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大鼠单侧坐骨神经 crush 损伤后运动行为的多因素评估

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DOI：

10.3791/62606

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2021年7月31日

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1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

本文内容

摘要

我们提供了一种通过行为测试组合对大鼠坐骨神经 crush 损伤后运动行为进行评估的实验方案。

摘要

外周神经损伤的诱导是神经科学领域广泛使用的一种方法，用于评估修复机制和疼痛机制等。此外，在运动障碍研究领域，坐骨神经挤压损伤已被用于在具有遗传易感性的肌张力障碍 DYT-TOR1A 啮齿类动物模型中诱发类似肌张力障碍的表型。为了在坐骨神经挤压损伤后获得一致、可重复且可比较的结果，除标准化的表型特征描述外，建立诱导神经挤压的标准化方法至关重要。不仅需要关注特定的行为学测试组合，还需重视技术要求、正确操作以及后续的数据分析。本实验方案详细描述了如何实施坐骨神经挤压损伤，并提供了一套用于评估大鼠运动功能障碍的行为学测试组合，包括开放场地实验、CatWalk XT 步态分析、横梁行走任务和梯状杆行走任务。

引言

啮齿类动物是通过在多个生物学层面上验证假设来深入理解人类疾病的优秀模式生物1,2。对啮齿类动物模型进行表征的一个基本生物学层面是表型层面，可通过行为学评估来测定。根据动物模型和具体的科学问题，选择一套高效且可靠的行为学测试组合对于涵盖广泛的行为特征至关重要，例如帕金森病和肌张力障碍的动物模型3,4,5,6。

坐骨神经是人体最大的神经，含有运动纤维和感觉纤维。坐骨神经损伤可由多种事件引起，例如交通事故和手术7,8。因此，利用坐骨神经损伤啮齿类动物模型开展的研究具有重要的转化应用价值。尽管从大鼠到人类的神经再生研究在转化意义上需谨慎对待9，但啮齿类动物模型中的坐骨神经压榨损伤（轴突失神经，axonotmesis）是一种常用方法，用于分析周围神经的变性和再生过程10,11。在压榨损伤情况下，神经并未完全横断，而是损伤了轴突，导致损伤后立即出现传导阻滞，随后启动再生过程4,12,13。

此外，在肌张力障碍研究中，单侧坐骨神经挤压损伤是一种已确立的方法，可用于在具有遗传易感性的肌张力障碍啮齿类动物模型中诱发类似肌张力障碍的运动（DLM），而这些模型本身并不表现出DLM4,14。人们认为，外周神经创伤会影响负责运动和感觉功能的坐骨神经纤维，从而破坏感觉运动整合15。

本文详细描述了一种标准化的坐骨神经挤压损伤模型，以及一系列运动行为评估方法，包括旷场实验（OFT）、CatWalk XT 步态分析、横梁行走任务和梯格行走任务，用于评估正常野生型（wt）大鼠（n= 8-9）及单侧坐骨神经挤压损伤后五周的野生型大鼠（n= 10）。旷场实验可提供有关总体运动活动能力的信息，而详细的步态分析则通过自动步态分析系统 CatWalk XT 实现。横梁行走任务通过评估大鼠穿越横梁所需时间及足部放置错误次数来检测运动协调性。梯格行走任务用于分析步态表现，可提供动物在具有恒定但不规则梯格排列的水平梯格装置上行走时的足部或爪部放置位置及错误信息。

方案

所有动物实验均经德国下弗兰肯行政区地方政府（德国维尔茨堡）批准，并依照适用的国际、国家和/或机构关于动物护理与使用的指南进行。

1. 坐骨神经压伤

注意：整个手术过程中需保持无菌环境。准备手术台并配备必要的器械。

  1. 在密闭柜中使用3.0%异氟烷（O2，2 L/min）对大鼠进行深度麻醉。将大鼠从柜中取出，剃除右后肢较大范围的毛发。
  2. 将大鼠置于麻醉面罩下，继续以2.0%异氟烷（O2，2 L/min）维持深度麻醉。通过夹捏后肢脚趾间的蹼部来监测麻醉深度，若无回缩反射，则表明麻醉深度足够。
  3. 用胶带固定大鼠躯干及双侧后肢，将双侧后肢对称伸展，足掌平贴于手术台面。
  4. 在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。用消毒剂对已剃毛区域的皮肤进行消毒。
  5. 寻找髂骨上的坐骨切迹。
  6. 使用手术刀从坐骨切迹沿向足部方向做皮肤切口，切口应尽可能小（约1至2 cm）。
  7. 若后肢固定良好且皮肤切口位置正确，则可在臀大肌与股二头肌之间的筋膜平面观察到一个类似"白线"的腔隙。将闭合的超细止血钳（5号）插入该腔隙并张开钳子，筋膜平面应被顺利分离而无任何肌肉组织损伤。
  8. 将橡胶带牵开器置于肌肉下方，以保持皮肤切口开放。
  9. 轻柔地清除坐骨神经周围的组织和血管，直至神经完全暴露。在整个操作过程中，切勿牵拉或拉伸神经。
  10. 使用无齿钳（超细止血钳）以恒定且可重复的压力夹伤坐骨神经。具体操作为：打开止血钳，将神经置于钳底端，然后将钳子锁闭至第一档，持续10秒，重复三次。夹伤部位应位于靠近坐骨切迹处，且在主坐骨神经干分叉点的近端。夹伤后小心打开止血钳，此时坐骨神经的损伤部位呈现半透明状。
  11. 移除橡胶带牵开器。
  12. 使用可吸收的4-0缝线缝合筋膜平面切口，使用皮肤钉闭合皮肤切口。
  13. 根据GV-SOLAS指南，术后每24小时皮下注射一次Rimadyl（5 mg/kg体重），连续两天，用于术后镇痛。
  14. 将大鼠从手术装置中移出，放入无垫料的清洁笼中，并置于加热板（37 °C）上直至苏醒，随后将其转移回清洁的饲养笼中。
  15. 术后4至6天拆除皮肤钉。

