使用基底板和预先锚定物镜的微型镜进行小鼠钙瞬变研究

摘要

牙科水泥在固化过程中的收缩会取代底板。该协议通过创建牙科水泥的初始基础来最大程度地减少问题，从而留出空间来粘合底板。几周后，底板可以使用很少的新水泥粘合到该脚手架上的位置，从而减少收缩。

摘要

神经科学家使用微型显微镜（微型显微镜）来观察行为自由的动物的神经元活动。加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Miniscope团队为研究人员提供开放资源，让他们自己构建微型镜。V3 UCLA Miniscope是目前使用的最流行的开源Miniscope之一。它允许通过植入浅表皮层的物镜（单透镜系统）对转基因神经元发出的荧光瞬变进行成像，或者通过植入深部大脑的中继透镜和预先锚定在微型镜中的物镜的组合在大脑深处区域成像，以观察中继图像（双镜头系统）。即使在最佳条件下（当神经元表达荧光指示剂并且中继透镜已正确植入时），水泥固化时底板及其与颅骨的连接之间的牙科水泥体积变化也会导致物镜和中继透镜之间距离改变的错位，从而导致图像质量差。底板是帮助将微型镜安装到头骨上并固定物镜和继电器透镜之间工作距离的板。因此，底板周围牙科水泥体积的变化会改变镜片之间的距离。本协议旨在最大限度地减少由牙科水泥体积变化引起的错位问题。该方案通过在中继晶状体植入期间建立牙科水泥的初始基础来减少错位。植入后的恢复时间足以使牙科水泥的基础完全固化底板，因此可以使用尽可能少的新水泥将底板粘合在该支架上。在本文中，我们描述了在小鼠中进行基底镀的策略，以便使用锚定在微型镜中的物镜对神经元活动进行成像。

引言

荧光活性报告基因是神经元活动成像的理想选择，因为它们灵敏且具有较大的动态范围¹，^2，3。因此，越来越多的实验使用荧光显微镜直接观察^{神经元活动1}，²，³，⁴，⁵，⁶，⁷，⁸，⁹，^10，11，^12，13，^14，15，16.第一台小型化单光子荧光显微镜（miniscope）由Mark Schnitzer等人于2011年设计^5。该微型镜使研究人员能够监测行为自由的动物的小脑细胞的荧光动力学5（即，^{对动物没有任何}物理约束，头部约束，镇静或麻醉）。目前，该技术可用于监测大脑浅表区域，例如皮层⁶，⁸，^15，16;皮质下区域，如背侧海马体⁸、¹¹、^13、14 和纹状体^6，17;和深部大脑区域，例如腹侧海马^{体 14}、杏仁核¹⁰，¹⁸ 和下丘脑^8，12。

近年来，已经开发了几种开源微型示波器^{4,5,6,7,11,13,17,19}.如果研究人员遵循加州大学洛杉矶分校（UCLA）微型望远镜团队提供的分步指南，则可以经济地组装微型镜^4,7,11,13.因为神经活动的光学监测受到光传输限制的限制⁷ 在感兴趣的神经元群体之间，设计了一个微型镜，该镜需要将物镜梯度折射率（GRIN）透镜（或物镜）预先锚定在微型镜的底部，以放大从中继GRIN透镜（或中继透镜）中继的视野^{6,7,8,10,16,17}.该中继透镜被植入目标大脑区域，使得目标大脑区域的荧光活性被中继到中继透镜的表面上^{6,7,8,10,16,17}.大约 1/4 的全正弦周期的光穿过物镜 GRIN 透镜（~ 0.25 间距）（图1A1），产生放大的荧光图像^6,7.物镜并不总是固定在微型镜的底部，也不需要植入中继透镜^6,7,11,13,15.具体来说，有两种配置:一种在微型镜中带有固定物镜，另一种在大脑中植入中继镜^{8,10,12,14,16} (图 1B1），另一个只有一个可拆卸的物镜^6,7,11,13,15 (图1B2).在基于固定物镜和植入式中继透镜组合的设计中，来自大脑的荧光信号被带到中继透镜的顶部表面（图1A1)^{7,8,10,12,14,16}.随后，物镜可以放大并透射来自中继透镜顶面的视野（图 1A2).另一方面，可拆卸物镜GRIN镜片设计更加灵活，这意味着将中继镜片预植入大脑不是强制性的（图1B2)^6,7,11,13,15.当使用基于可拆卸物镜设计的微型镜时，研究人员仍然需要将晶状体植入目标大脑区域，但他们可以植入物镜^6,7,11,13,15 或大脑中的中继透镜^6,7.用于植入的物镜或中继透镜的选择决定了研究人员必须使用的微型镜配置。例如，V3 UCLA Miniscope基于可拆卸物镜GRIN镜头设计。研究人员可以选择直接在感兴趣的大脑区域植入物镜，并将"空"微型镜安装到物镜上。^6,7,11,13,15 （单镜头系统; 图1B2）或在大脑中植入中继透镜并安装一个预先固定有物镜的微型镜^6,7 （双镜头系统; 图 1B1).然后，微型镜用作荧光相机，以捕获由基因编码的钙指示剂产生的神经元荧光的实时图像^1,2,3.将微型显微镜连接到计算机后，可以将这些荧光图像传输到计算机并保存为视频剪辑。研究人员可以通过分析一些分析包分析荧光的相对变化来研究神经元活动^20,21 或编写代码以供将来分析。

