使用基板植入及预装物镜的微型显微镜进行小鼠钙瞬变研究

摘要

牙科水泥在固化过程中会发生收缩，从而导致基板移位。本方案通过形成一层留有空间的牙科水泥初始基底，以减少该问题。数周后，可在该支架上用少量新水泥将基板固定到位，从而降低收缩程度。

摘要

神经科学家使用微型显微镜（miniscopes）来观察自由活动动物中的神经元活动。加州大学洛杉矶分校（UCLA）Miniscope 团队为研究人员提供了开放资源，使其能够自行构建微型显微镜。V3 UCLA Miniscope 是目前使用最广泛的开源微型显微镜之一。它可以通过植入大脑皮层表面的物镜（单透镜系统）观察经基因改造的神经元发出的荧光瞬变信号，也可以通过植入深部脑区的中继透镜与预固定在微型显微镜内的物镜组合，观察经中继透镜传递的图像（双透镜系统）。即使在理想条件下（当神经元表达荧光指示剂且中继透镜已正确植入），基板与颅骨之间的牙科水泥在固化过程中发生的体积变化，也可能导致物镜与中继透镜之间距离改变，从而引起光路错位，造成图像质量下降。基板是一种用于将微型显微镜固定在颅骨上并确定物镜与中继透镜之间工作距离的装置。因此，基板周围牙科水泥体积的变化会改变两透镜之间的距离。本实验方案旨在最小化因牙科水泥体积变化所导致的错位问题。该方案通过在植入中继透镜时预先构建牙科水泥的初始基底来减少错位。植入后的恢复时间足以使该水泥基底完全固化，从而可在该支架上以尽可能少的新水泥将基板牢固粘接。本文中，我们描述了在小鼠中进行基板固定的策略，以实现利用微型显微镜内预固定物镜对神经元活动进行成像。

引言

荧光活性报告分子非常适合用于神经元活动的成像，因为它们具有高灵敏度和宽动态范围^1,2,3。因此，越来越多的实验采用荧光显微镜直接观察神经元活动^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14}....

方案

本研究中进行的所有实验程序均经中国台湾大学动物护理与使用委员会批准（批准号：NTU-109-EL-00029 和 NTU-108-EL-00158）。

1. 牙科水门汀体积变化的评估

注意：牙科水泥在固化过程中会发生体积变化。在植入和基板固定前，应测试牙科水泥的体积变化。研究人员可测试任意品牌的牙科水泥，并选用体积变化最小的品牌用于固定基板。示例见图3。

1. 称取每种牙科水泥粉末0.5 g，并将其与相应的溶液（1 mL）混合。
   注意：牙科水泥说明书推荐的粉液比为0.5 g粉末对应0.25 mL溶液，以获得固态产物。本测试方案将比例稀释至0.5 g/mL，使混合物保持液态，以便通过移液枪头吸取并测量其体积变化。
2. 使用0.1–10 µL移液枪头吸取2.5 µL牙科水泥混合物，然后用光固化胶密封枪头。
3. 将枪头置于支架上，标记牙科水泥混合物的最高液面位置，并在40分钟后测量其液面高度（补充视频S1）。
4. 除监测牙科水泥在枪头内固化过程中的液面变化外，还需测量剩余干燥牙科水泥的密度。为计算密度，需测量干燥牙科水泥的质量，并利用阿基米德原理测定其体积。

结果

牙科粘固剂体积变化的评估
由于牙科粘固剂在固化过程中的体积会发生变化，这可能会显著影响成像质量，因为GRIN透镜的工作距离约为50至 350 µm^4,8因此，在植入和基板固定手术前，测试了两种市售牙科水泥，即Tempron和Tokuso（图5）。首先通过视频评估水泥是否发生收缩，然后比较其完全干燥后的体积。将相同浓度和体积的牙科水泥初始混合物装入移液枪头中，并进行录像（补充视频 S1视频S1显示，两种水泥在干燥过程中均发生收缩。Tokuso的表现优于Tempron（即，即使在收缩后，Tokuso的体积仍大于Tempron）： 图3B；Tempron 平均体积：0.93 ± 0.07 mL；Tokuso 平均体积：1.18 ± 0.07 mL；t 检验：p = 0.048，t₍₆₎ = 2.46，表明其收缩程.......

