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方法文章

利用膜片钳技术研究线粒体产热能力

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DOI：

10.3791/62618

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2021年5月3日

1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

本文内容

摘要

本文详细介绍了利用膜片钳技术测量线粒体内膜H+泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。

摘要

线粒体产热（也称为线粒体解偶联）是增加能量消耗以对抗代谢综合征最有前景的靶点之一。棕色脂肪和米色脂肪等产热组织会发育出高度特化的线粒体以产生热量。其他主要生成ATP的组织中的线粒体，也能将高达25%的线粒体总能量转化为热量，因此可能对整个机体的生理功能产生显著影响。线粒体产热不仅对维持体温至关重要，还能防止饮食诱导的肥胖，并减少活性氧（ROS）的产生，从而保护细胞免受氧化损伤。由于线粒体产热是细胞代谢的关键调节因子，深入理解这一基本过程的分子机制，将有助于开发治疗多种与线粒体功能障碍相关疾病的策略。尤为重要的是，目前对线粒体中产热急性激活的精确分子机制仍知之甚少。这一知识空白在很大程度上是由于缺乏直接测量解偶联蛋白的方法所致。近年来发展出的线粒体膜片钳技术首次实现了对线粒体产热根本现象——质子（H+）通过内膜（IMM）泄漏——的直接研究，并首次对介导该过程的线粒体转运蛋白进行了生物物理表征，包括仅存在于棕色和米色脂肪中的解偶联蛋白1（UCP1），以及存在于其他所有组织中的ADP/ATP转运体（AAC）。这一独特方法将为调控H+泄漏和线粒体产热的机制提供新的见解，并揭示如何靶向这些机制以对抗代谢综合征。本文描述了应用于线粒体的膜片钳技术，通过直接测量IMM上的H+电流来研究其产热能力。

引言

线粒体以作为细胞的“能量工厂”而闻名。事实上，它们是化学能ATP的主要来源。鲜为人知的是，线粒体还能产生热量。实际上，每个线粒体持续生成两种形式的能量（ATP和热量），这两种能量之间的精细平衡决定了细胞的代谢稳态（图1）。线粒体如何在ATP和热量之间分配能量，无疑是生物能量学领域中最根本的问题之一，尽管目前对此仍知之甚少。我们已知的是，增加线粒体产热（称为线粒体生热作用），从而相应减少ATP的生成，能够提高能量消耗，这是对抗代谢综合征的最佳策略之一1。

线粒体产热源于质子（H+）通过线粒体内膜（IMM）的泄漏，导致底物氧化与ATP合成解偶联，从而产生热量，因此被称为"线粒体解偶联"1（图1）。这种H+泄漏依赖于一类称为解偶联蛋白（UCPs）的线粒体转运蛋白。UCP1是最早被发现的解偶联蛋白，仅在线粒体特化为产热功能的产热组织（如棕色脂肪和米色脂肪）中表达2,3,4。在骨骼肌、心脏和肝脏等非脂肪组织中，介导该过程的UCP身份仍存在争议。这些组织中的线粒体可将约25%的总线粒体能量转化为热量，显著影响机体整体生理功能1。除了维持核心体温外，线粒体产热还可通过减少热量摄入来预防饮食诱导的肥胖。此外，它还能降低线粒体活性氧（ROS）的生成，从而保护细胞免受氧化损伤1。因此，线粒体产热参与正常衰老、衰老相关的退行性疾病以及缺血-再灌注等涉及氧化应激的多种病理过程。由此可见，线粒体产热是细胞代谢的重要调控机制，深入理解这一基本过程的作用机制将有助于开发针对多种线粒体功能障碍相关疾病的治疗策略。

