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半翅目昆虫肠道中植物病毒与昆虫媒介蛋白的免疫荧光标记

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DOI：

10.3791/62605

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2021年5月14日

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1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

本文内容

摘要

本实验方案可用于对离体昆虫肠道中的植物病毒蛋白和媒介昆虫蛋白进行免疫荧光标记，从而研究病毒与媒介昆虫之间的相互作用、昆虫蛋白功能以及病毒传播背后的分子机制。

摘要

自然界中大多数植物病毒通过半翅目昆虫在植株间传播。高效传播病毒的媒介昆虫若种群密度较高，是导致田间病毒病流行的关键因素。研究病毒与媒介昆虫之间的相互作用，有助于深入理解病毒的传播机制和流行规律，从而为设计防控植物病毒及其媒介昆虫的新策略提供依据。免疫荧光标记技术已被广泛用于分析病原体与宿主之间的相互作用，本文将其应用于能高效传播南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV，斐济病毒属 Fijivirus，呼肠孤病毒科 Reoviridae）的白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera），以定位病毒粒子和昆虫蛋白在中肠上皮细胞中的分布。利用激光共聚焦显微镜，我们研究了中肠上皮细胞的形态特征、昆虫蛋白的细胞定位，以及病毒粒子与某种昆虫蛋白的共定位情况。本实验方案可用于研究病毒在昆虫体内的活动、昆虫蛋白的功能，以及病毒与媒介昆虫之间的相互作用。

引言

大多数已描述的植物病毒由半翅目（Hemiptera）昆虫传播，其中包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马1,2。半翅目昆虫具有刺吸式口器，可刺入植物组织以取食并分泌唾液，同时高效地传播病毒2。目前已描述了多种植物病毒由媒介昆虫传播的机制，包括非持久性传播、半持久性传播和持久性传播。其中，持久性传播又可分为非增殖型和增殖型3,4。无论是哪种持久性传播类型，病毒都必须在昆虫体内进行系统性移动。在持久性增殖型传播模式中，病毒首先感染昆虫肠道的上皮细胞并在其中复制，随后扩散至不同组织，最终进入唾液腺；之后，病毒可通过昆虫取食时的唾液注入植物体内5,6。持久性传播的病毒需穿越昆虫多个器官，并在其媒介体内复制，这一过程依赖于病毒与媒介昆虫组分在不同阶段的特异性相互作用7,8。

病毒蛋白与昆虫蛋白必须相互作用，以促进病毒在媒介昆虫体内的识别、感染、复制或传播等关键过程9,10。尽管光学显微镜可用于观察昆虫的细胞结构，但它无法显示病毒粒子的分布、病毒蛋白与昆虫蛋白在细胞内的定位或共定位，也无法揭示昆虫组织和细胞的超微结构。免疫荧光标记技术最早由 Coons 等人在小鼠的吞噬细胞中通过荧光素标记特异性抗体实现，现已被广泛应用11。该技术又称荧光抗体技术，是最早发展的免疫标记技术之一，其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合反应11,12。首先将已知抗体用荧光素标记，作为探针用于检测细胞或组织中的相应抗原13,14。当荧光素标记的抗体与细胞或组织中的相应抗原结合后，在特定激发波长照射下，通过荧光显微镜观察可使探针发出明亮的荧光，从而实现对抗原的定位15。

大多数植物病毒的传播介体昆虫属于半翅目。当传播效率高的介体昆虫种群密度较高时，可能导致植物病毒病的流行5。南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV，斐济病毒属 Fijivirus，呼肠孤病毒科 Reoviridae）是水稻最严重的病原体之一，自2010年以来已迅速蔓延至东亚和东南亚的水稻种植区，并造成严重的产量损失16,17。白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera Horváth）的成虫和若虫均能以持久增殖型方式高效传播SRBSDV。田间研究表明，由SRBSDV引起的水稻黑条矮缩病暴发通常与白背飞虱的大规模远距离迁飞同步，这是SRBSDV流行的关键因素7,8,18。囊泡相关膜蛋白7（VAMP7）是一种可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE），可通过囊泡融合介导物质运输。体外实验表明，VAMP7可与SRBSDV的外层主要衣壳蛋白相互作用，提示VAMP7可能与病毒的传播密切相关16。

