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方法文章

利用邻近连接技术在不同流体剪切应力条件下可视化与定量TGFβ/BMP/SMAD信号通路

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DOI：

10.3791/62608

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2021年9月14日

 ,  , 
1Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 2International Max-Planck Research School for Biology and Computation

本文内容

摘要

本文建立了一种实验方案，用于在暴露于病理性和生理性流体剪切应力条件下的内皮细胞中，通过邻位连接实验（proximity ligation assay, PLA）同时可视化并分析多种SMAD复合物。

摘要

转化生长因子β（TGFβ）/骨形态发生蛋白（BMP）信号通路在血管系统的发育和稳态过程中受到严密调控并保持平衡。因此，该信号通路的失调会导致严重的血管病理状态，例如肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症以及动脉粥样硬化。作为血管最内层的内皮细胞（ECs）持续暴露于流体剪切应力（SS）之下。研究表明，异常的流体剪切应力模式可增强TGFβ/BMP信号通路，这种增强作用与其他刺激因素共同促进动脉粥样硬化的发生。与此相关，易致动脉粥样硬化的低层流剪切应力被发现能够增强TGFβ/BMP信号，而具有动脉粥样硬化保护作用的高层流剪切应力则减弱该信号。为了高效分析这些通路的激活情况，我们设计了一套实验流程，利用商业化的气动泵系统结合邻近连接技术（PLA），在低层流剪切应力和高层流剪切应力条件下研究转录因子复合物的形成。

活化的TGFβ/BMP信号转导需要由两个调节型SMAD（R-SMAD）和一个通用中介SMAD（co-SMAD；SMAD4）组成三聚体SMAD复合物，其中TGFβ信号通路涉及SMAD2/3，而BMP信号通路涉及SMAD1/5/8。通过使用针对三聚体SMAD复合物不同亚基的邻位连接技术（PLA），例如R-SMAD/co-SMAD或R-SMAD/R-SMAD组合，可利用荧光显微镜对活性SMAD转录因子复合物的形成进行定量和空间上的检测。

使用带有6个小型平行通道（可串联连接）的流体载片，可研究转录因子复合物的形成，并纳入必要的对照。

本文所述的工作流程可轻松适用于在不同流体剪切应力条件下，研究SMADs与其他转录因子或非SMAD转录因子复合物之间邻近关系的研究。本文展示的工作流程提供了一种快速而有效的方法，可对内皮细胞中流体剪切应力诱导的TGFβ/BMP信号通路进行定量和空间上的分析。

引言

转化生长因子β（TGFβ）超家族的蛋白质是一类具有多种成员的多效性细胞因子，包括TGFβs、骨形态发生蛋白（BMPs）和激活素（Activins）1,2。配体结合可诱导受体寡聚体的形成，从而导致胞质调节型SMAD（R-SMAD）的磷酸化并使其活化。根据配体的亚家族不同，活化的R-SMAD也有所不同1,2。TGFβs和Activins主要诱导SMAD2/3的磷酸化，而BMPs则诱导SMAD1/5/8的磷酸化。然而，越来越多的证据表明，BMPs以及TGFβs/Activins也可激活另一亚家族的R-SMAD，这一过程被称为“侧向信号传导”3,4,5,6,7,8，并且存在由SMAD1/5和SMAD2/3共同组成的混合型SMAD复合物3,9。两个活化的R-SMAD随后与通用中介分子SMAD4形成三聚体复合物。这些转录因子复合物可转入细胞核内，调控靶基因的转录。SMADs可与多种不同的转录共激活因子和共抑制因子相互作用，从而增加调控靶基因的可能性10。SMAD信号通路的失调在多种疾病中具有严重后果。与此一致，TGFβ/BMP信号失衡可能导致严重的血管病理状态，例如肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症或动脉粥样硬化3,11,12,13,14。

内皮细胞（ECs）构成血管的最内层，因此会受到血液黏性流动所产生的摩擦力，即剪切应力（SS）的作用。有趣的是，位于血管系统中暴露于高水平均匀层流SS区域的ECs，通常维持在稳态和静息状态。相反，在低水平、非均匀SS区域（例如血管分叉处或主动脉弓的内侧曲率）的ECs则呈现增殖状态，并激活炎症通路15。相应地，功能失调的ECs区域易于发生动脉粥样硬化。值得注意的是，这些易发动脉粥样硬化的区域中的ECs表现出异常升高的活化型SMAD2/3和SMAD1/5水平16,17,18。在此背景下，增强的TGFβ/BMP信号传导被发现是动脉粥样硬化病变早期发展的事件之一19，而干扰BMP信号传导可显著减轻血管炎症、动脉粥样瘤形成及相关钙化20。

