牙科水泥在固化过程中会发生收缩，从而导致基板移位。本方案通过形成一层留有空间的牙科水泥初始基底，以减少该问题。数周后，可在该支架上用少量新水泥将基板固定到位，从而降低收缩程度。
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摘要
摘要
神经科学家使用微型显微镜（miniscopes）来观察自由活动动物中的神经元活动。加州大学洛杉矶分校（UCLA）Miniscope 团队为研究人员提供了开放资源，使其能够自行构建微型显微镜。V3 UCLA Miniscope 是目前使用最广泛的开源微型显微镜之一。它可以通过植入大脑皮层表面的物镜（单透镜系统）观察经基因改造的神经元发出的荧光瞬变信号，也可以通过植入深部脑区的中继透镜与预固定在微型显微镜内的物镜组合，观察经中继透镜传递的图像（双透镜系统）。即使在理想条件下（当神经元表达荧光指示剂且中继透镜已正确植入），基板与颅骨之间的牙科水泥在固化过程中发生的体积变化，也可能导致物镜与中继透镜之间距离改变，从而引起光路错位，造成图像质量下降。基板是一种用于将微型显微镜固定在颅骨上并确定物镜与中继透镜之间工作距离的装置。因此，基板周围牙科水泥体积的变化会改变两透镜之间的距离。本实验方案旨在最小化因牙科水泥体积变化所导致的错位问题。该方案通过在植入中继透镜时预先构建牙科水泥的初始基底来减少错位。植入后的恢复时间足以使该水泥基底完全固化，从而可在该支架上以尽可能少的新水泥将基板牢固粘接。本文中，我们描述了在小鼠中进行基板固定的策略，以实现利用微型显微镜内预固定物镜对神经元活动进行成像。
引言
荧光活性报告分子非常适合用于神经元活动的成像，因为它们具有高灵敏度和宽动态范围1,2,3。因此，越来越多的实验采用荧光显微镜直接观察神经元活动1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。2011年，Mark Schnitzer 等人设计了首个微型化单光子荧光显微镜（miniscope）5。该微型显微镜使研究人员能够在自由活动的动物中监测小脑细胞的荧光动态变化5（即无需对动物进行任何物理限制、头部固定、镇静或麻醉）。目前，该技术可用于监测大脑表层区域，如皮层6,8,15,16；皮层下区域，如背侧海马体8,11,13,14和纹状体6,17；以及深部脑区，如腹侧海马体14、杏仁核10,18和下丘脑8,12。
近年来，已开发出多种开源微型显微镜4,5,6,7,11,13,17,19。研究人员若遵循加州大学洛杉矶分校（UCLA）微型显微镜团队提供的逐步操作指南4,7,11,13，即可经济高效地组装微型显微镜。由于神经活动的光学监测受到光在目标神经元群体中传输能力的限制7，因此设计了一种微型显微镜，其底部需预装一个物镜梯度折射率（GRIN）透镜（或称物镜），以放大由中继GRIN透镜（或称中继透镜）传递的视场6,7,8,10,16,17。该中继透镜被植入目标脑区，使得目标脑区的荧光信号被传递至中继透镜的表面6,7,8,10,16,17。大约四分之一周期的正弦光波穿过物镜GRIN透镜（约0.25节距）（图1A1），从而形成放大的荧光图像6,7。物镜并非始终固定在微型显微镜底部，且中继透镜的植入也非必需6,7,11,13,15。具体而言，存在两种配置：一种是微型显微镜中配备固定物镜，同时在脑内植入中继透镜8,10,12,14,16（图1B1）；另一种则仅使用可拆卸的物镜6,7,11,13,15（图1B2）。