为非增殖型和增殖型^3,4。无论是哪种持久性传播类型，病毒都必须在昆虫体内进行系统性移动。在持久性增殖型传播模式中，病毒首先感染昆虫肠道的上皮细胞并在其中复制，随后扩散至不同组织，最终进入唾液腺；之后，病毒可通过昆虫取食时的唾液注入植物体内^5,6。持久性传播的病毒需穿越昆虫多个器官，并在其媒介体内复制，这一过程依赖于病毒与媒介昆虫组分在不同阶段的特异性相互作用^7,8。

病毒蛋白与昆虫蛋白必须相互作用，以促进病毒在媒介昆虫体内的识别、感染、复制或传播等关键过程

方案

1. 非传毒昆虫的饲养

1. 从稻田中采集褐飞虱（WBPH），并在28 °C、16小时光照和8小时黑暗的培养箱中，用1 L玻璃烧杯饲养，烧杯口覆盖防虫网，并以水稻幼苗作为食物来源。由于水稻条纹穗枯病毒（SRBSDV）不通过卵传播，新孵化的若虫不携带病毒。
2. 使用毛笔每周将成虫从饲养烧杯轻轻刷入装有新鲜水稻幼苗的新烧杯中，直至褐飞虱若虫孵化。继续饲养这些孵化出的无毒若虫至2龄或3龄阶段。
   ​注意：刷虫时应轻柔操作，避免褐飞虱飞离烧杯或造成机械损伤。

2. 病毒获取及带毒昆虫的采集

1. 将非带毒昆虫从玻璃烧杯转移到覆盖防虫网的感病水稻植株上，让其取食2天，进行病毒获毒获毒期（AAP）。随后，将昆虫收集到含有新鲜水稻幼苗的玻璃烧杯中。
2. 2天后，使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集昆虫，用于解剖并切除肠道。
   ​注意：SRBSDV在褐飞虱若虫和成虫中的最短获毒时间均为5分钟，但为达到高达80%的获毒效率，应让昆虫在新鲜的SRBSDV感病水稻植株上取食2天。

3. 试剂准备

1. 将8.5 g NaCl、3.5 g Na₂HPO₄·12H₂O和0.25 g NaH₂PO_4....

结果

图1 展示了本实验方案的全部步骤：昆虫饲养、病毒获取、肠道切除、免疫荧光标记以及制片。

成虫褐飞虱（WBPH）肠道被切除后，用4%（m/v）多聚甲醛固定，经2%（v/v）Triton X-100透化处理，随后与Dylight 633鬼笔环肽孵育^10,18。图2中的激光共聚焦显微图像显示了用鬼笔环肽标记后的离体肠道三个部分，分别为前肠、中肠和后肠。在这三个部分中，中肠是水稻条纹矮缩病毒（SRBSDV）的初始感染位点。肠道的单层上皮细胞结构有利于研究昆虫蛋白的细胞定位以及病毒蛋白与昆虫蛋白的共定位。

我们还切除了褐飞虱（WBPH）的肠道，并分别用Dylight 488（绿色）标记的抗VAMP7抗体和用Dylight 549（红色）标记的抗SRBSDV抗体对SRBSDV病毒颗粒进行孵育

讨论

为获得最佳结果，应考虑以下几个关键点。首先，总昆虫群体中带毒昆虫的比例需足够高。尽管白背飞虱若虫和成虫获毒最短获毒饲毒期（AAP）仅为5分钟¹⁷，但为了达到高达80%的获毒效率，应让昆虫在新鲜的SRBSDV感染水稻植株上饲毒2天。由于SRBSDV病毒粒子可在80%的中肠中被检测到¹⁸，本实验方案中，我们在2天AAP后的第2天解剖并标记带毒昆虫。其次，成虫和若虫的消化道前端连接头部的唾液腺，后端连接尾部的产卵器或交配器官。因此，可通过从头部或尾部牵拉的方式小心地将消化道完整取出。然而，操作人员需根据昆虫的大小选择合适的牵拉方法。成虫消化道可在去除头部后从尾部完整拉出；而若虫的消化道较为脆弱，若从尾部牵拉则容易断裂²⁰。更为可靠的方法是，在将消化道与尾部分离后，轻柔地从头部牵拉以取出若虫消化道。采用这些解剖/切除方法，可快速获得完整的消化道，并保持肠上皮细胞的天然超微结构。此外，飞虱的其他器官及体壁外壳未受破坏，从而维持了唾液腺、血淋巴等其他组织和器官的完整性，有利于进一步研究病毒的活动与相互作用<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 牛血清白蛋白（BSA）	Coolaber	SL1331	用于稀释抗体
盖玻片	Solarbio	YA0771-18*18mm	用于制片
体视显微镜	Beitja	XTL-7045B1	用于昆虫解剖
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	Zeiss LSM880	观察荧光信号
载玻片	Solarbio	ZBP-7105	用于制片
含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂	Abcam	AB104139	标记细胞核
多聚甲醛	Sigma	158127	用于组织固定
鬼笔环肽	Invitrogen	A22284	标记中肠上皮细胞的肌动蛋白
曲拉通 X-100	Amresco	0290C484	用于组织通透
镊子（5-SA）	AsOne	6-7905-40	用于昆虫解剖