2. 开放旷场实验（OFT）

注意：旷场实验（OFT）可用于分析运动活动以及行为活动。

  1. 设置
    1. 在黑暗且安静的环境中设置旷场实验装置（OFT）（图1A）。该装置包括自动化视频追踪系统 EthoVision XT（含计算机、带许可证的软件）以及一个尺寸为 58.5 cm（长）× 58.5 cm（宽）× 45 cm（高）的实验箱，其表面为抗刮擦、可清洁的黑色材质。黑色表面对于提高追踪白色动物时的对比度至关重要。
  2. 评估
    1. 将实验箱和摄像机放置在正确位置。调整摄像机，使其以最佳分辨率完整记录整个旷场箱体。实验应在黑暗环境中进行。若设置需要光照，应使用小型且漫射的光源，以避免在实验箱内产生光斑、反光或阴影。通过使用照度计测量实验箱不同区域的照度，确保光照条件均匀一致。
    2. 设置 EthoVision XT 软件。以下列出最重要的参数设置：实验设置中，视频源选择实时追踪，追踪特征选择中心点检测；在实验箱设置中确认实验箱尺寸；在试验控制设置中，将数据采集的起始条件设为大鼠放入实验箱中央后三秒，总运行时间设为五分钟；在检测设置中，方法选择静态减影；在采集设置中，勾选保存视频作为方法。
    3. 将大鼠轻柔地放置于测试实验箱的中央（图1B）。
    4. 点击采集控制中的开始试验按钮以启动记录。
    5. 记录过程中，应远离 OFT 装置，以避免干扰大鼠行为。
    6. 每次试验结束后，轻柔地将大鼠移出测试实验箱，并使用 0.1% 乙酸清洁装置，以消除先前测试大鼠留下的气味干扰。
  3. 数据分析
    1. 使用 EthoVision XT 软件对 OFT 数据进行分析时，进入左侧边栏的分析部分，在结果选项卡下选择轨迹可视化（图1C）。随后将所需参数导出至 Excel。在软件中，从不同类别中选择多个变量用于数据分析。针对本研究特定科学目标的重要变量包括“"移动距离"”和“"速度"”，位于“"距离与时间"”类别下。对所选参数进行统计分析（图1D）。

3. CatWalk XT 步态分析

注意：通过 CatWalk XT 系统进行步态分析可帮助评估动物模型足迹、站立和步态相关的多种不同参数。该系统利用绿色光源照射玻璃行走通道，动物足印散射的光由位于通道下方的高速摄像机捕获。所获得的信号可通过 CatWalk XT 软件进行分析。