在采用固定物镜与植入式中继透镜组合的设计中，脑部的荧光信号被传递至中继透镜的顶端表面（图1A1）7,8,10,12,14,16，随后物镜可将中继透镜顶端表面的视场进行放大并传输（图1A2）。另一方面，可拆卸物镜GRIN透镜设计更具灵活性，意味着无需强制预先在脑内植入中继透镜（图1B2）6,7,11,13,15。当使用基于可拆卸物镜设计的微型显微镜时，研究人员仍需将透镜植入目标脑区，但可以选择植入物镜6,7,11,13,15或中继透镜6,7。植入物镜或中继透镜的选择决定了研究人员必须采用的微型显微镜配置。例如，V3 UCLA微型显微镜基于可拆卸物镜GRIN透镜设计。研究人员可选择直接将物镜植入目标脑区，并将"空置"的微型显微镜安装在该物镜上6,7,11,13,15（单透镜系统；图1B2）；或者选择在脑内植入中继透镜，并将已预装物镜的微型显微镜安装其上6,7（双透镜系统；图1B1）。微型显微镜随后作为荧光相机工作，用于捕获由基因编码的钙指示剂产生的神经元荧光实时图像1,2,3。当微型显微镜连接至计算机后，这些荧光图像可被传输至计算机并保存为视频片段。研究人员可通过某些分析软件包20,21分析荧光相对变化来研究神经元活动，或自行编写代码以供后续分析。
V3 UCLA微型显微镜为用户提供了灵活性，可根据需要选择使用单透镜或双透镜系统进行神经元活动成像7。记录系统的选择取决于目标脑区的深度和大小。简而言之，单透镜系统仅能对表浅区域（深度小于约2.5 mm）且相对较大（面积大于约1.8 × 1.8 mm2）的脑区进行成像，因为制造商仅生产特定尺寸的物镜。相比之下，双透镜系统可适用于任意目标脑区。然而，用于粘合基板的牙科水泥容易导致物镜与中继透镜之间的距离发生变化，从而引起透镜错位，造成图像质量下降。若使用双透镜系统，则需精确控制两个工作距离以获得最佳成像质量（图1A）。这两个关键的工作距离分别为神经元与中继透镜底面之间的距离，以及中继透镜顶面与物镜底面之间的距离（图1A1）。任何导致透镜偏离工作距离的错位或放置不当均会导致成像失败（图1C2）。相比之下，单透镜系统仅需精确控制一个工作距离。然而，物镜尺寸限制了其在深部脑区监测中的应用（适用于该微型显微镜的物镜直径约为1.8 ~ 2.0 mm6,11,13,15）。因此，物镜植入仅适用于观察表层且范围较大的脑区，例如小鼠的大脑皮层6,15和海马背侧CA1区（dorsal cornu ammonis 1, CA1）11,13。此外，为靶向背侧CA1区，必须吸除较大面积的皮层组织11,13。由于单透镜结构无法对深部脑区进行成像，目前市面上的微型显微镜系统仅提供组合式物镜/中继透镜（双透镜）设计。而V3 UCLA微型显微镜因其物镜可拆卸6,11,13,15，可改装为单透镜或双透镜系统。换句话说，当实验涉及表层脑区观察（深度小于2.5 mm）时，V3 UCLA微型显微镜用户可利用其可拆卸物镜，将物镜直接植入脑内（构成单透镜系统）；当实验涉及深部脑区观察时，则可将物镜预先固定在显微镜内部，并将中继透镜植入脑内（构成双透镜系统）。双透镜系统也可用于表层脑区的观察，但研究人员必须掌握物镜与中继透镜之间准确的工作距离。单透镜系统的主要优势在于，相较于双透镜系统，其因仅需精确对准一个工作距离，故更不易偏离工作距离（双透镜系统需同时精确对准两个工作距离才能实现最佳成像质量）（图1A）。因此，我们建议在进行表层脑区观察时采用单透镜系统。然而，若实验需要对深部脑区进行成像，研究人员必须掌握避免两片透镜错位的技术。
