本文建立了一种实验方案，用于在暴露于病理性和生理性流体剪切应力条件下的内皮细胞中，通过邻位连接实验（proximity ligation assay, PLA）同时可视化并分析多种SMAD复合物。
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本文内容
摘要
摘要
转化生长因子β（TGFβ）/骨形态发生蛋白（BMP）信号通路在血管系统的发育和稳态过程中受到严密调控并保持平衡。因此，该信号通路的失调会导致严重的血管病理状态，例如肺动脉高压、遗传性出血性毛细血管扩张症以及动脉粥样硬化。作为血管最内层的内皮细胞（ECs）持续暴露于流体剪切应力（SS）之下。研究表明，异常的流体剪切应力模式可增强TGFβ/BMP信号通路，这种增强作用与其他刺激因素共同促进动脉粥样硬化的发生。与此相关，易致动脉粥样硬化的低层流剪切应力被发现能够增强TGFβ/BMP信号，而具有动脉粥样硬化保护作用的高层流剪切应力则减弱该信号。为了高效分析这些通路的激活情况，我们设计了一套实验流程，利用商业化的气动泵系统结合邻近连接技术（PLA），在低层流剪切应力和高层流剪切应力条件下研究转录因子复合物的形成。
活化的TGFβ/BMP信号转导需要由两个调节型SMAD（R-SMAD）和一个通用中介SMAD（co-SMAD；SMAD4）组成三聚体SMAD复合物，其中TGFβ信号通路涉及SMAD2/3，而BMP信号通路涉及SMAD1/5/8。通过使用针对三聚体SMAD复合物不同亚基的邻位连接技术（PLA），例如R-SMAD/co-SMAD或R-SMAD/R-SMAD组合，可利用荧光显微镜对活性SMAD转录因子复合物的形成进行定量和空间上的检测。
使用带有6个小型平行通道（可串联连接）的流体载片，可研究转录因子复合物的形成，并纳入必要的对照。
本文所述的工作流程可轻松适用于在不同流体剪切应力条件下，研究SMADs与其他转录因子或非SMAD转录因子复合物之间邻近关系的研究。本文展示的工作流程提供了一种快速而有效的方法，可对内皮细胞中流体剪切应力诱导的TGFβ/BMP信号通路进行定量和空间上的分析。
引言
转化生长因子β（TGFβ）超家族的蛋白质是一类具有多种成员的多效性细胞因子，包括TGFβs、骨形态发生蛋白（BMPs）和激活素（Activins）1,2。配体结合可诱导受体寡聚体的形成，从而导致胞质调节型SMAD（R-SMAD）的磷酸化并使其活化。根据配体的亚家族不同，活化的R-SMAD也有所不同1,2。TGFβs和Activins主要诱导SMAD2/3的磷酸化，而BMPs则诱导SMAD1/5/8的磷酸化。然而，越来越多的证据表明，BMPs以及TGFβs/Activins也可激活另一亚家族的R-SMAD，这一过程被称为“侧向信号传导”3,4,5,6,7,8，并且存在由SMAD1/5和SMAD2/3共同组成的混合型SMAD复合物3,
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方案
1. 细胞培养与流体剪切应力处理
注意：本研究以人脐静脉内皮细胞（HUVECs）为例，研究剪切应力（SS）诱导的SMADs相互作用。下述方案可应用于所有对剪切应力有响应的细胞类型。
- 将6通道载玻片用含0.1%猪皮明胶的PBS溶液在37 °C下孵育30分钟进行包被。
- 在预包被的6通道载玻片中，以每毫升2.5 × 106个细胞的密度接种HUVECs，每孔加入30 µL M199完全培养基。
注意：有关在流动载玻片中接种细胞的更多操作信息，请参见参考文献24。 - 将细胞置于37 °C湿润培养箱中孵育1小时，使其充分贴壁。
- 向每个储液池中加入60 µL预热的M199完全培养基。
- 在37 °C湿润培养箱中培养2天，每天轻柔更换一次培养基。
- 完全吸除储液池中的培养基，向其中一个储液池加入120 µL预热的M199完全培养基，从另一侧吸出液体。
- 向两个储液池中各加入60 µL预热的M199完全培养基。
- 按照参考文献25中所述方法组装并启动流动系统。
- 将管路安装至流体单元。此处使用内径为0.8 mm和1.6 mm的硅胶管，分别用于施加1 dyn/....
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结果
我们先前已使用邻近连接实验（PLA）来检测不同SMAD蛋白之间的相互作用3 并分析剪切应力诱导的SMAD磷酸化变化28.
此处，上述两种方法与前述方案相结合。将 HUVEC 细胞分别暴露于 1 dyn/cm2 和 30 dyn/cm2 的剪切应力下，并分析 SMAD 转录因子之间的相互作用。结果显示，与高剪切应力（30 dyn/cm2）相比，低剪切应力（1 dyn/cm2）可显著增加 SMAD1 与 SMAD2/3 的相互作用，即在分析细胞的细胞质和细胞核中均形成所谓的混合型 SMAD 复合物（图 2A，下图）。PLA 信号在两个样本中均表现为清晰的点状信号，结合 DAPI 染色可区分细胞质和细胞核中的信号（图 2A，上图）。相比之下，抗体对照组中仅孵育一种一抗但保留两种 PLA 探.......