V3 UCLA Miniscope为用户提供了灵活性，可以确定是使用单镜头还是双^{镜头系统对}神经元活动进行成像7。记录系统的选择基于目标大脑区域的深度和大小。简而言之，单透镜系统只能对表面（小于约2.5毫米深）和相对较大的区域（大于约1.8 x 1.8 mm²）进行成像，因为制造商只生产一定尺寸的物镜。相比之下，双镜片系统可以应用于任何目标大脑区域。然而，用于粘合底板的牙科水泥往往会因物镜和中继透镜之间的距离改变而造成错位，从而导致图像质量差。如果使用双镜头系统，则需要精确定位两个工作距离，以实现最佳成像质量（图1A）。这两个关键的工作距离位于继电器透镜的神经元和底表面之间，以及中继透镜的顶表面和物镜的底表面之间（图1A1）。镜头在工作距离之外的任何错位或错位都会导致成像失败（图1C2）。相比之下，单透镜系统只需要一个精确的工作距离。然而，物镜尺寸限制了其用于监测脑深部区域的应用（适合微型镜的物镜约为1.8~2.0mm⁶，¹¹，^13，15）。因此，物镜的植入仅限于观察小鼠11，¹³的表面和相对较大的脑区域，例如皮层^6，15和背角氨1（^CA1）。此外，必须吸出大面积的皮层以靶向背侧CA1^11，13。由于单透镜配置的限制，无法对脑深部区域成像，商用微型镜系统仅提供组合物镜/中继透镜（双透镜）设计。另一方面，V3 UCLA微型镜可以修改为单镜头或双镜头系统，因为它的物镜是可拆卸^的6，¹¹，^13，15。换句话说，V3 UCLA微型镜用户可以利用可拆卸镜头，将其植入大脑（创建单镜头系统），在进行涉及浅表大脑观察的实验（深度小于2.5毫米）时，或者将其预先固定在微型镜中并在大脑中植入中继镜头（创建双镜头系统）， 在进行涉及深部大脑观察的实验时。双透镜系统也可以应用于浅表观察大脑，但研究人员必须知道物镜和中继透镜之间的精确工作距离。单镜头系统的主要优点是，与双镜头系统相比，错过工作距离的机会更低，因为需要精确定位两个工作距离才能在双镜头系统中实现最佳成像质量（图1A）。因此，我们建议使用单镜头系统进行浅表大脑观察。但是，如果实验需要在深部大脑区域成像，研究人员必须学会避免两个镜头错位。

用于实验的微型镜的双透镜配置的基本协议包括透镜植入和基底电镀⁸，¹⁰，^16，17。基底板是将底板粘在动物的头部上，以便微型镜最终可以安装在动物的顶部，并对神经元的荧光信号进行录像（图1B）。该过程涉及使用牙科水泥将底板粘在颅骨上（图1C），但是牙科水泥的收缩会导致植入的中继透镜和物镜^之间的距离发生不可接受的变化8^，17。如果两个镜头之间的偏移距离太大，则无法聚焦细胞。