用于实验的双透镜微型显微镜基本操作方案包括透镜植入和基板粘接8,10,16,17。基板粘接是指将基板粘接到动物头部，以便最终将微型显微镜安装在动物头部上方，从而记录神经元的荧光信号（图1B）。该操作通常使用牙科水泥将基板固定在颅骨上（图1C），但牙科水泥在固化过程中会发生收缩，可能导致植入的中继透镜与物镜之间的距离发生不可接受的变化8,17。如果两透镜之间的距离偏移过大，则无法将细胞调至清晰对焦状态。
使用微型显微镜进行深部脑钙成像实验的详细方案已有文献发表8,10,16,17。这些方案的作者使用了Inscopix系统8,10,16或其他定制化设计17，并描述了病毒选择、手术操作和基板固定的实验流程。然而，这些方案无法精确适用于其他开源系统，例如V3 UCLA微型显微镜系统、NINscope6和Finchscope19。在使用UCLA微型显微镜的双透镜配置进行记录时，由于用于将基板粘接到颅骨上的牙科水泥类型问题，可能导致两个透镜之间发生错位8,17（图1C）。本方案的必要性在于，在基板固定过程中，植入的中继透镜与物镜之间的距离容易因牙科水泥固化过程中的不良收缩而发生偏移。在基板固定过程中，必须通过调节微型显微镜与中继透镜顶端之间的距离，找到植入中继透镜与物镜之间的最佳工作距离，并在此理想位置将基板粘合固定。当中继透镜与物镜之间的正确距离设定后，即可获得细胞分辨率水平的纵向测量数据（图1B；in vivo记录）。由于中继透镜的最佳工作距离范围较小（50–350 µm）4,8，固化过程中过度的水泥收缩可能导致物镜与植入中继透镜难以维持在合适的工作距离范围内。本报告的总体目标是提供一种可减少基板固定过程中收缩问题8,17的方案，以提高双透镜配置下微型显微镜荧光信号记录的成功率。成功的微型显微镜记录定义为：在自由活动动物中，能够记录到单个神经元荧光信号明显相对变化的实时视频流。尽管不同品牌的牙科水泥具有不同的收缩率，研究人员可以选择此前已测试过的品牌6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22。然而，由于某些国家或地区对医用材料的进口管制，部分品牌可能难以获取。因此，我们开发了测试现有牙科水泥收缩率的方法，并重要地提供了一种可最大限度减少收缩问题的替代方案。相较于当前的基板固定方案，本方法的优势在于使用实验室中易于获得的工具和水泥即可提高钙成像的成功率。本文以UCLA微型显微镜为例进行说明，但该方案同样适用于其他微型显微镜系统。在本报告中，我们描述了一种优化的基板固定流程，并推荐了一些适用于UCLA微型显微镜双透镜系统的安装策略（图2A）。同时提供了UCLA微型显微镜双透镜配置下成功植入（n=3只小鼠）和失败植入（n=2只小鼠）的实例，并对成功与失败的原因进行了讨论。
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方案
本研究中进行的所有实验程序均经中国台湾大学动物护理与使用委员会批准（批准号：NTU-109-EL-00029 和 NTU-108-EL-00158）。
1. 牙科水门汀体积变化的评估
注意：牙科水泥在固化过程中会发生体积变化。在植入和基板固定前，应测试牙科水泥的体积变化。研究人员可测试任意品牌的牙科水泥，并选用体积变化最小的品牌用于固定基板。示例见图3。