线粒体呼吸是首个揭示线粒体产热在细胞代谢中关键作用的技术，至今仍在科研领域最为常用1。该技术基于测量线粒体电子传递链（ETC）的耗氧量，当线粒体内膜（IMM）的H+泄漏被激活时，耗氧量会增加。尽管该技术具有重要作用，却无法直接研究H+跨内膜的泄漏过程1，因而难以精确鉴定和表征介导该过程的蛋白质，尤其是在非脂肪组织中，这些组织的产热功能相较于ATP生成处于次要地位。近年来，应用于线粒体的膜片钳技术的发展，首次实现了对多种组织中整个内膜H+泄漏的直接研究5,6,7。

通过Kirichok等人首次以可重复的方式建立了针对完整线粒体内膜（IMM）的膜片钳技术8。2004年，他们利用COS-7细胞系的线粒体残骸（mitoplasts）首次直接测量了线粒体钙单向转运体（MCU）电流8。随后，Kirichok实验室进一步在小鼠9和果蝇（Drosophila）组织的线粒体内膜中记录到钙电流9。目前，其他实验室也已常规使用该技术研究MCU的生物物理特性10,11,12,13,14。对完整线粒体内膜进行钾离子和氯离子电导的膜片钳分析同样可行，已在多篇论文中被提及，但尚未成为独立研究论文的主要主题6,7,9。2012年，首次报道了来自小鼠棕色脂肪线粒体中跨线粒体内膜的H+电流6，2017年又在小鼠米色脂肪线粒体中检测到该电流7。这种电流由产热组织中特异性的解偶联蛋白UCP1介导6,7。2019年发表的最新研究证实，在心脏和骨骼肌等非脂肪组织中，腺苷酸转位酶（AAC）是介导线粒体H+泄漏的主要蛋白5。

这种独特的方法现在能够直接对介导线粒体产热的线粒体离子通道和转运蛋白进行高分辨率的功能分析。为了促进该方法的推广应用，并与其他研究（如线粒体呼吸）相互补充，本文详细描述了测量由UCP1和AAC介导的H+电流的实验方案。主要包括三个关键步骤：1）从小鼠棕色脂肪中分离线粒体以分析UCP1依赖性H+电流，以及从心脏组织中分离线粒体以分析AAC依赖性H+电流；2）利用法国压榨器（French Press）进行线粒体内膜破裂，制备线粒体基质膜（mitoplasts）；3）对完整内膜（IMM）上的UCP1和AAC依赖性H+电流进行膜片钳记录。

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方案

所有进行的动物实验操作均符合美国国立卫生研究院指南，并已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：线粒体分离步骤基于差速离心法，不同组织之间略有差异。例如，由于棕色脂肪组织富含脂质，在收集线粒体之前，需要额外步骤将细胞碎片和细胞器与脂质相分离。为避免混淆，以下分别详细说明两种线粒体分离方法（一种来自棕色脂肪，另一种来自心脏）。

1. 小鼠肩胛间棕色脂肪线粒体的分离（改编自 Bertholet 等，2020）15

  1. 根据美国兽医协会小组和IACUC委员会的建议，使用CO2窒息法对C57BL/6雄性小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
  2. 将小鼠腹部朝下放置于桌面上，喷洒酒精清洁并润湿毛发（方法修改自Mann等，2014）16。
  3. 用镊子夹住背部皮肤后，在上背部做一条长约2 cm的切口。
  4. 取出小鼠肩胛间棕色脂肪组织，该组织呈蝴蝶状，为双叶型器官16。
  5. 将棕色脂肪转移至一个盛有5 mL预冷分离缓冲液（表1）并置于冰上的35 mm培养皿中。
  6. 在双目显微镜下将棕色脂肪中的白色脂肪组织清除干净。
  7. 将棕色脂肪转移至含有5 mL预冷分离缓冲液（表1）的10 mL烧杯中，切成薄片，然后转移至预冷的10 mL玻璃匀浆器中（使用聚四氟乙烯（PTFE）材质的塑料研杵）。
  8. 使用顶置式搅拌器在冰上以275转/分钟的可控速度轻轻匀浆6次，以均质预切组织。
  9. 将匀浆液在4 °C条件下，于预冷的15 mL锥形管中以8,500 × g离心10分钟，弃去含有脂质相的上清液。
  10. 将沉淀物重悬于5 mL预冷分离缓冲液（表1）中，并再次在冰上以275转/分钟的速度缓慢匀浆6次。
  11. 将匀浆液转移至15 mL预冷锥形管中，在4 °C条件下以700 × g离心10分钟，使所有细胞核和未破裂细胞沉淀。
  12. 将上清液收集至新的15 mL离心管中，并置于冰上保存。
  13. 将上清液在4 °C条件下以8,500 × g离心10分钟，获得含有线粒体的沉淀。
  14. 将含有线粒体的沉淀重悬于3.8 mL预冷的高渗甘露醇缓冲液（表2）中，将线粒体悬液在冰上孵育10–15分钟。