  1. 设置
    1. 使用 CatWalk XT 进行步态分析时，需配备 CatWalk 系统及相应的软件（计算机、带许可证的软件）（图 2A）。
    2. 实验应在黑暗条件下进行，因为 CatWalk 系统的数据采集依赖于绿色 LED 光对行走通道的照明。为便于在黑暗条件下操作，可用红光照明实验房间。
    3. 使用长度为 65 cm、宽度为 7 cm 的固定行走通道；但通道尺寸应根据大鼠体型进行调整。应尽可能设置较大的通道，以便为每只脚采集尽可能多的足印。
    4. 每次运行中，每只脚至少需采集三个足印。在确定通道长度时，需考虑大鼠的身体和尾巴，因为在运行开始前或结束后，若身体或尾巴进入或停留在定义的行走通道上，可能导致起始或终止信号无法被正确检测，从而使运行未被归类为有效运行。
  2. 训练
    ​注意：对大鼠进行 CatWalk 系统训练是必要的，以使动物适应实验装置，并学会无中断地穿越行走通道。充分的训练有助于在正式实验评估中节省时间并获得更可靠的结果。在训练期间即开始使用 CatWalk 系统进行数据采集，可使大鼠逐步适应评估环境（噪音/光照）。
    1. 开始设置 CatWalk 系统。
      1. 用蒸馏水和无绒软布清洁玻璃行走通道。在实验开始前、结束后，或玻璃通道变脏时，使用玻璃清洁剂和无绒软布进行清洁。使用清洁剂后，应彻底清除残留物，以免干扰动物行为。
      2. 选择实验参数。一个关键参数是运行标准。根据具体研究项目，设定合适的最小运行时长、最大运行时长和需采集的有效运行最小次数。勾选使用最大允许速度变化选项并设定相应数值。在训练的前四至五天内，可忽略运行标准。
      3. 将相机放置到位并调节焦距。找到最佳相机位置，以同时实现合适的通道长度和足印图像的最佳分辨率。在 CatWalk 系统上标记相机位置，以确保各次记录中相机位置一致。
      4. 使用新实验的自动检测功能设置检测参数。确保所有足印均可被检测，同时背景噪声最小。如有必要，手动优化检测参数并调整绿色强度阈值。整个实验过程中应使用相同的检测设置。
      5. 设置 CatWalk 系统的通道侧壁。侧壁应尽可能贴近大鼠，并确保其与行走通道保持平行。
      6. 定义行走通道长度：点击定义行走通道图标。根据具体研究项目调整白色矩形的长度和宽度，然后点击确定。
      7. 校准行走通道：点击校准行走通道图标。将一张 20 × 10 cm 的矩形校准板置于通道中央，调整白色矩形与校准板对齐，然后点击确定。
      8. 接下来拍摄背景图像：首先确认行走通道清洁且无动物。点击拍摄背景按钮以生成背景图像。
    2. 在正式实验开始前，至少对动物进行八天的训练。建议连续多日进行训练。
      1. 训练第 1 天：为使大鼠适应 CatWalk 系统，允许动物自由探索行走通道和目标箱。让大鼠练习穿越通道并进入目标箱。在通道末端或目标箱内将大鼠拾起，并送回通道起点。建议第一天进行五次运行，无需符合实验参数要求。
      2. 训练第 2 天：允许大鼠自由探索行走通道和目标箱。建议进行五次运行，无需符合实验参数要求。
      3. 训练第 3 天：建议进行八次运行，无需符合实验参数要求。
      4. 训练第 4 天：建议进行十次运行，无需符合实验参数要求。
      5. 训练第 5 天：建议进行十次运行。应开始考虑实验参数要求，并激励大鼠无中断地穿越通道。
      6. 训练第 6 天：建议进行十次运行。应继续遵循实验参数要求，并激励大鼠无中断地穿越通道。
      7. 训练第 7 天：建议进行十次运行。应至少获得三次有效运行。若动物未达到此目标，应增加运行次数。
      8. 训练第 8 天：建议进行十次运行。应至少获得三次有效运行。若动物未达到此目标，应增加运行次数。
  3. 评估
    1. 根据设定的运行标准，每只大鼠至少完成三次有效运行用于数据分析。进行评估时，请参照训练部分所述的步骤 3.2.1 至 3.2.1.8。即使大鼠在前三次运行中已达到三次有效运行，出于训练目的，每次评估会话（每周）仍应至少进行六次运行。
    2. 对于多时间点实验，为获得稳定的步态模式，每周至少应进行一次（训练）会话，每次六次运行。整个实验过程中，实验参数和检测设置应保持一致。
  4. 数据分析
    1. 数据分析时，仅评估有效运行，删除无效运行。
    2. 必要时，在足印分类前验证并调整绿色强度阈值。所有动物和所有运行的绿色强度阈值必须保持一致。
    3. 使用 CatWalk XT 软件自动分类足印（图 2B）。
    4. 手动检查足印标签。纠正错误的足印标签，补充未检测到的足印标签，并手动删除噪声和错误标签。将视频移动至需手动检查的位置。若需更正错误标签，选择对应足印的矩形区域，点击重置，再次选择该矩形，并从列表中分配正确标签。若需标注未检测到的足印，在未检测足印周围绘制矩形，点击添加足印，选择新生成的矩形，并分配正确标签。若软件自动标注了鼻部或身体印记，选择对应标签的矩形区域，点击删除足印。
    5. 检查数值结果。数值结果以 Excel 表格形式显示，包含多个基础参数。根据研究需求选择预定义的特定参数，并进行常规统计分析（图 2D）。
    6. 如需获取每个足印的更详细信息，可对后肢足印进行脚趾分类。此分析需要使用交互式足印测量模块。
      1. 必要时，为交互式足印测量分析调整绿色强度阈值。所有动物和所有运行的绿色强度阈值必须保持一致。
      2. 手动设置足印分析的标记点。分析所有三次有效运行中的每个后肢足印。从第一脚趾中心到第五脚趾中心画线，测量"脚趾展开度"。从第二脚趾中心到第四脚趾中心画线，测量"中间脚趾展开度"。从第三脚趾中心到后肢脚跟画线，测量"手动足印长度"（图 2C）。
      3. 检查在单独表格中显示的"交互式足印测量"数值结果。选择"交互式足印测量"中的特定参数，并进行常规统计分析（图 2E）。

4. 束线行走实验

注意：步态缺陷可通过横梁行走实验来确定。本研究主题中的横梁行走实验将侧重于运动协调性的分析，运动协调性定义为协调多个身体部位肌肉激活的能力，而非运动平衡能力的评估，后者定义为身体运动过程中姿势控制的能力。