- 称取每种牙科水泥粉末0.5 g，并将其与相应的溶液（1 mL）混合。
注意：牙科水泥说明书推荐的粉液比为0.5 g粉末对应0.25 mL溶液，以获得固态产物。本测试方案将比例稀释至0.5 g/mL，使混合物保持液态，以便通过移液枪头吸取并测量其体积变化。 - 使用0.1–10 µL移液枪头吸取2.5 µL牙科水泥混合物，然后用光固化胶密封枪头。
- 将枪头置于支架上，标记牙科水泥混合物的最高液面位置，并在40分钟后测量其液面高度（补充视频S1）。
- 除监测牙科水泥在枪头内固化过程中的液面变化外，还需测量剩余干燥牙科水泥的密度。为计算密度，需测量干燥牙科水泥的质量，并利用阿基米德原理测定其体积。
- 简而言之，将剩余的干燥牙科水泥放入盛满水的容器中，称量溢出的水的质量。
- 在以下所有实验方案中，均使用收缩率最小的牙科水泥。
2. 麻醉、手术植入、病毒注射和假基板植入
- 麻醉
注意：本报告旨在优化UCLA微型显微镜的手术及基板固定流程；因此，假设已知感染目标脑区的最佳病毒滴度。寻找最佳病毒滴度的方法可参见Resendez等8的步骤1至5。一旦确定了最佳病毒稀释度，即可开始手术植入。- 将小鼠放入诱导容器中，并提供氧气（流速为0.2 L/min的100%氧气），预充氧5至10分钟。
- 给予5%异氟烷与100%氧气混合气体（气流速：0.2 L/min），直至小鼠失去平衡并最终进入麻醉状态。
- 将小鼠从诱导舱中取出，并皮下注射阿托品（0.04 mg/kg）以防止唾液积聚，以及皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg）作为镇痛剂。
- 剃除小鼠头部毛发。
- 佩戴口罩、无菌手术服和手套，准备无菌操作空间及无菌外科器械。将小鼠头部固定在立体定位仪上（此过程中以3%至2.5%异氟烷维持麻醉）。完成镇痛和麻醉操作后，确保耳杆牢固固定头部，并提供保温支持。
- 确保头部处于正中位置，使用碘伏对剃毛区域进行消毒，然后喷洒10%利多卡因（局部镇痛剂）于头部。
- 在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。
注意： 在所有麻醉过程中均应使用眼膏保护眼睛，以防眼部损伤。 - 通过夹捏后肢足掌测试动物的深部疼痛反射。当动物不再出现足掌回缩反射时，即可进行手术操作。
- 沿颅骨中矢状面做一小切口（起始于前囟前约2 mm，终止于后囟后约6 mm）。随后清除颅骨上的结缔组织，并在左侧额骨和顶间骨上固定三枚不锈钢螺钉。
- 此时将异氟烷浓度降低至1–2%。在整个手术过程中监测呼吸频率。若呼吸过慢（约每秒1次，视个体而定），应降低异氟烷浓度。
- 在手术显微镜或体视显微镜下，使用直径为0.7 mm的磨钻进行颅骨开窗，用于中继透镜的植入。使用微型钻夹持磨钻头，在颅骨上画出预期圆形区域的轮廓（无需穿透颅骨全层）。
注意：本方案所用中继透镜直径为1.0 mm，长度约9.0 mm，节距为1，工作距离范围约为100 µm – 300 µm；因此，颅骨开窗直径为1.2 mm。- 轻柔加深轮廓，直至暴露硬脑膜。
- 用3 mL注射器准备3 mL无菌生理盐水，并将其置于冰桶中冷却。频繁使用注射器中的0.1 mL生理盐水冲洗暴露区域，以降温并防止热损伤和出血。
- 用27G针头轻轻挑起并剥离硬脑膜。