邻近连接测定（Proximity Ligation Assay, PLA）是一种用于原位研究蛋白质-蛋白质相互作用的生物化学技术in situ21,22。该技术依赖于不同物种来源的特异性抗体，这些抗体可结合目标蛋白，从而在单细胞水平实现对内源性蛋白质相互作用的高度特异性检测。在此方法中，一抗必须结合其靶向表位，且两者间距小于40 nm，方可实现检测23。因此，与传统的共免疫沉淀技术相比，PLA具有显著优势，后者通常需要数百万个细胞才能检测到内源性蛋白质相互作用。在PLA中，物种特异性的二抗共价连接DNA片段（分别称为Plus探针和Minus探针），并与一抗结合；当目标蛋白发生相互作用时，Plus与Minus探针将彼此靠近。随后，DNA片段被连接，进而启动环状DNA的滚环扩增。在扩增过程中，荧光标记的互补寡核苷酸与合成的DNA结合，使得这些蛋白质相互作用可通过常规荧光显微镜进行可视化观察。

本方案使科研人员能够定量比较在抗动脉粥样硬化和促动脉粥样硬化剪切应力条件下活性SMAD转录复合物的数量 体外 使用 PLA。SS 通过可编程的气动泵系统产生，该系统能够生成定义水平的层流单向流，并允许流速逐步增加。该方法可用于检测 SMAD1/5 或 SMAD2/3 与 SMAD4 之间的相互作用，以及混合型 R-SMAD 复合物。该技术还可轻松拓展用于分析 SMAD 蛋白与转录共调节因子之间的相互作用，或非 SMAD 类转录因子复合物。 图1 展示了下述方案的主要步骤。

剪切应力暴露过程；邻近连接实验；显微镜图像采集与分析。
图1：本实验方案的示意图。（A）接种于6通道载玻片中的细胞通过气动泵系统暴露于剪切应力。（B）固定后的细胞用于邻近连接实验或对照条件。（C）使用荧光显微镜采集邻近连接实验的图像，并利用ImageJ分析软件进行图像分析。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 细胞培养与流体剪切应力处理

注意：本研究以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为例，研究剪切应力（SS）诱导的SMADs相互作用。下述方案可应用于所有对剪切应力有响应的细胞类型。

  1. 将6通道载玻片用含0.1%猪皮明胶的PBS溶液在37 °C下孵育30分钟进行包被。
  2. 在预包被的6通道载玻片中，以每毫升2.5 × 106个细胞的密度接种HUVECs，每孔加入30 µL M199完全培养基。
    注意：有关在流动载玻片中接种细胞的更多操作信息，请参见参考文献24。
  3. 将细胞置于37 °C湿润培养箱中孵育1小时，使其充分贴壁。
  4. 向每个储液池中加入60 µL预热的M199完全培养基。
  5. 在37 °C湿润培养箱中培养2天，每天轻柔更换一次培养基。
    1. 完全吸除储液池中的培养基，向其中一个储液池加入120 µL预热的M199完全培养基，从另一侧吸出液体。
    2. 向两个储液池中各加入60 µL预热的M199完全培养基。
  6. 按照参考文献25中所述方法组装并启动流动系统。
    1. 将管路安装至流体单元。此处使用内径为0.8 mm和1.6 mm的硅胶管，分别用于施加1 dyn/cm2和30 dyn/cm2的剪切应力。
      注意：管路材料和长度应保持恒定，因为任何改变都可能影响实际产生的剪切应力。通常，只要已知最终剪切应力值且泵能产生稳定的层流，也可使用其他类型的泵系统与管路组合。
    2. 向储液池中加入适量预热的M199完全培养基（至少10 mL）。
    3. 将流体单元通过管路连接至泵系统，并在无细胞条件下进行预运行，以平衡培养基并排除残留空气25。
    4. 使用串联连接管路将6通道载玻片上的各个通道依次串联连接。载玻片上的第一个和最后一个通道应连接至步骤1.6.1中组装的管路（示意图见图1A）。操作时需小心避免引入气泡，否则可能严重损伤细胞。有关串联连接的更多细节，请参见参考文献26。
    5. 当需要使细胞暴露于高剪切应力（>20 dyn/cm2）时，应采用梯度升压阶段，即分步递增剪切应力并设置适应期。可设置为每30分钟增加5 dyn/cm2。