  1. 实验准备
    1. 进行横梁行走实验时，需使用横梁、间隔器、实验台、均匀背景和摄像机（图3A）。
    2. 使用一根长90 cm、宽1.7 cm、高2 cm的木质横梁。建议在横梁两端设置平台，平台尺寸为长20.5 cm、宽15 cm、高2 cm。平台与横梁应使用相同材质，且平台与横梁之间不应有任何 障碍物。
    3. 横梁与实验台之间的距离应至少为44 cm。将大鼠熟悉的环境（如饲养笼）置于横梁末端的平台上，可激励大鼠穿越横梁。
  2. 训练
    1. 在实验台上安装横梁、间隔器和饲养笼。
    2. 对动物进行为期七天的训练。建议连续多日进行训练。
      1. 训练第1天
        1. 将一个饲养笼中的所有大鼠放置在横梁的起始平台上。
        2. 让大鼠自由探索环境（平台/横梁）。
        3. 小心地抓住大鼠尾巴，轻推其身体，引导其走上横梁。
        4. 通过抓住大鼠尾巴的方式协助其完成至少两次横梁穿越。
        5. 让大鼠在无辅助情况下再完成三次横梁穿越。观察大鼠行为，必要时提供帮助。若大鼠无法完成穿越，应接住其下落以避免受伤，并防止其产生对穿越横梁的恐惧。
        6. 对所有大鼠重复上述操作。
          注意：有时大鼠会相互跟随穿越横梁，此时无需辅助。但必须持续观察大鼠，必要时接住下落并提供帮助。
      2. 训练第2天
        1. 将一个饲养笼中的所有大鼠放置在横梁的起始平台上。
        2. 让每只大鼠完成六次横梁穿越。
        3. 必要时提供辅助并接住下落。
      3. 训练第3天
        1. 将一只大鼠放置在横梁的起始平台上。
        2. 让该大鼠完成六次横梁穿越。
        3. 必要时提供辅助并接住下落。
      4. 训练第4–7天
        1. 将一只大鼠放置在横梁的起始平台上。
        2. 让该大鼠完成十次横梁穿越。
        3. 必要时提供辅助并接住下落。
        4. 训练结束时，大鼠应能连续无中断地完成至少三次横梁穿越。允许在起始平台上轻推大鼠以启动运动。
  3. 评估
    1. 在实验台上安装横梁、间隔器和饲养笼。
    2. 将摄像机置于合适位置，使其与横梁平行并对准动物。摄像机应尽可能靠近动物，以获得最佳运动记录分辨率。录像应包含横梁及两端平台的部分区域。
    3. 开始录像，并首先标识实验阶段和动物编号。
    4. 将大鼠放置在横梁的起始平台上。
    5. 大鼠应连续无中断地完成三次横梁穿越。即使大鼠在前三次尝试中已达到三次合格运行，仍需完成至少六至十次运行，以评估任务的持续表现能力。
    6. 始终观察动物，必要时接住下落。
    7. 任务完成后，使用0.1%乙酸清洁横梁和实验台，以避免前一只大鼠的气味干扰后续实验。
      注意：坐骨神经 crush 损伤后的前两周内，大鼠无法在无辅助情况下完成横梁穿越。因此，在损伤后前两周需提供六至八次辅助运行。从第三周到第五周，先进行五次辅助运行，再进行十次无辅助运行。
  4. 数据分析
    1. 使用免费视频分析软件 Kinovea 进行数据分析。
    2. 从录像中选取三次合格运行的视频片段。应选择动物在无辅助情况下完成的前三次合格运行。所有大鼠的合格运行选择标准应保持一致。
    3. 定义所选三次合格运行的起始时间和结束时间（图3D-E）。在本实验设置中，横梁上的一条黑线标记为起点，当后肢首次完全越过黑线时定义为运行起始时间点；当后肢首次踏上横梁末端平台时定义为运行结束时间点。
    4. 计算大鼠穿越横梁所需时间。以穿越横梁的潜伏期（秒）表示数据，并按常规进行统计分析（图3B）。
    5. 使用软件的放大和慢放功能，分别统计左右后肢在三次合格运行中的步数和错误次数。错误包括完全足滑（total foot slips）和半足滑（half foot slips）。完全足滑定义为足部放置后发生明显滑动，导致患肢与横梁完全失去接触（图3F）；半足滑定义为足部沿横梁侧壁滑出，但未完全脱离横梁接触（图3G）。
    6. 计算足滑次数占总步数的百分比（（肢体足滑次数 × 100%）/ 同一肢体步数）。以足滑百分比表示数据，并按常规进行统计分析（图3C）。