在本方案中，我们以携带病毒的白背飞虱为材料，切除其肠道，用于标记中肠上皮细胞中的SRBSDV病毒粒子和VAMP716作为病毒的初始侵入部位，中肠上皮在病毒感染、复制和传播过程中发挥着至关重要的作用。首先，我们详细描述了从中若虫和成虫中分离肠道的步骤 WBPHs。其次，我们使用特异性的荧光素标记抗体对SRBSDV病毒粒子和肠道上皮细胞中的VAMP7进行标记，随后通过激光扫描共聚焦显微镜观察上皮细胞以及病毒粒子和VAMP7的细胞定位。结果显示，SRBSDV病毒粒子与VAMP7可在中肠上皮细胞的细胞质中发生共定位，提示VAMP7的特定功能可能与病毒粒子从中肠上皮细胞的扩散过程相关。

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方案

1. 非传毒昆虫的饲养

  1. 从稻田中采集褐飞虱（WBPH），并在28 °C、16小时光照和8小时黑暗的培养箱中，用1 L玻璃烧杯饲养，烧杯口覆盖防虫网，并以水稻幼苗作为食物来源。由于水稻条纹穗枯病毒（SRBSDV）不通过卵传播，新孵化的若虫不携带病毒。
  2. 使用毛笔每周将成虫从饲养烧杯轻轻刷入装有新鲜水稻幼苗的新烧杯中，直至褐飞虱若虫孵化。继续饲养这些孵化出的无毒若虫至2龄或3龄阶段。
    ​注意：刷虫时应轻柔操作，避免褐飞虱飞离烧杯或造成机械损伤。

2. 病毒获取及带毒昆虫的采集

  1. 将非带毒昆虫从玻璃烧杯转移到覆盖防虫网的感病水稻植株上，让其取食2天，进行病毒获毒获毒期（AAP）。随后，将昆虫收集到含有新鲜水稻幼苗的玻璃烧杯中。
  2. 2天后，使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集昆虫，用于解剖并切除肠道。
    ​注意：SRBSDV在褐飞虱若虫和成虫中的最短获毒时间均为5分钟，但为达到高达80%的获毒效率，应让昆虫在新鲜的SRBSDV感病水稻植株上取食2天。

3. 试剂准备

  1. 将8.5 g NaCl、3.5 g Na2HPO4·12H2O和0.25 g NaH2PO4溶解于1 mL ddH2O中，以制备0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）。
  2. 将4 g多聚甲醛加入100 mL PBS中，以制备4%（m/v）的多聚甲醛PBS溶液。
  3. 将2 mL Triton X-100加入98 mL PBS中，以制备2%（v/v）的Triton X-100溶液。

4. 成虫解剖及肠道切除

  1. 使用移液器将 100 µL PBS 滴加到载玻片上。将载玻片置于光学显微镜的载物台上。
  2. 使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集感染 SRBSDV 的成虫，并将其放入 1.5 mL 离心管中。将离心管置于冰上以麻痹昆虫，然后将一只麻痹的成虫腹部朝上转移至载玻片上的 100 µL PBS 中。
    注意：昆虫在冰上放置 5 分钟后将完全麻痹。
  3. 一只手用镊子夹住虫体，另一只手用另一把镊子去除头部。
  4. 用一把镊子夹住腹部两侧，另一把镊子夹住尾部的产卵器或交配器官，然后小心缓慢地拉开一个腹节的节间膜，暴露出腹部内的肠道。
  5. 继续撕开节间膜，逐渐将完整的肠道从腹部拉出。轻柔地拉掉与肠道末端相连的尾部，以取出完整的肠道。
    注意：操作时务必非常小心，否则肠道容易受损。
  6. 将取出的肠道放入 200 µL 离心管中，加入 200 µL PBS，用移液器轻轻吹吸溶液，充分清洗肠道。