使用微型镜进行深部脑钙成像实验的详细方案已经发表^8,10,16,17.这些协议的作者使用了Inscopix系统^8,10,16 或其他定制设计¹⁷ 并描述了病毒选择、手术和底板附着的实验程序。但是，它们的协议不能精确地应用于其他开源系统，例如V3 UCLA Miniscope系统，NINscope。⁶和芬奇镜¹⁹.在加州大学洛杉矶分校Miniscope的双镜头配置中，由于用于将底板粘合到颅骨上的牙科水泥的类型，在使用UCLA Miniscope的双镜头配置中，两个镜头可能会发生错位^8,17 (图1C).需要本方案，因为植入的中继透镜和物镜之间的距离容易由于基底铺设过程中牙科水泥的不良收缩而发生偏移。在基底镀过程中，必须通过调整微型镜和继电器透镜顶部之间的距离来找到植入式中继透镜和物镜之间的最佳工作距离，然后将底板粘合在这个理想位置。在物镜和植入的中继透镜之间设置正确的距离后，可以在蜂窝分辨率（图1B; in vivo 录音）。由于中继透镜的最佳工作距离范围很小（50 - 350 μm）^4,8，固化过程中水泥过度收缩会使物镜和植入的中继镜难以保持在适当的范围内。本报告的总体目标是提供一个减少收缩问题的协议^8,17 在基底电镀过程中发生，并提高双透镜配置中荧光信号的微型镜记录的成功率。成功的微型镜记录被定义为记录自由行为的动物中单个神经元荧光的显着相对变化的实时流。虽然不同品牌的牙科水泥收缩率不同，但研究人员可以选择以前测试过的品牌^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}.然而，由于医疗材料的进口规定，并非每个品牌在某些国家/地区都容易获得。因此，我们开发了测试可用牙科水泥收缩率的方法，重要的是，提供了一种替代方案，可以最大限度地减少收缩问题。与目前的基底电镀方案相比，其优点是提高了使用工具和水泥进行钙成像的成功率，这可以在实验室中轻松获得。加州大学洛杉矶分校微型镜用作示例，但该协议也适用于其他微型镜。在本报告中，我们描述了一种优化的基底电镀程序，并推荐了一些安装加州大学洛杉矶分校微型镜双透镜系统（图2A).介绍了使用加州大学洛杉矶分校微型镜进行双透镜配置的成功植入示例（n = 3只小鼠）和植入失败的示例（n = 2只小鼠），并讨论了成功和失败的原因。

方案

本研究中执行的所有程序均已获得国立台湾大学动物护理和使用委员会的批准（批准文号:NTU-109-EL-00029和 NTU-108-EL-00158）。

1. 牙科水泥体积变化的评估

注意:在固化过程中，牙科水泥的体积会发生变化。在植入和基底之前测试牙科水泥的体积变化。研究人员可以测试任何品牌的牙科水泥，并使用体积变化最小的品牌来粘合底板。 示例如图 3 所示。

1. 称取每种牙科水泥粉0.5克，并将其与适当的溶液（1毫升）混合。
   注意:牙科水泥说明书中推荐的粉末/液体比例为0.5克粉末与0.25毫升溶液以获得固体形式。该测试方案将比例稀释至0.5 g / mL，以便可以液体形式吸入混合物，以测量移液器吸头的体积变化。
2. 使用 0.1-10 μL 移液器吸头去除 2.5 μL 牙科水泥混合物，然后用光固化胶密封移液器吸头。
3. 将尖端放在架子上，标记牙科水泥混合物的最顶层，并在40分钟后测量牙科水泥混合物的水平（补充视频S1）。
4. 除了监测牙水泥固化过程中尖端的水平变化外，还要测量剩余的干牙水泥密度。要计算密度，请测量牙科水泥的重量，并用阿基米德原理测量体积。
   1. 简而言之，将剩余的干牙科水泥放入装满水的杯子中，并称量溢出的水。
5. 对于下面详述的所有方案，使用收缩率最小的牙科水泥。