5. 梯子踏步行走任务

注意：梯子步行任务可用于评估运动功能、前肢和后肢的放置以及肢体间的协调性。

  1. 设置
    1. 使用梯子横档装置、间隔器、实验台、均匀背景和摄像机进行此项行为学测试（图4A）。水平梯子横档装置由金属横档和透明聚碳酸酯侧壁组成。该装置长度为119.5 cm，宽度调整为7.4 cm。待分析的行走区域长度为100 cm。
    2. 在侧壁上用黑线标记起点和终点。在装置上以1 cm的间隔为横档设置占位符。在100 cm的行走区域中，将横档排列成不规则模式，横档间距为1至5 cm。装置起始端前10 cm和末端后9.5 cm（不纳入分析区域）的横档采用规则排列，间距为1 cm。
    3. 行走区域与实验台之间的距离约为30 cm（图4A-B）。在装置末端设置目标箱或熟悉环境（如饲养笼），以激励大鼠穿越梯子横档装置。
  2. 训练
    1. 在实验台上安装梯子横档装置、间隔器和目标箱。
    2. 对动物进行为期八天的训练。建议连续多日进行训练。
      1. 训练第1天
        1. 将同一饲养笼中的所有大鼠放置于梯子横档装置的起点。
        2. 让大鼠探索环境（梯子横档装置/目标箱）。
        3. 轻柔地推动大鼠朝目标箱方向移动，并在必要时协助其进入目标箱。让大鼠在目标箱内探索一段时间。
        4. 待所有大鼠进入目标箱后，取出第一只大鼠并再次将其放回装置的起始区域。对同一只饲养笼中的其余大鼠重复相同操作。必要时轻柔推动大鼠并协助其进入目标箱。
        5. 让每只大鼠穿越装置四次。
      2. 训练第2天
        1. 执行与训练第1天相同的实验流程。
        2. 让每只大鼠穿越装置六次。
      3. 训练第3天
        1. 执行与训练第1天相同的实验流程。
        2. 让每只大鼠穿越装置八次。
      4. 训练第4天
        1. 将一只大鼠放置于梯子横档装置的起点。
        2. 若大鼠未主动穿越装置并进入目标箱，可从后方轻柔推动以提供协助。
        3. 让每只大鼠穿越装置八次。
      5. 训练第5–8天
        1. 将一只大鼠放置于梯子横档装置的起点。
        2. 若大鼠未主动穿越装置并进入目标箱，可从后方轻柔推动以提供协助。
        3. 让每只大鼠穿越装置十次。
        4. 训练结束时，大鼠应能够在无任何中断和协助的情况下连续完成至少三次穿越。允许在起始区域轻推大鼠以启动运动。
  3. 评估
    1. 在实验台上安装梯子横档装置、间隔器和目标箱。
    2. 将摄像机置于合适位置，使其与装置平行并对准动物。尽可能靠近动物放置摄像机，以获得最佳运动记录分辨率，并确保整个梯子横档装置均被摄入画面。
    3. 开始录像，并首先标识实验会话编号和动物编号。
    4. 将大鼠放置于梯子横档装置的起始区域。
    5. 大鼠需连续三次无中断地穿越梯子横档装置的100 cm行走区域，方可视为有效穿越。即使大鼠在前三次穿越中已达到三次有效穿越，仍应至少完成十次穿越，以评估任务的持续表现能力。
    6. 任务完成后，使用0.1%乙酸清洁装置和实验台，以避免前一只大鼠的气味对后续实验造成干扰。
  4. 数据分析
    1. 使用免费视频分析软件Kinovea进行数据分析。
    2. 从录像中选取三次有效穿越的视频片段。选择前三个有效穿越片段用于数据分析。
    3. 确定所选三次有效穿越的起始时间点和结束时间点。当第一只后肢越过装置侧壁上的第一条黑线（标记100 cm行走区域的起点）时，定义为穿越的起始时间点；当第一只前肢越过装置侧壁上的第二条黑线（标记100 cm行走区域的终点）时，定义为穿越的结束时间点。
    4. 识别起始和结束时间点后，计算穿越行走区域所需的时间。以穿越行走区域的潜伏期（秒）报告数据，并按常规进行统计分析（图4C）。
    5. 使用Metz et al. 提出的7级评分标准，结合软件的慢放或逐帧播放功能对三次有效穿越进行评分（图5）16,17。根据评分标准，分别记录每只肢体的步数和错误次数。评分标准包括以下类别：（0）完全失误，（1）严重滑动，（2）轻微滑动，（3）重新放置，（4）纠正动作，（5）部分放置，（6）正确放置。仅对起始肢体的错误进行评分，由初始错误引发的后续错误不应计入。
    6. 根据以下要求计算“每步错误率”：将（0）完全失误、（1）严重滑动和（2）轻微滑动归类为错误。将每只后肢在每次穿越中的错误数除以步数，分别计算。对每只动物的每只后肢，取三次有效穿越的平均值，并按常规进行统计分析（图4D）。

结果

五分钟开放场地实验（OFT）的代表性结果表明，术后五周的神经 crush 损伤对运动活动能力无影响（图1）。

使用 CatWalk XT 系统进行步态分析（图2）可生成多种不同参数。通过比较神经损伤前的野生型（wt）正常大鼠与坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型神经损伤大鼠，对部分参数进行了统计学分析（图2D）。在神经损伤侧（右侧）后肢足印中，运行平均速度、步幅长度和足印面积均检测到显著变化。进一步利用“交互式足印测量”模块对神经损伤侧后肢足印进行更详细的分析。与野生型正常大鼠相比，野生型神经损伤大鼠的 toe spread（脚趾展开距离）、intermediate toe spread（中间脚趾展开距离）和 print length（足印长度）参数均显著降低。此外，在比较野生型神经损伤大鼠与野生型正常大鼠时，paw angle body axis（足部角度与身体轴线夹角）和 paw angle movement vector（足部角度与运动方向向量夹角）也表现出显著差异（图2E）。