2. 固定

  1. 在流体SS暴露结束后，将载片从泵上拆下。拆卸时应在管路上使用夹子，以避免培养基在培养箱中溢出。
  2. 立即将流动载片置于冰上，同时依次拆下剩余的管路。从储液槽移除管路时，应以手指封闭另一侧的储液槽，避免在通道中引入气泡。气泡可能干扰后续固定步骤。
  3. 保持细胞处于冰上，小心从储液槽中吸除培养基，但不要吸除细胞所在通道内的液体。随后用冷的无菌PBS（4 °C）清洗样品，每次使用相当于通道体积三倍的液体（90 µL）。将PBS加入一个储液槽，从另一个储液槽小心吸出。每张载片的6个通道均重复此步骤。
    注意：在所有洗涤和孵育步骤中，将相应溶液加入其中一个储液槽，以实现通道内溶液的置换。为确保通道内溶液完全替换，需从另一侧储液槽吸除多余液体。通道内细胞上方的液体不得完全移除。细胞在任何时刻均不应干燥。因此，洗涤时必须小心操作，避免将气泡引入载片通道内。
  4. 在先前加入PBS的同一储液槽中加入90 µL缓冲的4% PFA溶液，以固定细胞，并从另一侧储液槽小心吸出液体。每张载片的每个通道均重复此步骤。加入PFA溶液后，将样品从冰上转移至室温（RT），孵育20分钟。
    注意：PFA具有毒性，操作时需格外小心。应佩戴手套并在通风橱内操作。
  5. 用PBS（室温）清洗细胞3次，方法为将PBS加入一个储液槽，从另一侧储液槽小心吸出液体。仅吸除储液槽中的液体，确保通道内液体不被吸干。每张载片的6个通道均重复此步骤。
  6. 在一个储液槽中加入90 µL室温的含50 mM氯化铵的PBS溶液，以淬灭PFA固定反应。从另一侧储液槽吸除多余溶液。每张载片的每个通道均重复此操作。室温孵育10分钟。
  7. 按照步骤2.5所述进行洗涤。
    ​注意：此时样品可在4 °C下保存过夜，或立即进行后续的封闭及一抗孵育步骤（见步骤3）。

3. 封闭与一抗孵育

  1. 为了透化细胞，在空的储液槽中加入90 µL含0.3% Triton-X-100的PBS，并从每个通道的另一侧储液槽中吸出液体。室温孵育10分钟。
  2. 按照步骤2.5所述进行洗涤。
  3. 在通道的一个储液池中加入90 µL无菌PLA封闭液，并从另一侧吸出。每个通道均重复此步骤。在37 °C湿润环境中封闭1 h。
    1. 制作一个加湿培养盒，可使用一个内含湿润纸巾并用石蜡膜密封的10 cm培养皿，然后将该培养皿放入培养箱中。或者，也可使用其他能够提供湿润环境的加湿室装置。
      注意：也可使用自制封闭液（例如，含3% (w/v) BSA的PBS溶液，经无菌过滤）。
  4. 将一抗用 PLA 抗体稀释液按 1:100 比例稀释，每通道准备 30 µL 溶液。同时加入两种一抗，并涡旋混匀。
    注意：也可使用自制的抗体稀释液（例如，含1% (w/v) BSA的PBS）。本实验所用抗体组合包括SMAD1-SMAD2/3、SMAD2/3-SMAD4以及phospho-SMAD1/5-SMAD4。详细信息见于 材料表.
  5. 在加入一抗之前，将封闭液从储液池以及通道中吸出。加样时，边倾斜通道边立即用移液器将30 µL一抗溶液加入空的通道中。
    注意：应逐通道移除封闭液并添加抗体溶液，以确保细胞在操作过程中不会干燥。
  6. 在4 °C的湿盒中，将样本与一抗孵育过夜。
    ​注意：如果希望在同一天内继续后续步骤，也可在室温下孵育1小时。