2.麻醉、手术植入、病毒注射、假基底板

1. 麻醉
   注意:本报告旨在优化加州大学洛杉矶分校微型镜的手术和基底板程序;因此，假设感染目标大脑区域的最佳病毒滴度是已知的。寻找最佳病毒滴度的方法可以在Resendez等人的步骤1至5中找到。⁸.一旦病毒稀释度得到优化，就可以开始手术植入。
   1. 将鼠标放入感应容器中并提供氧气（100%的气流速率为0.2 L / min）。给小鼠预充氧5至10分钟。
   2. 施用5%异氟醚与100%氧气（气流速率:0.2L / min）混合，直到小鼠开始失去平衡并最终被麻醉。
   3. 将小鼠从诱导室中取出并注射阿托品（0.04mg / kg;皮下注射），以防止唾液和丁丙诺啡（0.03mg / kg;皮下注射）作为镇痛药的积聚。
   4. 剃掉老鼠的头。
   5. 戴口罩、无菌服和手套。准备无菌空间和无菌手术器械。在立体定位装置上稳定小鼠的头部（在此步骤中用3至2.5%异氟醚维持麻醉）。镇痛和麻醉程序后，确保耳杆牢固地稳定头部。提供热支持。
   6. 确保头部设置在笔直位置，用甜菜碱对剃光的头部进行消毒，然后用局部镇痛药木洛卡因（10%）喷洒头部。
   7. 在眼睛上涂抹兽药膏以防止干燥。
      注意:在所有麻醉事件中使用眼药膏保护眼睛，以防止眼部受伤。
   8. 通过捏住后爪来测试动物的深层疼痛反射。一旦动物没有表现出爪子撤回反射，继续进行外科手术。
   9. 沿颅骨矢状面中部做一个小切口（从前膛前约 2 毫米开始，到前膛后约 6 毫米结束）。然后，清洁颅骨上的结缔组织，并将三个不锈钢螺钉固定在左额骨和顶骨上。
      1. 此时，将异氟醚降低至1-2%。在整个手术过程中监测呼吸频率。如果呼吸频率太慢（大约1 / s，取决于动物），降低异氟醚的浓度。
   10. 使用尖端直径为 0.7 mm 的毛刺钻头，在手术显微镜或体视显微镜下进行中继晶状体植入的开颅手术。使用微型钻头抓住毛刺钻头并绘制预期圆形区域的轮廓（不需要穿透颅骨的整个厚度）。
       注意:本协议中使用的中继透镜的直径为1.0mm，长度~9.0mm，间距为1，工作距离范围为~100μm-300μm;因此，开颅术的直径为1.2毫米。
       1. 轻轻加深轮廓，直到硬脑膜暴露出来。
       2. 在 3 mL 注射器中准备 3 mL 无菌盐水，并在冰桶中冷却。经常用注射器中的 0.1 mL 盐水冲洗暴露区域，以冷却该区域并防止热损伤和出血。
   11. 用27克针轻轻抠开硬脑膜。
   12. 在距离尖端 1 毫米处的 27 G 钝针上做标记，并用它来小心地吸出大脑皮层，以便为晶状体植入创造一个窗口⁸，11，^13，17（图 2B1）。如果需要，用砂纸研磨 27 G 注射针的尖端来制作钝针。然后，将针头连接到注射器，将注射器连接到管子，并将管子连接到吸力源以产生真空。
       注意:中继透镜是钝的，当它被放入大脑深部区域时会压缩脑组织。因此，皮质的抽吸减少了由于中继晶状体植入而导致的组织损伤。小鼠的皮层厚度约为1毫米，但在体视显微镜下难以观察。该标记创建了一个里程碑，可以比单独使用体视显微镜更精确地确定针的深度。此外，可以根据阻力确定皮层区域是否已到达或通过;皮层的顶部感觉相对柔软，而皮质下区域感觉致密。因此，一旦质地开始感觉更致密，就停止抽吸（图2B3）。
   13. 在 3 mL 注射器中准备 3 mL 无菌盐水，并在冰桶中冷却。用生理盐水冲洗该区域以止血并减少脑水肿的可能性。