5. 若虫解剖及肠道切除

注意：若虫的身体比成虫更脆弱，从尾部拉取时肠道容易受损。因此，最可靠的若虫肠道分离方法是从头部进行拉取。

  1. 使用移液器将 100 µL PBS 滴加到玻璃载玻片上。将载玻片置于光学显微镜的载物台上。
  2. 使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集感染 SRBSDV 的若虫，并将其放入 1.5 mL 离心管中。将离心管置于冰上以麻痹昆虫。然后将一只麻痹的若虫转移至载玻片上的 100 µL 缓冲液中，使腹部朝上。
  3. 使用镊子剪除若虫的尾部。随后用一对镊子夹住虫体以轻柔固定，并用另一对镊子夹住头部。在保持头部与肠道连接的前提下，轻柔地将头部从身体上拉开，使头部与身体分离，但肠道仍附着于胸部和腹部。
    注意：头部脱离后，若虫的脂肪体将流出，导致 PBS 变浑浊。应移除浑浊的 PBS 溶液，并更换为 100 µL 新鲜 PBS。
  4. 在继续用镊子夹住虫体的同时，使用另一对镊子小心移动头部，并逐步将肠道拉出。
  5. 用镊子将肠道从头部轻柔分离，最终获得一个完整的肠道，且不损伤飞虱虫体。
  6. 将分离的肠道放入 200 µL 离心管中，向管中加入 200 µL PBS，并用移液器轻轻吸打溶液，以充分清洗肠道。
    ​注意：分离的肠道应使用 PBS 充分清洗，以去除腹腔中可能污染的脂肪组织；这些组织可能干扰染色实验流程。

6. SRBSDV 病毒粒子及一种昆虫蛋白的标记方案

  1. 准备本实验所用的抗体和封片剂。抗体包括：用 Dylight 549（红色）标记的抗 SRBSDV 抗体（针对 SRBSDV 病毒粒子）18，用 Dylight 488（绿色）标记的抗昆虫蛋白 VAMP7 抗体16,19，Dylight 633 标记的鬼笔环肽（蓝色），以及含 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的封片剂。
  2. 将新解剖并用 PBS 洗涤过的褐飞虱肠道立即放入含有 100 µL 4%（m/v）多聚甲醛的 200 µL 离心管中，室温固定 2 小时。
    注意：新解剖的褐飞虱肠道不应在 PBS 中浸泡过久，否则上皮细胞会受损。
  3. 用移液器吸除 4%（m/v）多聚甲醛，然后向 200 µL 离心管中加入 200 µL PBS。10 分钟后，用移液器吸除 PBS 以去除残留的多聚甲醛。
  4. 重复 PBS 洗涤步骤两次。
  5. 吸除 PBS，加入 200 µL 非离子型去垢剂 Triton X-100（2%，v/v），在室温下透化样本 30 分钟。
  6. 用移液器吸除 2%（v/v）Triton X-100，然后用 200 µL PBS 洗涤三次，每次 10 分钟，以去除残留去垢剂（参见步骤 6.3 和 6.4）。
  7. 用 50 µL 牛血清白蛋白（3%，m/v）将 Dylight 549（红色）标记的抗-SRBSDV 抗体和 Dylight 488（绿色）标记的抗-VAMP7 抗体按 1:50 比例稀释。
  8. 将稀释后的抗体加入离心管中，4 °C 过夜孵育。
  9. 用移液器吸除抗体稀释液，然后用 200 µL PBS 洗涤三次，每次 10 分钟，以去除未结合的抗体。
  10. 将 1 µL Dylight 633 标记的鬼笔环肽用 50 µL PBS 稀释。
  11. 向离心管中加入 50 µL 稀释后的鬼笔环肽，室温孵育 2 小时。
  12. 用移液器吸除鬼笔环肽稀释液，然后用 200 µL PBS 洗涤三次，每次 10 分钟，以去除未结合的鬼笔环肽。
    注意：充分洗涤对降低背景信号和非特异性结合至关重要。
  13. 在载玻片上滴加一滴含 DAPI 的封片剂，将肠道转移至封片剂中。
    注意：用镊子轻轻展开每一段肠道，避免产生气泡。每张载玻片约放置 15 段肠道。
  14. 轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。
    注意：载玻片应置于 4 °C 避光保存，以防止荧光淬灭，待激光共聚焦显微镜观察前使用。
  15. 使用激光共聚焦显微镜观察所有样本。用蓝光激发采集图像，并将文件保存至计算机。