2. 小鼠心脏线粒体的分离（改编自 Garg 等，2019 年）17

  1. 使用 CO₂ 处死 C57BL/6 雄性小鼠2 根据美国兽医协会专家组和IACUC委员会的建议，采用窒息法随后进行颈椎脱位。
  2. 将小鼠仰卧固定后，喷洒酒精清洁并浸湿毛发。随后用镊子夹住皮肤，在胸部做一道2厘米的切口。
  3. 从动物胸腔中取出心脏，置于含5 mL冷分离液的10 mL烧杯中冲洗，以去除全部血液表1).
  4. 心脏中的血液残留清除干净后，将其转移至另一个含有5 mL冷分离缓冲液的10 mL烧杯中（表1）将其切成薄片。然后转移至预冷的10 mL玻璃匀浆器（聚四氟乙烯研杵）中。
  5. 使用 overhead 搅拌器在冰上以每分钟 275 转的可控速度轻轻搅拌六次，使预切组织匀浆化。
  6. 将匀浆转移至预冷的15 mL圆锥形离心管中，在4℃下以700 x g离心 g 在4 °C下离心10分钟，以沉淀细胞核和未破碎的细胞。
  7. 将上清液收集到一个新的15 mL离心管中，并置于冰上。
  8. 将上清液在8,500 x g 4 °C下离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。
  9. 将线粒体沉淀重悬于 3.8 mL 冰冷的高渗甘露醇缓冲液中（表2）并将线粒体悬液置于冰上孵育10–15分钟。

3. 使用法国压滤器通过机械破裂法准备线粒体外膜有缺的线粒体（mitoplasts）。

注意：French press 方法可使内膜（IMM）从外膜（OMM）中释放出来，同时保持其完整性，包括基质和嵴（图2）18。线粒体预先在高渗甘露醇缓冲液（表2）中孵育，并在 French press 处理过程中施加较低压力，以避免外膜破裂时内膜发生剧烈拉伸。

  1. 将线粒体-高渗甘露醇悬浮液装入预冷的微型加压腔（活塞直径为3/8"）中，用于法国压榨机（图3A）。
  2. 选择法国压榨机的中等模式，将悬浮液通过微型加压腔加压，棕色脂肪线粒体的压力调节至法国压榨机刻度110，心脏线粒体则调节至140（约2,000 psi）。 确保悬浮液以大约每秒1滴的速度从微型加压腔中流出。
  3. 用15 mL预冷的冰上锥形管收集液滴。
  4. 在4 ˚C条件下，以10,500 × g 离心10分钟。
  5. 将线粒体外膜破裂后的线粒体（mitoplasts）沉淀重悬于0.5–2 mL冰冻的高渗KCl缓冲液（表3）中，并将悬浮液置于冰上保存。
    注意：棕色脂肪和心脏的线粒体外膜破裂线粒体已可用于膜片钳记录，通常在3–6小时内保持可用。