- 在27G钝针尖端距尖1 mm处做一标记，用于小心抽吸大脑皮层，以创建透镜植入窗口8,11,13,17（图2B1）。如有需要，可用砂纸打磨27G注射针头尖端制成钝针。然后将针连接至注射器，再将注射器连接至导管，导管连接至负压源以形成真空。
注意：中继透镜为钝头设计，植入深部脑区时会压缩脑组织。因此，预先抽吸皮层可减少因中继透镜植入造成的组织损伤。小鼠皮层厚度约为1 mm，但在体视显微镜下难以观察。该标记可作为参考点，使针插入深度的判断比仅依赖体视显微镜更为精确。此外，可根据阻力变化判断是否到达或穿过皮层区域：皮层上部触感较软，而皮层下区域则较致密。因此，一旦触感变密，即停止抽吸（图2B3）。 - 用3 mL注射器准备3 mL无菌生理盐水，并置于冰桶中冷却。用生理盐水冲洗该区域以止血并降低脑水肿风险。
- 腺相关病毒（AAV）注射
注意：本实验使用AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE。jGCaMP7s是一种可遗传编码的钙离子指示剂，可发出绿色荧光3。由于本研究采用野生型小鼠作为实验对象，需借助病毒载体将绿色荧光钙指示剂基因转染至神经元中以实现表达。若研究人员使用已表达绿色荧光钙指示剂的转基因小鼠作为实验对象，则可跳过步骤2.2。- 将20G静脉（i.v.）导管的内针安装至立体定位臂上，以约100–200 µm/min的速度缓慢穿刺脑组织至目标坐标（与中继透镜植入时相同的坐标）（图2B3）。
- 以100–200 µm/min的速度将微量注射针下降至腹侧CA1区，并以约25 nL/min的速度向目标区域（从前囟起-3.16 mm前后向，3.25 mm内外向，-3.50 mm背腹向）注入200 nL病毒载体。
- 等待10分钟，使病毒充分扩散并减少反流。
- 以约100–200 µm/min的速度撤出微量注射针。
- 中继透镜植入
- 用75%酒精对中继透镜进行消毒10,16 ，然后用无热原生理盐水冲洗。将透镜浸泡于冷的无热原生理盐水中，直至植入。
注意：低温透镜植入脑内可最大限度减少脑水肿。 - 使用微型止血钳夹持中继透镜（图2B3），止血钳的齿部应包裹热缩管。
注意：止血钳可在不损伤透镜的前提下牢固夹持。有关制作带管止血钳的方法，请参见Resendez等8。 - 以约100–200 µm/min的速度缓慢将中继透镜置于目标区域上方（从前囟起-3.16 mm前后向，3.50 mm内外向，-3.50 mm背腹向），并用牙科水泥固定。
- 用75%酒精对中继透镜进行消毒10,16 ，然后用无热原生理盐水冲洗。将透镜浸泡于冷的无热原生理盐水中，直至植入。
- 假性基板固定
注意："假性基板固定"在植入手术中的目的是预先形成牙科水泥基底，从而减少数周后正式基板固定时所需施加的牙科水泥量。通过这种方式，可最小化牙科水泥体积变化带来的风险。- 将物镜固定在微型显微镜底部，并将基板组装到微型显微镜上（此步骤中，物镜、基板与微型显微镜的整体组件尚未放置于小鼠颅骨上）。
- 用10 cm石蜡膜包裹基板外侧（图4A）。
- 使用可重复使用的黏土将微型显微镜固定在立体定位臂探头上。
- 尽可能缩小物镜与中继透镜之间的间隙，将物镜对准中继透镜上方（图4B）。
- 使用牙科水泥固定基板位置（确保水泥仅接触石蜡膜）。
- 待牙科水泥干燥后，移除石蜡膜。
- 取下基板和微型显微镜。此时牙科水泥基底呈中空状（图4B）。
- 为保护中继透镜免受日常活动影响及小鼠抓挠损伤，用适量成型硅橡胶密封中继透镜直至完全覆盖，并在其表面覆盖一层薄牙科水泥（图4B）。