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讨论
本文所述基于 PLA 的实验方案可高效地定量并以空间分辨的方式确定在剪切应力作用下的内皮细胞（ECs）中两种蛋白质的近距离共定位（例如，它们的直接相互作用）。通过使用具有多个平行通道的流室载片，可在相同力学条件下同时检测细胞中多种不同的蛋白质相互作用。相比之下，定制的流室系统通常采用围绕玻璃盖玻片构建的单通道设计，每张载片和泵仅能进行一次 PLA 实验，且缺乏必要的对照。尽管本方案重点检测 SMAD 蛋白间的相互作用，但其可调整用于检测其他任意蛋白质相互作用。然而，结果分析需谨慎，因为两种蛋白质可能仅因空间邻近而接近，但并未形成复合物。若需对蛋白质相互作用作出明确结论，应将 PLA 实验与共免疫沉淀等其他方法结合使用。此外，由于 PLA 检测需对样本进行固定以进行后续抗体结合和 DNA 扩增步骤，因此无法用于活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的检测。
通过 PLA 成功检测蛋白质相互作用的最关键步骤是选择满足多个条件的初级抗体组合：（1）检测各个蛋白质配对的抗体必须由不同物种（例如小鼠或兔）产生，因为二抗具有物种特异性；理想情况下，这些抗体已通过传统的免疫荧光显微镜技术成功验证；（2）.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Maria Reichenbach 博士和 Christian Hiepen 博士在流式系统设置方面的支持，感谢 Eleanor Fox 和 Yunyun Xiao 对稿件的审阅。P-L.M. 由国际马克斯·普朗克研究所生物与计算研究项目（IMPRS-BAC）资助。PK 获得德国研究基金会（DFG-SFB1444）的经费支持。图 1 使用 BioRender 软件绘制。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 六通道载片 |
| 氯化铵 | Carl Roth | K298.1 | 淬灭剂 |
| 牛血清白蛋白 | Carl Roth | 8076.4 | 封闭剂 |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | DNA/细胞核染色 |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | 磷酸盐缓冲液（PBS） |
| Duolink 原位检测试剂盒（绿色） | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA试剂盒，包含连接酶、连接缓冲液、聚合酶和扩增缓冲液（含绿色标记的寡核苷酸） |
| Duolink 原位 PLA探针 抗小鼠 MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS探针 |
| Duolink 原位 PLA探针 抗兔 PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS探针 |
| Duolink 原位洗涤缓冲液（荧光） | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA洗涤缓冲液A和B |
| 内皮细胞生长补充剂 | Corning | 培养基补充剂（ECGS） | |
| 胎牛血清 | 培养基补充剂 | ||
| FIJI | 图像分析软件 | ||
| 4% 缓冲甲醛溶液 | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| 完全培养基 | M199基础培养基 + 20% FCS + 1% P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| 猪皮明胶，A型 | Sigma Aldrich | G2500 | 使用0.1% PBS溶液用于流动通道的包被 |
| GraphPad Prism v.7 | GraphPad | 用于绘图和统计分析的统计软件 | |
| 猪肠黏膜来源肝素钠盐 | Sigma Aldrich | H4784-250MG | 培养基补充剂（Hep） |
| HUVECs | |||
| ibidi封片介质 | ibidi | 50001 | 液体封片介质 |
| ibidi泵系统 | ibidi | 10902 | 气压泵 |
| Leica TCS SP8 | Leica | 共聚焦显微镜 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM | PAN Biotech | P04-80100 | 培养基补充剂（L-Glu） |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | 基础培养基 |
| 小鼠抗SMAD1抗体 | Abcam | ab53745 | 适用于PLA |
| 小鼠抗SMAD2/3抗体 | BD Bioscience | 610843 | 与CST 9515联用时不适用于PLA |
| 小鼠抗SMAD4抗体 | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | 适用于PLA |
| 青霉素 10,000 U/mL / 链霉素 10 mg/mL | PAN Biotech | P06-07100 | 培养基补充剂（P/S） |
| 灌注套装 白色 | ibidi | 10963 | 用于1 dyn/cm²的管路 |
| 灌注套装 黄色和绿色 | ibidi | 10964 | 用于30 dyn/cm2 |
| 兔抗磷酸化SMAD1/5抗体 | Cell Signaling Technologies | 9516 | 适用于PLA |
| 兔抗SMAD2/3 XP抗体 | Cell Signaling Technologies | 8685 | 适用于PLA |
| 兔抗SMAD4抗体 | Cell Signaling Technologies | 9515 | 与BD 610843联用时不适用于PLA |
| 用于µ-Slide的串联连接器 | ibidi | 10830 | 串联连接管路 |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | 通透处理 |
参考文献
- Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
- Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor sig....
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重印与许可