4. PLA 探针孵育

注意：在执行第4.1-7.3节的所有步骤时，洗涤缓冲液A和B储存于4 °C，使用前需升温至室温。

  1. 用 PLA 抗体稀释液（或 1% BSA）将 PLA 探针 (+)-mouse 和 (-)-rabbit 按 1:5 比例稀释。每通道准备 30 µL。
  2. 在室温下，每张玻片的每个通道加入 90 µL 洗涤缓冲液 A，从一个储液池加入，从另一个储液池小心吸出，每次 5 分钟，洗涤 2 次。每张玻片的 6 个通道均重复此步骤。
  3. 小心吸去洗涤缓冲液 A，每通道加入 30 µL PLA 探针溶液（按步骤 4.1 配制），加样方式与步骤 3.5 中加入一抗的方法类似。
  4. 将样本置于湿化 chamber 中，37 °C 孵育 1 小时。

5. 连接

  1. 按照4.2节所述，在室温下使用90 µL洗涤缓冲液A洗涤样品，每次5分钟，共洗涤两次。
  2. 用去离子水将连接缓冲液配制成1:5稀释液。将连接酶在冰上用该缓冲液稀释至1:40。每通道使用30 µL。
  3. 彻底吸除洗涤缓冲液A，并按照3.5节所述加入连接反应液。
  4. 将样品置于湿化 chamber 中，在37 °C下孵育30分钟。

6. 扩增

  1. 按照 4.2 中所述，在室温下使用 90 µL 洗涤缓冲液 A 洗涤样品 2 次，每次 2 分钟。
  2. 用去离子水将扩增缓冲液按 1:5 稀释，并用其将聚合酶按 1:80 稀释（置于冰上）。避光保存。每通道准备 30 µL。
  3. 彻底吸除洗涤缓冲液 A，并立即向空通道中加入已配制的扩增溶液，操作如 3.5 所述。将样品在加湿孵育室中 37 °C 孵育 100 分钟。

7. 封片

  1. 按照4.2节所述，在室温下使用90 µL洗涤缓冲液B洗涤样品2次，每次10分钟。在第一次洗涤时，加入DAPI（1:500稀释），即从1 mg/mL的储备液（溶于去离子水）中取用，以对细胞核进行染色。切勿使通道干燥。
  2. 用去离子水将洗涤缓冲液B按1:10稀释，然后按照4.2节所述，使用90 µL的0.1×缓冲液B溶液洗涤1次。
  3. 彻底吸除洗涤缓冲液B，并立即向一个储液区加入2–3滴液体封片介质。通过倾斜载玻片使封片介质分布至整个通道。将样品置于4 °C湿润环境中保存，直至成像。

8. 图像采集

  1. 使用荧光显微镜采集图像。确保配备适用于荧光 PLA 探针的相应滤光片。
    注意：如果条件允许，建议使用共聚焦显微镜，因为所获得的 PLA 斑点更加清晰。这也有助于后续的图像处理和数据分析。

9. 使用 ImageJ/FIJI 进行图像分析与定量

  1. 使用图像处理软件（如 ImageJ27）处理导出的图像（.tiff）。
    注意：本研究中使用且用于自动计数细胞内、细胞核内及所有 PLA 事件（每细胞）的所有脚本均可在 GitHub 仓库中获取：https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis。请使用任何合适的程序或工具进行统计分析。

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结果

我们先前已使用邻近连接实验（PLA）来检测不同SMAD蛋白之间的相互作用3 并分析剪切应力诱导的SMAD磷酸化变化28.

此处，上述两种方法与前述方案相结合。将 HUVEC 细胞分别暴露于 1 dyn/cm2 和 30 dyn/cm2 的剪切应力下，并分析 SMAD 转录因子之间的相互作用。结果显示，与高剪切应力（30 dyn/cm2）相比，低剪切应力（1 dyn/cm2）可显著增加 SMAD1 与 SMAD2/3 的相互作用，即在分析细胞的细胞质和细胞核中均形成所谓的混合型 SMAD 复合物（图 2A，下图）。PLA 信号在两个样本中均表现为清晰的点状信号，结合 DAPI 染色可区分细胞质和细胞核中的信号（图 2A，上图）。相比之下，抗体对照组中仅孵育一种一抗但保留两种 PLA 探...

