利用膜片钳技术研究线粒体产热能力

摘要

本文详细介绍了利用膜片钳技术测量线粒体内膜H⁺泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。

摘要

线粒体产热（也称为线粒体解偶联）是增加能量消耗以对抗代谢综合征最有前景的靶点之一。棕色脂肪和米色脂肪等产热组织会发育出高度特化的线粒体以产生热量。其他主要生成ATP的组织中的线粒体，也能将高达25%的线粒体总能量转化为热量，因此可能对整个机体的生理功能产生显著影响。线粒体产热不仅对维持体温至关重要，还能防止饮食诱导的肥胖，并减少活性氧（ROS）的产生，从而保护细胞免受氧化损伤。由于线粒体产热是细胞代谢的关键调节因子，深入理解这一基本过程的分子机制，将有助于开发治疗多种与线粒体功能障碍相关疾病的策略。尤为重要的是，目前对线粒体中产热急性激活的精确分子机制仍知之甚少。这一知识空白在很大程度上是由于缺乏直接测量解偶联蛋白的方法所致。近年来发展出的线粒体膜片钳技术首次实现了对线粒体产热根本现象——质子（H⁺）通过内膜（IMM）泄漏——的直接研究，并首次对介导该过程的线粒体转运蛋白进行了生物物理表征，包括仅存在于棕色和米色脂肪中的解偶联蛋白1（UCP1），以及存在于其他所有组织中的ADP/ATP转运体（AAC）。这一独特方法将为调控H⁺泄漏和线粒体产热的机制提供新的见解，并揭示如何靶向这些机制以对抗代谢综合征。本文描述了应用于线粒体的膜片钳技术，通过直接测量IMM上的H⁺电流来研究其产热能力。

引言

线粒体以作为细胞的“能量工厂”而闻名。事实上，它们是化学能ATP的主要来源。鲜为人知的是，线粒体还能产生热量。实际上，每个线粒体持续生成两种形式的能量（ATP和热量），这两种能量之间的精细平衡决定了细胞的代谢稳态（图1）。线粒体如何在ATP和热量之间分配能量，无疑是生物能量学领域中最根本的问题之一，尽管目前对此仍知之甚少。我们已知的是，增加线粒体产热（称为线粒体生热作用），从而相应减少ATP的生成，能够提高能量消耗，这是对抗代谢综合征的最佳策略之一¹。

线粒体产热源于质子（H⁺）通过线粒体内膜（IMM）的泄漏，导致底物氧化与ATP合成解偶联，从而产生热量，因此被称为"线粒体解偶联"¹（图1）。这种H⁺泄漏依赖于一类称为解偶联蛋白（UCPs）的线粒体转运蛋白。UCP1是最早被发现的解偶联蛋白，仅在线粒体特化为产热功能的产热组织（如棕色脂肪和米色脂肪）中表达^2,3,4。在骨骼肌、心脏和肝脏等非脂肪组织中，介导该过程的UCP身....

方案

所有进行的动物实验操作均符合美国国立卫生研究院指南，并已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意：线粒体分离步骤基于差速离心法，不同组织之间略有差异。例如，由于棕色脂肪组织富含脂质，在收集线粒体之前，需要额外步骤将细胞碎片和细胞器与脂质相分离。为避免混淆，以下分别详细说明两种线粒体分离方法（一种来自棕色脂肪，另一种来自心脏）。

1. 小鼠肩胛间棕色脂肪线粒体的分离（改编自 Bertholet 等，2020）¹⁵

1. 根据美国兽医协会小组和IACUC委员会的建议，使用CO₂窒息法对C57BL/6雄性小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
2. 将小鼠腹部朝下放置于桌面上，喷洒酒精清洁并润湿毛发（方法修改自Mann等，2014）¹⁶。
3. 用镊子夹住背部皮肤后，在上背部做一条长约2 cm的切口。
4. 取出小鼠肩胛间棕色脂肪组织，该组织呈蝴蝶状，为双叶型器官¹⁶。
5. 将棕色脂肪转移至一个盛有5 mL预冷分离缓冲液（表1）并置于冰上的35 mm培养皿中。
6. 在双目显微镜下将棕色脂肪中的白色脂肪组织清除干....

结果

线粒体膜片钳技术的发展首次实现了对H⁺ 通过线粒体内膜（IMM）以及负责该过程的线粒体转运蛋白UCP1和AAC发生质子漏。对UCP1和AAC依赖性H⁺电流的电生理学分析⁺ 泄漏可初步反映线粒体的产热能力。结果部分描述了测定H⁺ 通过UCP1和AAC的泄漏

UCP1依赖性H⁺电流测量（图4）^6,7,15
通过施加电压斜坡程序，可在不添加外源性脂肪酸（FA）的情况下，在棕色脂肪线粒体内膜（IMM）上诱导出大幅度的H⁺电流，而FA通常是UCP的必需激活剂（图4A）。这是棕色脂肪和米色脂肪IMM特有的现象.......

讨论

本文旨在介绍近期应用于线粒体的膜片钳技术，这是一种直接研究线粒体内膜（IMM）上介导质子（H⁺）漏泄从而导致线粒体产热的新方法^5,6,7,15。该技术不仅限于组织样本，还可用于分析HAP1、COS7、C2C12和MEF细胞等不同标准人源及细胞模型中线粒体内膜的H⁺漏泄及其他电导特性。然而，每种细胞或组织类型的线粒体分离均需进行特定的调整和优化。

本文总结了直接测量棕色脂肪^5,6 和心脏⁵ 线粒体内膜（IMM）中 H⁺ 电流的主要步骤，以阐明在特化产热组织及非脂肪组织中线粒体产热的机制。该技术的建立首次.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1% 明胶	Millipore	ES-006-B
60倍水浸物镜，数值孔径 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B 放大器	Molecular Devices
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B 数字转换器	Molecular Devices
法拉第屏蔽笼	自制
法国压榨机	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 实验室顶置式搅拌器
倒置显微镜	Olympus	IX71 或 IX73
微电极拉制仪	(Narishige)	MF-830
微操纵器 MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
用于琼脂桥的微电极夹持器	World Precision Instruments	MEH3F4515
微电极拉制仪	(Sutter Instruments)	P97
法国压榨机小型细胞室	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
100倍放大物镜	Nikon  镜头	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
灌流腔室	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem 匀浆器 10 ml	Wheaton	358039
冷冻离心机 SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
小型圆形玻璃盖玻片：直径 5 mm，厚度 0.1 mm	Warner Instruments	640700
隔振台	Newport	VIS3036-SG2-325A
化学试剂
D-葡萄糖酸	Sigma Aldrich	G1951
D-甘露醇	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253