2. 腺相关病毒 （AAV） 注射
   注意:AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE用于本实验。jGCaMP7s是一种基因编码的钙指示剂，可发出绿色荧光³。由于本研究使用野生型小鼠作为受试者，因此需要病毒载体用绿色荧光钙指示基因转染神经元并使其表达。使用表达绿色荧光钙指示剂的转基因小鼠作为受试者的研究人员可以跳过方案2.2。
   1. 将20 G静脉（IV）导管的内针安装到立体定位臂上，并以适当的坐标（与中继晶状体植入期间使用的相同坐标）缓慢刺穿（~100 - 200μm / min）大脑（图2B3）。
   2. 以 100-200 μm/min 的速度将显微注射针降低到腹侧 CA1 中，并将 （~ 25 nL/min） 200 nL 的病毒载体注入目标区域（来自前膛的 -3.16 mm AP、3.25 mm ML 和 -3.50 mm DV）。
   3. 等待10分钟，让病毒扩散并尽量减少回流。
   4. 取出（~100-200μm/min）显微注射针。
3. 中继透镜植入
   1. 用75%酒精¹⁰，¹⁶消毒继电器镜头^，然后用无热原盐水冲洗。将晶状体浸泡在冷的无热原盐水中直至植入。
      注意:冷镜片在放入大脑时可最大限度地减少脑水肿。
   2. 使用微型斗牛犬夹（图2B3）握住继电器透镜，其齿已用热缩管覆盖。
      注意:斗牛犬夹可以牢固地固定镜头而不会损坏它。参考Resendez等人8，了解制作管子覆盖的斗牛犬夹的方法。
   3. 缓慢地将中继透镜放在目标区域（距前膛的-3.16 mm AP，3.50 mm ML和-3.50 mm DV）的顶部，并用牙科水泥将其稳定。
4. 假基底电镀
   注意:植入手术期间"假基底"的目的是创建一个牙科水泥基底，以减少几周后在实际基底铺设过程中需要应用的牙科水泥量。通过这种方式，牙科水泥体积变化的风险被降至最低。
   1. 将物镜固定在微型镜的底部，并将底板组装到微型镜上（在此步骤中，固定物镜、底板和微型镜的组件尚未放置在鼠标的头骨上）。
   2. 在底板外侧包裹10厘米的石蜡膜（图4A）。
   3. 使用可重复使用的粘土用立体定位臂探头握住微型镜。
   4. 将物镜对准中继透镜顶部，镜头之间的空间尽可能小（图4B）。
   5. 使用牙科水泥固定底板的定位（使水泥仅接触石蜡膜）。
   6. 牙科水泥干燥后，取下薄膜。
   7. 卸下底板和微型内窥镜。牙科水泥基体是中空的（图4B）。
   8. 为了保护继电器镜头免受日常活动和被鼠标划伤，请用一些模压硅橡胶密封继电器镜头，直到继电器镜头被覆盖，并用一层薄薄的牙科水泥覆盖硅橡胶（图4B）。
   9. 将鼠标从立体定位仪器上脱离，并将鼠标放入恢复室。
   10. 注射卡洛芬（5毫克/千克;皮下注射）或美洛昔康（1毫克/千克;皮下注射）镇痛和头孢他啶（25毫克/千克;皮下注射）预防感染。
       注意:使用抗生素不能替代无菌技术。围手术期抗生素（即头孢他啶）可能适用于某些情况，例如长时间手术或放置慢性植入物。
   11. 观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
   12. 单独饲养小鼠并注射美洛昔康（1mg / kg;皮下注射;q24h）一周以缓解术后疼痛。手术后每天检查动物，确保其正常进食、饮水和排便。
   13. 3 周或更长时间后进行基底铺。