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讨论

本文所述基于 PLA 的实验方案可高效地定量并以空间分辨的方式确定在剪切应力作用下的内皮细胞（ECs）中两种蛋白质的近距离共定位（例如，它们的直接相互作用）。通过使用具有多个平行通道的流室载片，可在相同力学条件下同时检测细胞中多种不同的蛋白质相互作用。相比之下，定制的流室系统通常采用围绕玻璃盖玻片构建的单通道设计，每张载片和泵仅能进行一次 PLA 实验，且缺乏必要的对照。尽管本方案重点检测 SMAD 蛋白间的相互作用，但其可调整用于检测其他任意蛋白质相互作用。然而，结果分析需谨慎，因为两种蛋白质可能仅因空间邻近而接近，但并未形成复合物。若需对蛋白质相互作用作出明确结论，应将 PLA 实验与共免疫沉淀等其他方法结合使用。此外，由于 PLA 检测需对样本进行固定以进行后续抗体结合和 DNA 扩增步骤，因此无法用于活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的检测。

通过 PLA 成功检测蛋白质相互作用的最关键步骤是选择满足多个条件的初级抗体组合：（1）检测各个蛋白质配对的抗体必须由不同物种（例如小鼠或兔）产生，因为二抗具有物种特异性；理想情况下，这些抗体已通过传统的免疫荧光显微镜技术成功验证；（2）...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢 Maria Reichenbach 博士和 Christian Hiepen 博士在流式系统设置方面的支持，感谢 Eleanor Fox 和 Yunyun Xiao 对稿件的审阅。P-L.M. 由国际马克斯·普朗克研究所生物与计算研究项目（IMPRS-BAC）资助。PK 获得德国研究基金会（DFG-SFB1444）的经费支持。图 1 使用 BioRender 软件绘制。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-Slide VI 0.4ibidi80606六通道载片
氯化铵Carl RothK298.1淬灭剂
牛血清白蛋白Carl Roth8076.4封闭剂
DAPISigma Aldrich/ MerckD9542DNA/细胞核染色
DPBSPAN BiotechP04-53500磷酸盐缓冲液（PBS）
Duolink 原位检测试剂盒（绿色）Sigma Aldrich/ MerckDUO92014PLA试剂盒，包含连接酶、连接缓冲液、聚合酶和扩增缓冲液（含绿色标记的寡核苷酸）
Duolink 原位 PLA探针 抗小鼠 MINUSSigma Aldrich/ MerckDUO92004MINUS探针
Duolink 原位 PLA探针 抗兔 PLUSSigma Aldrich/ MerckDUO92002PLUS探针
Duolink 原位洗涤缓冲液（荧光）Sigma Aldrich/ MerckDUO82049PLA洗涤缓冲液A和B
内皮细胞生长补充剂Corning培养基补充剂（ECGS）
胎牛血清培养基补充剂
FIJI图像分析软件
4% 缓冲甲醛溶液KLINIPATH/VWRVWRK4186.BO1PFA
完全培养基M199基础培养基 + 20% FCS + 1% P/S + 2 nM L-Glu +  25 µg/mL Hep +   50 µg/mL ECGS
猪皮明胶，A型Sigma AldrichG2500使用0.1% PBS溶液用于流动通道的包被
GraphPad Prism v.7GraphPad用于绘图和统计分析的统计软件
猪肠黏膜来源肝素钠盐Sigma AldrichH4784-250MG培养基补充剂（Hep）
HUVECs
ibidi封片介质ibidi50001液体封片介质
ibidi泵系统ibidi10902气压泵
Leica TCS SP8Leica共聚焦显微镜
L-谷氨酰胺 200 mMPAN BiotechP04-80100培养基补充剂（L-Glu）
Medium 199Sigma AldrichM2154基础培养基
小鼠抗SMAD1抗体Abcamab53745适用于PLA
小鼠抗SMAD2/3抗体BD Bioscience610843与CST 9515联用时不适用于PLA
小鼠抗SMAD4抗体Sanata Cruz Biotechnologysc-7966适用于PLA
青霉素 10,000 U/mL / 链霉素 10 mg/mLPAN BiotechP06-07100培养基补充剂（P/S）
灌注套装 白色ibidi10963用于1 dyn/cm²的管路
灌注套装 黄色和绿色ibidi10964用于30 dyn/cm2
兔抗磷酸化SMAD1/5抗体Cell Signaling Technologies9516适用于PLA
兔抗SMAD2/3 XP抗体Cell Signaling Technologies8685适用于PLA
兔抗SMAD4抗体Cell Signaling Technologies9515与BD 610843联用时不适用于PLA
用于µ-Slide的串联连接器ibidi10830串联连接管路
Triton X-100Carl Roth6683.1通透处理

参考文献

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