- 将小鼠从立体定位装置中取出，放入恢复舱中。
- 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）或美洛昔康（1 mg/kg）用于镇痛，皮下注射头孢他啶（25 mg/kg）以预防 感染。
注意： 抗生素的使用不能替代无菌操作技术。围手术期抗生素（如头孢他啶）仅在特定情况下适用，例如长时间手术或植入慢性装置时。 - 观察动物直至其恢复足够意识以维持胸卧位。
- 术后单独饲养小鼠，并连续一周每日皮下注射美洛昔康（1 mg/kg；q24h）以缓解术后疼痛。术后每天检查动物，确保其正常进食、饮水和排便。
- 在术后3周或更长时间后进行正式基板固定。
3. 基底接种
注意：通常，由于恢复期和病毒孵育时间的限制，基础成像（图5）无法在初次手术后的2-3周内进行。基础成像的诱导步骤与2.1.1至2.1.8步骤中所述类似。然而，基础成像并非侵入性操作，动物仅需轻度镇静。因此，只要动物在立体定位仪上无法移动，0.8-1.2%异氟烷即已足够。此外，相对较轻的异氟烷麻醉还有助于在监测过程中促进神经元荧光瞬变信号的表达8（补充视频S2）。
- 使用骨钳小心剪开牙科水泥顶部的薄层，并移除硅橡胶。用75%酒精清洁中继透镜表面。
- 在基板旁边拧紧固定螺钉，将其固定在微型显微镜底部（图5A1）。
注意：基板必须牢固地紧固在微型显微镜底部，因为基板拧紧与否可能导致距离不一致。 - 将调焦滑块调整至距离主壳体约2.7 - 3 mm的位置（图5A2）。
注意：尽管在基板固定过程中可进一步调整长度，但仍建议先固定在约2.7 mm处，因为同时调整微型显微镜长度以及植入的中继透镜与预固定物镜之间的最佳距离会非常混乱。 - 将微型显微镜连接至数据采集板，并插入计算机的USB 3.0（或更高版本）端口。
- 运行由UCLA团队开发的数据采集软件。
- 将曝光值设为255，增益设为64x，激发LED设为5%。这些参数推荐用于初始基板固定；具体设置将根据脑区及基因编码钙指示剂的表达水平而有所不同。
- 点击连接按钮，将微型显微镜与数据采集软件连接，并观察实时图像流。
- 手动对齐微型显微镜的物镜与中继透镜，并开始寻找荧光信号（图5B1）。
注意：最初手动搜索荧光信号有助于调整。由于使用AAV系统表达基因编码钙指示剂，启动子类型和AAV血清型均会影响转染效率23,24。研究人员应在进行后续实验前，通过寻找显示荧光变化的单个神经元来确认钙指示剂的表达情况。 - 如有必要，钻除阻碍微型显微镜的牙科水泥部分（可选）。
- 观察数据采集软件的实时图像流，并以中继透镜边缘作为定位标志（补充视频S2）。中继透镜边缘在显示器上呈现为类似月牙形的灰色圆环（图5B1；白色箭头）。
- 一旦找到中继透镜，仔细调整微型显微镜的各种角度和距离，直至发现荧光信号。
注意：神经元图像比背景更亮。清晰的神经元形态表明神经元正好位于中继透镜的焦平面上。圆形神经元提示其接近焦平面。不同脑区的神经元形态有所不同，此处以腹侧CA1为例。 - 若未观察到单个神经元的荧光随时间发生变化，应重新用硅橡胶密封基底。由于孵育时间也依赖于病毒特性23,24，可能无法立即观察到荧光。可在一周后重复步骤3.1–3.12（此为可选步骤）。
- 将微型显微镜保持在最佳位置，同时使用可重复使用的黏土将立体定位臂移向微型显微镜（图5B2），并用黏土将微型显微镜固定在立体定位臂上。