图3展示了通过横梁行走任务评估获得的运动协调性数据。与未受损伤的野生型大鼠相比，神经损伤的野生型大鼠在损伤后五周穿越横梁所需的潜伏时间显著延长（图3B）。作为横梁行走任务的另一项观测指标，记录了神经损伤后肢的完全滑落和半滑落次数，并将其视为统计分析中的错误事件。神经损伤野生型大鼠在行走过程中，其神经损伤（右侧）后肢每步出现错误的百分比显著高于未受损伤的野生型大鼠。

阶梯横杆行走任务的代表性数据（图4）显示，在神经损伤（右侧）后肢穿越阶梯横杆装置走道的潜伏时间（图4C）以及每步错误率（图4D）方面均未出现显著变化。对神经损伤后肢每步错误率的分析仅考虑了Metz et al提出的7级评分标准中0至2分的评分结果。神经损伤（右侧）后肢与非神经损伤（左侧）后肢在每步中各评分等级的分布情况如图4E所示。

小鼠行为追踪装置；包含摄像头、路径图和用于实验分析的速度图。
图 1：开放旷场实验中运动活动的评估。(A) 开放旷场实验装置的照片。从开放旷场实验期间录制的视频中选取的图像，显示大鼠在开放旷场区域中的位置，未叠加追踪轨迹（B）和叠加追踪轨迹（C）。(D) 对野生型未处理大鼠以及坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠，在五分钟开放旷场实验记录期间的速度进行了分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。对符合正态分布的数据采用非配对 t 检验进行统计分析。请点击此处查看该图的放大版本。

使用啮齿类动物跑台装置进行步态分析实验；数据包括速度、步幅、足迹面积图表。
图 2：使用 CatWalk XT 系统进行步态分析。 (A) CatWalk XT 装置的照片。(B) 足迹视图示例，以伪彩色模式显示标记的足印；时序视图示例，显示野生型未处理大鼠及坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠基于时间的步态图。(C) 足趾分类示例，显示足趾展开距离（TS）、中间足趾展开距离（ITS）和足迹长度（PL）；以及身体轴线视图示例，显示野生型未处理大鼠及坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠的身体轴线（白线）和运动矢量（红线）。(D) 来自“标准分类”的选定参数数据，比较野生型未处理大鼠与坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠。(E) 来自“交互式足迹测量模块”的选定参数数据，比较野生型未处理大鼠与坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计分析采用对正态分布数据的非配对 t 检验、对方差不等的正态分布数据的带 Welch 校正的非配对 t 检验，以及对非正态分布数据的 Mann-Whitney U 检验。定义 P 值 < 0.05 为具有统计学显著性，标记为 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

运动协调性测试装置、潜伏期和错误率图表、大鼠在横梁上行走
图3：通过横梁行走任务进行步态分析。(A) 横梁行走任务装置的照片及示意图。对野生型未处理大鼠以及坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠，分别分析其穿越横梁所需的潜伏时间（B）以及神经损伤后后肢在行走过程中每步的足部打滑错误百分比（C）。横梁行走任务起始时刻的位置代表性图像（D）和结束时刻的位置代表性图像（E）。完整打滑错误（F）和半程打滑错误（G）的典型图像序列。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。对于非正态分布的数据，采用 Mann-Whitney U 检验进行统计分析。定义 P 值 < 0.05 为具有统计学显著性，标记为 *p < 0.05，**p < 0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。

使用横梁行走实验进行运动功能评估的装置；包含示意图、条形图和箱线图。
图 4：利用梯状横杆行走任务进行步态分析。 梯状横杆行走任务装置的照片（A）和示意图（B）。在野生型未处理大鼠以及坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠中，检测了穿越梯状横杆装置的潜伏时间（C）以及神经损伤后后肢每步的足部打滑错误百分比（D）。(E) 根据 Metz et al. 提出的7级评分标准，对野生型未处理大鼠及坐骨神经 crush 损伤后五周的野生型大鼠左右后肢每步的评分类别分布百分比进行分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。统计分析采用对正态分布数据进行非配对 t 检验，对非正态分布数据采用 Mann-Whitney U 检验。请点击此处查看该图的放大版本。

Rat locomotion analysis; gait categories, behavioral scoring; diagram for motor function study.
图5：根据Metz的7级分类标准对每个类别的示例性展示 等 在梯状横杆行走任务期间. 在梯子横档行走任务中，右后肢的代表性图像序列：0类——完全错过，1类——严重打滑，2类——轻微打滑，3类——位置替换，4类——纠正动作；5类——部分放置和6类——正确放置的代表性图片。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

该行为学评估方案概述了在坐骨神经 crush 损伤后的啮齿类动物模型中，所选行为测试组合的优势与劣势以及可能的检测指标。

为了获得坐骨神经 crush 损伤的可比性结果，必须采用一致的 crush 技术。使用无齿钳（Ultra Fine Hemostat）代替镊子可提高 crush 操作的一致性。应使用相同的钳子以及相同的 crush 位置，以确保神经受压程度一致。该钳子仅用于造成 crush 损伤，并在使用过程中小心操作，以提高实验重复性。此外，实施 crush 损伤操作时也需谨慎。手术过程中对神经造成的额外损伤，例如不必要的神经牵拉，可能导致自残等不良副作用。因此，建议仔细进行神经暴露操作，并在术后至少两天内给予镇痛药物。