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结果

图1 展示了本实验方案的全部步骤：昆虫饲养、病毒获取、肠道切除、免疫荧光标记以及制片。

成虫褐飞虱肠道被切除后，用4%（m/v）多聚甲醛固定，2%（v/v）Triton X-100透化处理，随后与Dylight 633鬼笔环肽孵育10,18。图2中的激光共聚焦显微图像显示了经鬼笔环肽标记后被切除肠道的三个部分，分别为前肠、中肠和后肠。在这三个部分中，中肠是水稻条纹穗枯病毒（SRBSDV）的初始感染位点。肠道的单层上皮细胞结构有利于研究昆虫蛋白的细胞定位以及病毒蛋白与昆虫蛋白的共定位。

我们还切除了褐飞虱（WBPH）的肠道，并分别将其与Dylight 488（绿色）标记的抗VAMP7抗体以及用Dylight 549（红色）标记的抗SRBSDV抗体的SRBSDV病毒颗粒进行孵育

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讨论

为获得最佳结果，应考虑以下几个关键点。首先，总昆虫群体中带毒昆虫的比例需足够高。尽管白背飞虱若虫和成虫获毒最短获毒饲毒期（AAP）仅为5分钟17，但为了达到高达80%的获毒效率，应让昆虫在新鲜的SRBSDV感染水稻植株上饲毒2天。由于SRBSDV病毒粒子可在80%的中肠中被检测到18，本实验方案中，我们在2天AAP后的第2天解剖并标记带毒昆虫。其次，成虫和若虫的消化道前端连接头部的唾液腺，后端连接尾部的产卵器或交配器官。因此，可通过从头部或尾部牵拉的方式小心地将消化道完整取出。然而，操作人员需根据昆虫的大小选择合适的牵拉方法。成虫消化道可在去除头部后从尾部完整拉出；而若虫的消化道较为脆弱，若从尾部牵拉则容易断裂20。更为可靠的方法是，在将消化道与尾部分离后，轻柔地从头部牵拉以取出若虫消化道。采用这些解剖/切除方法，可快速获得完整的消化道，并保持肠上皮细胞的天然超微结构。此外，飞虱的其他器官及体壁外壳未受破坏，从而维持了唾液腺、血淋巴等其他组织和器官的完整性，有利于进一步研究病毒的活动与相互作用<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：31630058，授予 X.W.；项目编号：31772134，授予 W.L.）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3% 牛血清白蛋白（BSA）CoolaberSL1331用于稀释抗体
盖玻片SolarbioYA0771-18*18mm用于制片
体视显微镜BeitjaXTL-7045B1用于昆虫解剖
激光扫描共聚焦显微镜ZeissZeiss LSM880观察荧光信号
载玻片SolarbioZBP-7105用于制片
含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂AbcamAB104139标记细胞核
多聚甲醛Sigma158127用于组织固定
鬼笔环肽 InvitrogenA22284标记中肠上皮细胞的肌动蛋白
曲拉通 X-100Amresco0290C484用于组织通透
镊子（5-SA）AsOne6-7905-40用于昆虫解剖

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