- 轻微调整x、y和z方向的机械臂以寻找最佳视野（补充视频S2）。随后，通过旋转耳杆、门齿杆或z轴上的可重复使用黏土来调整物镜表面与中继透镜之间的角度。当至少有一个细胞在基板固定过程中显示出荧光瞬变时（这也取决于脑区，如CA1），表明病毒表达和透镜植入成功（图6A；补充视频S2）。
注意：如果显示器仅显示白色细胞但无瞬变信号，则可能存在其他原因（参见图6B、C，补充视频S4、S5，结果部分及故障排除部分）。 - 用牙科水泥将基板（图5B2）固定。
- 在固定过程中持续监测目标区域，确保最佳位置未发生改变。
- 在牢固粘合基板与牙科水泥基底的前提下，使用尽可能少的水泥（图5B2）。可在基板周围再涂第二层和第三层水泥，但需注意不要影响GRIN透镜。
注意：由于在假固定过程中已形成基板底部，此步骤中向基板施加水泥更为容易。 - 待水泥固化后，小心将微型显微镜从基板上取下，然后拧上保护帽。
- 将动物转移至恢复笼中，观察直至其恢复足够意识以维持胸卧位。
- 单独饲养小鼠，确保其每日正常进食、饮水和排便。等待5天让小鼠完全恢复，然后检查钙成像结果。
注意：仅有少量牙科水泥固定基板。因此，若自基板固定后基板发生明显位移，应使用钻头去除牙科水泥并重新进行基板固定操作。 - 所有实验完成后，通过腹腔注射氯胺酮（87 mg/kg）/赛拉嗪（13 mg/kg）混合物麻醉动物，并进行灌注25。
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结果
牙科粘固剂体积变化的评估
由于牙科粘固剂在固化过程中的体积会发生变化，这可能会显著影响成像质量，因为GRIN透镜的工作距离约为50至 350 µm4,8因此，在植入和基板固定手术前，测试了两种市售牙科水泥，即Tempron和Tokuso（图5）。首先通过视频评估水泥是否发生收缩，然后比较其完全干燥后的体积。将相同浓度和体积的牙科水泥初始混合物装入移液枪头中，并进行录像（补充视频 S1视频S1显示，两种水泥在干燥过程中均发生收缩。Tokuso的表现优于Tempron（即，即使在收缩后，Tokuso的体积仍大于Tempron）： 图3B；Tempron 平均体积：0.93 ± 0.07 mL；Tokuso 平均体积：1.18 ± 0.07 mL；t 检验：p = 0.048，t(6) = 2.46，表明其收缩程...
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讨论
本报告详细描述了使用UCLA双透镜微型显微镜系统的研究人员可遵循的实验方案。本方案所设计的工具成本相对较低，任何希望尝试体内钙成像的实验室均可负担。其中一些步骤，如病毒注射、透镜植入、假基板安装和基板固定，也可应用于其他版本的微型显微镜系统，以提高钙成像的成功率。除病毒注射和透镜植入过程中普遍存在且无论使用何种微型显微镜版本都必须解决的一般性问题外，UCLA基板的结构可能导致位置偏移，从而引起物镜与中继透镜之间工作距离不匹配（图1C）。为此，我们开发了一种改进的实验方案，以最大限度减少双透镜的位置偏移（图2，图4，图5）。成功的钙成像依赖于病毒表达、透镜植入和基板固定操作的共同成功（图5C）。使用双透镜系统观察深部脑区时，基板固定操作需要极高的精确度，因为植入的中继透镜与物镜之间的相对位置也必须准确无误。本报告不仅提供了一种解决基板固定问题的实验方案...