多因素运动行为评估可在不同层面对大鼠神经 crush 损伤后的表型进行表征。我们采用了开放场地实验（OFT）、CatWalk XT 步态分析、平衡木行走任务和梯格行走任务。这些实验必须采用盲法处理实验分组及数据分析。在进行行为评估前，动物需在测试环境中适应至少 30 分钟。本文所应用的所有行为学测试均具有无需食物或饮水剥夺的优势。所有描述的行为学测试均使用同一组动物。每只动物每天最多进行两项不同的行为学测试。若行为学测试需定期进行，应注意操作的一致性，例如以相同的动物顺序并在每天的相同时间点进行测试。行为分析的另一个重要方面是大鼠的昼夜节律。建议采用反转的昼夜节律，以在光照周期（即黑暗周期）内获得更自然且更高水平的活动性，这一点对于自发行为的测量尤为重要，例如开放场地实验（OFT）。本实验中未能实施反转的昼夜节律，但已确保动物充分适应测试环境。对于平衡木行走任务和梯格行走任务，高质量的视频拍摄需要充分的照明。若在黑暗环境中进行实验，则无法获得所需的高分辨率视频质量。

步态评估需要进行连续的任务操作。连续任务操作的第一个重要方面是让动物愿意穿过装置。为了提高动物的动机，可在装置末端放置少量食物颗粒（45 mg）。为了让动物事先熟悉这些食物颗粒，应在测试前先喂食给它们。此外，在装置末端设置目标箱也可能有所帮助。CatWalk 系统本身已配备目标箱，但大鼠有时会犹豫是否进入目标箱。作为替代方案，可将一个小笼子放入目标箱内，但大鼠的原饲养笼通常无法放入目标箱中。在开始采集数据前，让大鼠在该笼子中适应几分钟。另外，也可将同一只饲养笼中的另一只大鼠放入目标箱内或目标箱中的小笼子内，但需确保第二只大鼠停留在箱内且不阻塞目标箱的入口。此外，还可以将 CatWalk 系统的目标箱移除，并在行走通道末端放置大鼠的原饲养笼，使大鼠每次运行后都能进入其“领地”。对于平衡木行走任务和梯格行走任务的装置设置，我们建议在末端添加目标箱或原饲养笼。为保证实验一致性，CatWalk、平衡木行走任务和梯格行走任务应每周至少进行一次，每次完成六至十次运行。

尽管本研究中的某些分析并未产生显著差异，但需考虑到，若纳入转基因动物或处理组，则可能获得有价值的数据，从而通过相同的行为学测试区分不同组别。

神经 crush 损伤对大鼠的运动活动能力无影响，该指标通过五分钟开放场地试验（OFT）进行测定。Catwalk XT 步态分析是一种更为客观且敏感的工具，可用于分析步态、足垫和脚趾的放置情况。经过强化训练后，大鼠学会穿越 CatWalk XT 仪器的通道，达到默认设置要求。神经损伤并未降低大鼠穿越通道的能力。系统自动计算多个参数，使数据呈现更加客观。通过使用“交互式足印测量”模块可获得额外信息，事实上，这些分析在比较有无神经损伤的大鼠时，发现脚趾展开度、足印长度以及足爪与身体长轴夹角等多个参数上存在显著差异。

大鼠可轻松训练以完成横梁行走任务。通过比较未受损伤大鼠与坐骨神经挤压伤大鼠，可检测到横梁行走过程中患侧后肢通过横梁所需潜伏期时间以及每步足滑次数的差异。使用横梁行走任务分析神经损伤大鼠的一个缺点是横梁的尺寸问题。在坐骨神经挤压伤后的前两周内，由于大鼠平衡能力受损，需要辅助才能通过横梁。尽管部分大鼠可能能够自行通过横梁，但跌落导致受伤的风险较高。因此，对于坐骨神经挤压伤后前两周（或必要时更长时间）的神经损伤动物，应给予辅助使其通过横梁。然而，有辅助与无辅助情况下的行走表现难以进行比较。此外，运动平衡能力是横梁行走任务所评估的重要参数之一，但我们认为该参数在本研究的坐骨神经挤压伤大鼠模型中并不具有相关性。因此，Ohwatashi 等人和 Johansson 与 Ohlsson 所描述的评分方法无法适用，且未完成全程横梁行走的试验数据在分析中被排除18,19。

Metz 等人提出的7级评分系统可同时分析前肢和后肢，并在梯子横档行走任务中区分所有肢体不同严重程度的错误16,17。通过分析最显著的错误（包括0至2类），在比较神经损伤的野生型大鼠与未受干预的野生型大鼠时，未能检测到后肢每步错误数量的差异。此外，神经损伤的野生型大鼠与未受干预的野生型大鼠在穿越梯子横档装置时的潜伏时间也无差异。深度学习模型可通过自动化方法改进并加速梯子横档行走任务的数据分析。