4. 通过UCP1和AAC介导的H+泄漏的电生理记录5,7,15

注意：使用以下电生理装置（图3B）：配备微分干涉差（DIC）的倒置显微镜、60倍水浸物镜、隔振台和法拉第笼、支持低噪声记录的标准放大器、用于电生理装置的标准数字化器、pClamp 10软件、显微操作器、浴槽参比电极（含银/氯化银颗粒并模制于电极夹持器本体内的3 M KCl-琼脂盐桥，参见Liu等202119）、底部为0.13 mm玻璃盖玻片的灌流腔室，并连接至重力驱动的灌流系统。

  1. 在记录当天使用拉针仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管。在拉针仪上设置一个程序，以生成具有高度可重复性的电极20。
    注意：该程序的设计需要多次尝试，以获得适用于线粒体内膜（IMM）膜片钳实验的优化电极。标准电极应具有细小的、呈渐进圆锥形的尖端。
  2. 将一根玻璃毛细管插入拉针仪中进行拉制，从而从一根硼硅酸盐毛细管获得两个几乎相同的膜片电极。
  3. 当由于拉针仪加热丝老化导致拉制周期间电极不一致时，需调整程序。
  4. 将电极置于电极抛光器内，在100倍放大倍数下将尖端靠近加热丝，进行火焰抛光。
  5. 多次踩下脚踏开关，加热加热丝，避免堵塞或损坏电极尖端曲面。
  6. 抛光至电极在填充基于TMA的电极溶液（TMA为四甲基氢氧化铵，表4）后，电阻介于25至35 MΩ之间。
  7. 将盖玻片（直径5 mm，厚度0.1 mm）预先用0.1%明胶孵育，以减少线粒体外膜的黏附，并在加入线粒体外膜悬液前用KCl浴液（表5）冲洗。
  8. 通过将约35 µL浓缩的线粒体外膜悬液与500 µL KCl浴液（表5）混合，制备原始稀释液，并将其滴加到先前放置于4孔板孔中的盖玻片上。
  9. 在冰上孵育15至20分钟，使线粒体外膜沉降到盖玻片上。
  10. 用约50 µL KCl浴液（表5）完全充满浴槽。
  11. 使用带弯曲尖端的细小微解剖镊子，将带有线粒体外膜的盖玻片转移至浴槽中。
  12. 将盖玻片置于浴槽底部。不要灌流浴槽，以保持线粒体外膜在盖玻片上的稳定性。
  13. 在显微镜下使用60倍物镜扫描盖玻片，选择一个呈“8”字形的非黏附性线粒体外膜。
  14. 用电极液（约50 µL）填充电极，并将其插入电极夹持器中。
  15. 使用微操纵器将电极移入浴液中，并接近选定的线粒体外膜上方，以靠近线粒体内膜（IMM）。放大器程序在电极进入浴液后提供电极电阻值。将膜电位钳制在0 mV，并使用放大器程序中的“膜测试”命令施加10 mV脉冲。
  16. 施加轻微负压，快速在IMM上形成吉欧封接（gigaseal）（图2B）。
  17. 将附着有线粒体外膜的电极提起，使其远离盖玻片，以避免实验过程中因电极漂移导致封接破裂。
  18. 在测试全线粒体外膜构型之前，使用放大器程序中的"膜测试"命令补偿杂散电容瞬变，以在破膜后获得线粒体膜电容（Cm）的准确测量值。
  19. 使用放大器程序施加短时程（5–15 ms）电压脉冲（250–600 mV），以击穿玻璃电极下的膜片，实现全线粒体外膜构型（图2C）。成功破膜的标志是电容瞬变信号的重新出现。
  20. 破膜后，使用放大器程序的膜测试功能拟合电容瞬变信号，以评估膜电容（Cm，反映线粒体外膜大小）及其接入电阻（Ra，反映全线粒体外膜构型的质量）。破膜后，Ra应在40至80 MΩ之间。用于膜片钳实验的线粒体外膜（大小为2–6 µm）通常具有0.5–1.1 pF的膜电容。
  21. 破膜后立即启动灌流，将KCl浴液（表5）替换为HEPES浴液（表6）。
  22. 使用放大器程序设计一个850 ms的斜坡刺激方案，从-160 mV升至+100 mV，间隔5 s，同时将线粒体外膜钳制在0 mV。该方案适用于UCP16,7,15和AAC5的研究（图4和图5）。
    注意：建议在UCP1和AAC依赖性H+电流测量中，使用控制放大器和数模转换器的适当软件，以10 kHz采样频率采集所有电生理数据，并以1 kHz进行滤波。