3. 基底电镀

注意:通常，由于回收和病毒孵育时间，基底铺板程序（图5）无法在初始程序的2-3周内进行。基底电镀的诱导程序类似于步骤2.1.1至2.1.8中描述的程序。然而，基底铺不是侵入性手术，动物只需要轻度镇静。因此，只要动物不能在立体定位框架上移动，0.8-1.2%异氟醚就足够了。此外，相对较轻的异氟醚麻醉也有助于^{促进监测期间} 神经元荧光瞬变的表达8（补充视频S2）。

1. 用骨架小心地切割牙科水泥屋顶的薄层，然后去除硅橡胶。用 75% 的酒精清洁继电器镜头的表面。
2. 将固定螺钉固定在底板旁边，将其固定到微型内窥镜的底部（图 5A1）。
   注意: 底板必须牢固地拧紧在微型内窥镜底部下方，因为拧紧和轻紧的底板之间的差异可能会导致距离不一致。
3. 将焦点滑块调整到距主外壳约 2.7 - 3 mm（图 5A2）。
   注意:虽然在基底电镀过程中可以进一步调整长度，但请将其固定为约2.7 mm，因为同时调整微型镜长度和植入式中继透镜和预锚定物镜之间的最佳长度非常混乱。
4. 将微型内窥镜连接到数据采集板，并将其插入计算机上的USB 3.0（或更高版本）端口。
5. 运行加州大学洛杉矶分校团队开发的数据采集软件。
6. 将曝光调整为 255，将增益调整为 64x，将激励 LED 调整为 5%。建议将这些设置用于初始基底板;具体设置将根据大脑区域和基因编码钙指示剂的表达水平而有所不同。
7. 单击 "连接 "按钮，将微型内窥镜连接到数据采集软件并观看直播。
8. 用手将微型物镜对准中继镜，并开始搜索荧光信号（图5B₁）。
   注意:最初，手动搜索荧光信号有助于调整。由于使用AAV系统表达基因编码的钙指示剂，启动子类型和AAV血清型都会影响转染效率^23，24。研究人员应该需要通过找到显示荧光变化的单个神经元来检查钙指示剂的表达，然后再进行未来的实验。
9. 在阻挡微型镜的任何地方钻牙科水泥（可选）。
10. 观看数据采集软件的实时流，并使用中继镜头的边距作为地标（补充视频S2）。接力镜头的边距在显示器上显示为类似月亮的灰色圆圈（图5B1;白色箭头）。
11. 找到中继透镜后，仔细调整微型镜的各种角度和距离，直到找到荧光信号。
    注意:神经元的图像比背景更白。精确的神经元形状表明神经元完美地位于中继透镜的焦平面上。圆形神经元表明它们靠近焦平面。整个大脑的神经元形状是不同的，这里以腹侧CA1为例。
12. 如果没有单个神经元显示荧光随时间的变化，请用硅橡胶重新密封基座。未观察到荧光，因为潜伏期也取决于病毒^23，24的性质。再过一周后执行步骤 3.1-3.12。（这是可选的）。
13. 将微型镜保持在最佳位置，并用可重复使用的粘土将立体定位臂移向微型镜（图 5B2）。用可重复使用的粘土将微型镜粘附在立体定位臂上。
14. 稍微调整 x、y 和 z 臂以搜索最佳视图（补充视频 S2）。接下来，通过在z轴上转动耳杆，齿条或可重复使用的粘土来调整物镜和中继镜表面之间的角度。当至少一个细胞显示荧光瞬变时，病毒表达和晶状体植入成功（图6A;补充视频S2）在基底铺层期间（这也取决于大脑的区域，例如CA1）。
    注:如果显示器仅显示白色单元格而没有瞬变，则还有其他原因（请参阅 图 6B，C、补充视频 S4、S5、结果部分和故障排除部分）。
15. 用牙科水泥粘合底板（图5B2）。
16. 在固井过程中监测感兴趣的区域，以确保最佳位置不会改变。
17. 使用尽可能少的水泥，同时仍然将底板牢固地粘在牙科水泥底座上（图 5B2）。在底板周围涂上第二层和第三层水泥，但要注意不要影响GRIN透镜。
    注意:在此步骤中，将水泥涂在底板上更容易，因为底板的底座是在虚拟电镀过程中形成的。
18. 水泥固化后，小心地将微型镜从底板上拆下。然后，拧上保护盖。
19. 将动物移至恢复笼中。观察动物，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
20. 单独饲养老鼠。确保每天正常进食、饮水和排便。等待5天，让小鼠完全恢复，然后检查钙成像。
    注意:只有少量的牙科水泥固定底板。因此，如果底板自基底铺设程序以来发生了很大偏移，请用钻头取出牙科水泥，然后再次执行底板程序。
21. 麻醉（通过腹膜内注射氯胺酮（87mg / kg）/甲苯噻嗪（13mg / kg）混合物）并在所有实验完成后灌注²⁵ 动物。

结果

牙科水泥体积变化的评估
由于牙科水泥的体积在固化过程中会发生变化，因此可能会显着影响成像质量，因为GRIN透镜的工作距离约为50至350μm^4，8。因此，在这种情况下，在植入和基底铺设程序之前测试了两种市售牙科水泥，Tempron和Tokuso（图5）。首先评估视频以确定水泥是否收缩，然后在完全干燥时比较水泥的体积。将相同浓度和体积的牙科水泥初始混合物装入移液器吸头并录像（补充视频S1）。视频S1展示了两种水泥在干燥过程中都收缩。Tokuso的表现优于Tempron（即，即使在收缩后，它的体积也比Tempron大）: 图3B;坦普龙的平均体积:0.93 ± 0.07 mL;德庄的平均体积:1.18 ± 0.07 mL;t检验:p = 0.048，t_（6） = 2.46，表明它缩小得较小。完全干燥后，水泥的密度...