需要指出的是，通过调整实验装置的参数和尺寸，神经 crush 损伤以及所有所述的行为学测试均可轻松转化为小鼠模型。使用小鼠作为模式生物的优势在于，目前已存在多种针对人类疾病的转基因模型。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF DysTract 项目，资助 C.W.I.）以及维尔茨堡大学跨学科临床研究中心（IZKF，项目编号 N-362 资助 C.W.I.；Z2-CSP3 资助 L.R.）提供支持。此外，本项目还获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划下 EJP RD COFUND-EJP N 项目的资助。° 825575（EurDyscover 资助 J.V.），以及 VERUM 基金会的资助。此外，C.W.I. 受德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG，德国研究基金会）项目编号 424778381-TRR 295 资助， 德国神经病学基金会和帕金森基金。L.R. 还获得肌张力障碍医学研究基金会的支持。

作者感谢 Keali Röhm、Veronika Senger、Heike Menzel 和 Louisa Frieß 提供的技术支持，以及 Helga Brünner 在动物护理方面的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸，≥99.8%Sigma-Aldrich33209-1L
Appose ULC 皮肤缝合器 35WCovidien8886803712
横梁自制
Bepanthen 眼霜Bayer Vital GmbH81552983
OFT 实验箱自制
摄像机 GC-PX100JVC
Catwalk XTNoldus 系统与软件
异氟烷麻醉室GT-Labortechnik定制
一次性手术刀 11 号Feather20.001.30.011
Dräger Vapor 19.3 异氟烷麻醉系统Dr. Wilfried Müller GmbH
Dumont #2 - 椎板切除钳Fine Science Tools11223-20
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-30超细
无尘精密颗粒饲料 45 mgBio-ServF0021
EthoVision XTNoldus 系统与软件
160 mm 镊子HartensteinPZ09
大鼠用气体麻醉面罩Dr. Wilfried Müller GmbH
阶梯格行走任务装置的目标箱自制
毛发修剪器 Magnum 5000Wahl GmbH
硬化精细剪刀Fine Science Tools14090-11
加热台MEDAX13801
异氟烷 CP 1ml/ml，250 mlcp-pharma1214需处方
Kinoveawww.kinovea.org
阶梯格行走任务装置自制
持针器KLS Martin20-526-14-07
OctenidermSchülke118211
Rimadyl 50 mg/ml，注射用Zoetis卡洛芬，需处方
橡胶牵开器自制
横梁间隔器自制
阶梯格行走任务装置间隔器自制
丝线缝合线 Silkam 4/0 DS 19B. BraunC0762202
超细止血钳（无齿钳）Fine Science Tools13020-12

参考文献

  1. Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. Rats. Disease Models & Mechanisms. 2 (5-6), 206-210 (2009).
  2. Phifer-Rixey, M., Nachman, M. W. Insights into mammalian biology from the wild house mouse Mus musculus. Elife. 4, (2015).
  3. Musacchio, T., et al. Subthalamic nucleus deep brain stimulation is neuroprotective in the A53T alpha-synuclein Parkinson's disease rat model. Annals of Neurology. 81 (6), 825-836 (2017).
  4. Ip, C. W., et al. Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 108(2016).
  5. Rauschenberger, L., et al. Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism. Experimental Neurology. 323, 113109(2020).
  6. Klein, A., Wessolleck, J., Papazoglou, A., Metz, G. A., Nikkhah, G. Walking pattern analysis after unilateral 6-OHDA lesion and transplantation of foetal dopaminergic progenitor cells in rats. Behavioural Brain Research. 199 (2), 317-325 (2009).
  7. Kim, D. H., Murovic, J. A., Tiel, R., Kline, D. G. Management and outcomes in 353 surgically treated sciatic nerve lesions. Journal of Neurosurgery. 101 (1), 8-17 (2004).
  8. Kline, D. G., Kim, D., Midha, R., Harsh, C., Tiel, R. Management and results of sciatic nerve injuries: a 24-year experience. Journal of Neurosurgery. 89 (1), 13-23 (1998).
  9. Kaplan, H. M., Mishra, P., Kohn, J. The overwhelming use of rat models in nerve regeneration research may compromise designs of nerve guidance conduits for humans. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 26 (8), 226(2015).
  10. Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments. (60), e3606(2012).
  11. Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. Journal of Neuroscience Methods. 227, 166-180 (2014).
  12. Menorca, R. M., Fussell, T. S., Elfar, J. C. Nerve physiology: mechanisms of injury and recovery. Hand Clinics. 29 (3), 317-330 (2013).
  13. Luis, A. L., et al. Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat. Microsurgery. 28 (6), 458-470 (2008).
  14. Knorr, S., et al. The evolution of dystonia-like movements in TOR1A rats after transient nerve injury is accompanied by dopaminergic dysregulation and abnormal oscillatory activity of a central motor network. Neurobiology of Disease. , 105337(2021).
  15. Quartarone, A., Hallett, M. Emerging concepts in the physiological basis of dystonia. Movement Disorders. 28 (7), 958-967 (2013).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: a scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: a new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Johansson, B. B., Ohlsson, A. L. Environment, social interaction, and physical activity as determinants of functional outcome after cerebral infarction in the rat. Experimental Neurology. 139 (2), 322-327 (1996).
  19. Ohwatashi, A., Ikeda, S., Harada, K., Kamikawa, Y., Yoshida, A. Exercise enhanced functional recovery and expression of GDNF after photochemically induced cerebral infarction in the rat. EXCLI Journal. 12, 693-700 (2013).

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