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结果

线粒体膜片钳技术的发展首次实现了对H+ 通过线粒体内膜（IMM）以及负责该过程的线粒体转运蛋白UCP1和AAC发生质子漏。对UCP1和AAC依赖性H⁺电流的电生理学分析+ 泄漏可初步反映线粒体的产热能力。结果部分描述了测定H+ 通过UCP1和AAC的泄漏

UCP1依赖性H+电流测量（图4）6,7,15
通过施加电压斜坡程序，可在不添加外源性脂肪酸（FA）的情况下，在棕色脂肪线粒体内膜（IMM）上诱导出大幅度的H+电流，而FA通常是UCP的必需激活剂（图4A）。这是棕色脂肪和米色脂肪IMM特有的现象...

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讨论

本文旨在介绍近期应用于线粒体的膜片钳技术，这是一种直接研究线粒体内膜（IMM）上介导质子（H+）漏泄从而导致线粒体产热的新方法5,6,7,15。该技术不仅限于组织样本，还可用于分析HAP1、COS7、C2C12和MEF细胞等不同标准人源及细胞模型中线粒体内膜的H+漏泄及其他电导特性。然而，每种细胞或组织类型的线粒体分离均需进行特定的调整和优化。

本文总结了直接测量棕色脂肪5,6 和心脏5 线粒体内膜（IMM）中 H+ 电流的主要步骤，以阐明在特化产热组织及非脂肪组织中线粒体产热的机制。该技术的建立首次...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

感谢Yuriy Kirichok博士让我有机会参与其实验室的卓越科研工作，并感谢Kirichok实验室成员给予的有益讨论。同时感谢Douglas C. Wallace博士提供AAC1基因敲除小鼠。基金支持：A.M.B. 受美国心脏协会职业发展奖19CDA34630062资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1% 明胶MilliporeES-006-B
60倍水浸物镜，数值孔径 1.20OlympusUPLSAPO60XW
Axopatch 200B 放大器Molecular Devices
硼硅酸盐玻璃毛细管Sutter InstrumentsBF150-86-10
Digidata 1550B 数字转换器Molecular Devices
法拉第屏蔽笼自制
法国压榨机Glen Mills5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 实验室顶置式搅拌器
倒置显微镜OlympusIX71 或 IX73
微电极拉制仪(Narishige)MF-830
微操纵器 MPC-385Sutter InstrumentsFG-MPC325
用于琼脂桥的微电极夹持器World Precision InstrumentsMEH3F4515
微电极拉制仪(Sutter Instruments)P97
法国压榨机小型细胞室Glen Mills5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPMCole ParmerEW-50705-50
100倍放大物镜Nikon  镜头MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10Molecular Devices
灌流腔室Warner InstrumentsRC-24E
Potter-Elvehjem 匀浆器 10 mlWheaton358039
冷冻离心机 SORVALL X4R PRO-MDThermo Scientific75 009 521
小型圆形玻璃盖玻片：直径 5 mm，厚度 0.1 mmWarner Instruments640700
隔振台NewportVIS3036-SG2-325A
化学试剂
D-葡萄糖酸Sigma AldrichG1951
D-甘露醇 Sigma AldrichM4125
EGTA Sigma Aldrich3777
HEPES Sigma AldrichH7523
KCl Sigma Aldrich60128
MgCl2 Sigma Aldrich63068
蔗糖 Sigma AldrichS7903
TMA Sigma Aldrich331635
TrisBase Sigma AldrichT1503
TrisCl Sigma AldrichT3253

参考文献

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