讨论

本报告详细描述了使用UCLA双透镜微型显微镜系统的研究人员可遵循的实验方案。本方案所设计的工具成本相对较低，任何希望尝试体内钙成像的实验室均可负担。其中一些步骤，如病毒注射、透镜植入、假基板安装和基板固定，也可应用于其他版本的微型显微镜系统，以提高钙成像的成功率。除病毒注射和透镜植入过程中普遍存在且无论使用何种微型显微镜版本都必须解决的一般性问题外，UCLA基板的结构可能导致位置偏移，从而引起物镜与中继透镜之间工作距离不匹配（图1C）。为此，我们开发了一种改进的实验方案，以最大限度减少双透镜的位置偏移（图2，图4，图5）。成功的钙成像依赖于病毒表达、透镜植入和基板固定操作的共同成功（图5C）。使用双透镜系统观察深部脑区时，基板固定操作需要极高的精确度，因为植入的中继透镜与物镜之间的相对位置也必须准确无误。本报告不仅提供了一种解决基板固定问题的实验方案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.7毫米钻头	#19008-07	Fine Science Tools；美国	用于手术
0.1–10 μl 移液器吸头	104-Q；QSP	Fisher Scientific；新加坡	用于测试牙科水泥
20 G IV 导管	#SR-OX2032CA	Terumo Corporation；日本东京	用于手术
27 号针头	AGANI, AN*2713R	Terumo Corporation；日本东京	用于手术
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE	#104487-AAV9；1.5×10^13	Addgene 病毒制备；MA，美国	用于病毒注射
硫酸阿托品		Astart；中国台湾新竹	用于手术/假基板安装/基板安装
基板	V3	http://miniscope.org	用于假基板镀层/基板镀层
蓝丁胶	#30840350	Bostik；切尔西，马萨诸塞州，美国	可重复使用的黏性黏土；用于手术/模型基板固定/基板固定
骨咬骨钳 弗里德曼	13 cm	Diener；德国图特林根	用于基底涂布
布托啡诺		INDIVIOR；英国	用于手术
卡洛芬	Rimadyl	硕腾；宾夕法尼亚州艾克斯顿	镇痛
头孢他啶		中国台湾生物科技；中国台湾	预防感染
加州大学洛杉矶分校微型显微镜数据采集印刷电路板	在 https://www.labmaker. org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq 购买		用于包底
牙科水门汀凝固	Tempron	GC 公司；日本东京	用于测试牙科水泥
牙科水门汀凝固	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.；日本东京	用于测试牙科水泥/手术/假体基板/基板
双实验室标准，配备小鼠和大鼠适配器	#51673	Stoelting公司；美国伊利诺伊州	用于手术/假体基板/基板
杜拉泰软膏		Alcon；瑞士日内瓦	用于手术/假体基板/基板安装
布洛芬		YungShin；中国台湾	镇痛
异氟烷		配体 & BF Biotech INC.; 桃园，中国台湾	用于手术/假体基板/基板安装
Inscopix	nVista 系统	Inscopix；加利福尼亚州帕洛阿尔托	与V3 UCLA Miniscope进行比较
氯胺酮		辉瑞；纽约，纽约州	用于安乐死
生理盐水			用于手术
微型 bulldog 夹	#12.102.04	迪梅多；德国图特林根	用于晶状体植入
微量注射器，2.0 微升 µL，25 号针头	#88400	Hamilton；博纳杜兹，瑞士	用于病毒注射
硅橡胶成型	ZA22 Thixo	Zhermack；Badia Polesine，意大利	用于假体基板
目标梯度折射率（GRIN）透镜	#64519	Edmund Optics；新泽西州，美国	用于假基板镀层/基板镀层
Parafilm	#PM996	Bemis；Neenah，美国	用于假体基板
便携式吸液装置	#DF-750	中国台湾台中市，Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc.	用于手术
中继梯度折射率透镜	#1050-002177	Inscopix；美国加利福尼亚州帕洛阿尔托	用于假基板镀层/基板镀层
不锈钢锚定螺钉	直径1.00 mm，总长度3.00 mm		用于手术
体视显微镜	#SL720	Sage Vison；中国台湾新北市	用于手术/假体基板/基板安装
立体定位仪	#51673	斯托尔廷；伊利诺伊州，美国	用于手术/假基板安装/基板安装
紫外固化胶	#3321	乐泰；Dü德国杜塞尔多夫	用于测试牙科水泥
V3 UCLA 迷你显微镜	在 https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components 购买		用于手术/假体基板/基板安装
赛拉嗪	X1126	Sigma-Aldrich；美国密苏里州圣路易斯	用于安乐死
10% 利多卡因泵喷雾		阿斯利康；Södertä瑞典	用于手术