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披露
本研究未获得行业支持。作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作得到了中国台湾科技部（108-2320-B-002 -074，109-2320-B-002-023-MY2）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.7毫米钻头 | #19008-07 | Fine Science Tools；美国 | 用于手术 |
| 0.1–10 μl 移液器吸头 | 104-Q；QSP | Fisher Scientific；新加坡 | 用于测试牙科水泥 |
| 20 G IV 导管 | #SR-OX2032CA | Terumo Corporation；日本东京 | 用于手术 |
| 27 号针头 | AGANI, AN*2713R | Terumo Corporation；日本东京 | 用于手术 |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE | #104487-AAV9；1.5×10^13 | Addgene 病毒制备；MA，美国 | 用于病毒注射 |
| 硫酸阿托品 | Astart；中国台湾新竹 | 用于手术/假基板安装/基板安装 | |
| 基板 | V3 | http://miniscope.org | 用于假基板镀层/基板镀层 |
| 蓝丁胶 | #30840350 | Bostik；切尔西，马萨诸塞州，美国 | 可重复使用的黏性黏土；用于手术/模型基板固定/基板固定 |
| 骨咬骨钳 弗里德曼 | 13 cm | Diener；德国图特林根 | 用于基底涂布 |
| 布托啡诺 | INDIVIOR；英国 | 用于手术 | |
| 卡洛芬 | Rimadyl | 硕腾；宾夕法尼亚州艾克斯顿 | 镇痛 |
| 头孢他啶 | 中国台湾生物科技；中国台湾 | 预防感染 | |
| 加州大学洛杉矶分校微型显微镜数据采集印刷电路板 | 在 https://www.labmaker. org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq 购买 | 用于包底 | |
| 牙科水门汀凝固 | Tempron | GC 公司；日本东京 | 用于测试牙科水泥 |
| 牙科水门汀凝固 | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.；日本东京 | 用于测试牙科水泥/手术/假体基板/基板 |
| 双实验室标准，配备小鼠和大鼠适配器 | #51673 | Stoelting公司；美国伊利诺伊州 | 用于手术/假体基板/基板 |
| 杜拉泰软膏 | Alcon；瑞士日内瓦 | 用于手术/假体基板/基板安装 | |
| 布洛芬 | YungShin；中国台湾 | 镇痛 | |
| 异氟烷 | 配体 & BF Biotech INC.; 桃园，中国台湾 | 用于手术/假体基板/基板安装 | |
| Inscopix | nVista 系统 | Inscopix；加利福尼亚州帕洛阿尔托 | 与V3 UCLA Miniscope进行比较 |
| 氯胺酮 | 辉瑞；纽约，纽约州 | 用于安乐死 | |
| 生理盐水 | 用于手术 | ||
| 微型 bulldog 夹 | #12.102.04 | 迪梅多；德国图特林根 | 用于晶状体植入 |
| 微量注射器，2.0 微升 µL，25 号针头 | #88400 | Hamilton；博纳杜兹，瑞士 | 用于病毒注射 |
| 硅橡胶成型 | ZA22 Thixo | Zhermack；Badia Polesine，意大利 | 用于假体基板 |
| 目标梯度折射率（GRIN）透镜 | #64519 | Edmund Optics；新泽西州，美国 | 用于假基板镀层/基板镀层 |
| Parafilm | #PM996 | Bemis；Neenah，美国 | 用于假体基板 |
| 便携式吸液装置 | #DF-750 | 中国台湾台中市，Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc. | 用于手术 |
| 中继梯度折射率透镜 | #1050-002177 | Inscopix；美国加利福尼亚州帕洛阿尔托 | 用于假基板镀层/基板镀层 |
| 不锈钢锚定螺钉 | 直径1.00 mm，总长度3.00 mm | 用于手术 | |
| 体视显微镜 | #SL720 | Sage Vison；中国台湾新北市 | 用于手术/假体基板/基板安装 |
| 立体定位仪 | #51673 | 斯托尔廷；伊利诺伊州，美国 | 用于手术/假基板安装/基板安装 |
| 紫外固化胶 | #3321 | 乐泰；Dü德国杜塞尔多夫 | 用于测试牙科水泥 |
| V3 UCLA 迷你显微镜 | 在 https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components 购买 | 用于手术/假体基板/基板安装 | |
| 赛拉嗪 | X1126 | Sigma-Aldrich；美国密苏里州圣路易斯 | 用于安乐死 |
| 10% 利多卡因泵喷雾 | 阿斯利康；Södertä瑞典 | 用于手术 |
参考文献
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