讨论

本报告描述了使用双镜头加州大学洛杉矶分校Miniscope系统的研究人员的详细实验方案。对于任何希望尝试体内钙成像的实验室来说，我们协议中设计的工具相对实惠。一些方案，如病毒注射、晶状体植入、假基底板和基底板，也可用于其他版本的微型镜系统，以提高钙成像的成功率。除了病毒注射和镜头植入的普遍问题（无论微型镜版本如何）都需要固定外，UCLA底板的结构可能会导致位置偏移，这可能导致物镜和中继透镜之间的工作距离不匹配（图1C）。开发了一种改进的实验方案，以最小化两个镜头的位置偏移（图2，图4，图5）。成功的钙成像可以通过成功的病毒表达、晶状体植入和基底电镀程序的组合来实现（图5C）。使用双透镜系统观察大脑深部区域需要在基底电镀过程中具有很高的精度，因为植入式中继透镜和物镜的相对位置也需要准确。本报告不仅提出了解决基底镀问题的方案，还讨论了病毒注射和晶状体植入...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.7 毫米钻头	#19008-07	精细科学工具;美国	手术
0.1–10 μl 移液器吸头	104-Q;QSP	Fisher Scientific;新加坡	：用于测试牙科粘接剂
20 G IV cathater	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation;日本东京	手术
27 G 针	AGANI，AN*2713R	Terumo Corporation;日本东京	用于手术
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9;1.5*10^13	Addgene 病毒制备;MA，美国	病毒注射
硫酸阿托品		Astart;台湾新竹	手术/假底板/底板
板	V3	http://miniscope.org	假底板/底板
BLU TACK	#30840350	Bostik;美国马萨诸塞州切尔西	可重复使用的粘土;用于手术/假底板/底板
Bone Rongeur Friedman	13 cm	Diener;德国图特林根	，丁
丙诺啡		INDIVIOR 基镀;英国	手术
Carprofen	Rimadyl	Zoetis;Exton， PA	镇痛剂
Ceftazidime		Taiwan Biotech;台湾	预防感染
加州大学洛杉矶分校微型镜的数据采集 PCB	于 https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		，用于基电镀
牙科水泥套装	Tempron	GC Corp;日本东京，	用于检测牙科粘接剂
牙科粘接剂套装	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.;日本东京，	用于测试牙科粘接剂/手术/假底板/底板
双实验室标准与鼠标和大鼠适配器	#51673	Stoelting Co;美国伊利诺伊	用于手术/虚拟底板/底板
Duratear 软膏		Alcon;瑞士日内瓦	，用于手术/假底板/底板
布洛芬		YungShin;台湾	镇痛
Isoflurane		Panion &BF Biotech INC.;台湾桃园	手术/虚拟底板/底板
Inscopix	nVista 系统	Inscopix;加利福尼亚州帕洛阿尔托，	与 V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizer 进行比较;NY， NY	安乐死
手术用生理盐水
微型斗牛犬夹	#12.102.04	Dimedo;德国图特林根，	晶状体植入
Microliter Microsyringes，2.0 &L，25 gauge	#88400	Hamilton;瑞士 Bonaduz	病毒注射
成型硅橡胶	ZA22 Thixo	Zhermack;Badia Polesine，意大利	，用于虚拟基板
物镜梯度指数 （GRIN） 透镜	#64519	Edmund Optics;美国新泽西州 （NJ	） 的虚拟底板/底板
Parafilm	#PM996	Bemis;Neenah，美国	用于虚拟基板
便携式抽吸	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co.， Inc.，台湾台中，	用于手术
Relay GRIN 镜头	#1050-002177	Inscopix;美国加利福尼亚州帕洛阿尔托	用于虚拟底板/底板
不锈钢地脚螺钉	直径 1.00 毫米，总长度 3.00 毫米		，用于手术
立体显微镜	#SL720	Sage Vison;台湾新北市	用于手术/假底板/底板
定位装置	#51673	Stoelting;伊利诺伊州，美国	用于手术/虚拟底板/底板
UV 固化胶粘剂	#3321	Loctite;Dü德国塞尔多夫，	用于测试牙科水泥
V3 UCLA Miniscope，https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components			用于手术/虚拟底板/底板
甲苯噻嗪	X1126	Sigma-Aldrich;密苏里州圣路易斯	，用于安乐死
赛洛卡因泵喷雾 10%		阿斯利康;SöDERTÄlje， 瑞典