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一种用于人外周血淋巴细胞γ-H2AX焦点检测的自动化显微评分方法

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DOI：

10.3791/62623

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2021年12月25日

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1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

本文内容

摘要

本方案介绍了外周血淋巴细胞中γ-H2AX焦点检测的载玻片制备及自动化计数方法。为展示该检测方法及其灵敏度，分离后的淋巴ocytes接受了辐照处理 体外这种DNA双链断裂检测的自动化方法适用于快速、高通量的生物剂量学应用。

摘要

电离辐射是DNA损伤的强效诱导因素，也是一种有充分文献记录的致癌物。生物剂量测定包括检测电离辐射暴露所引起的生物学效应，以评估个体受照剂量。这一方法在辐射应急事件中尤为重要，因为对受照人员的健康评估和临床治疗方案的制定至关重要。由于DNA双链断裂（DSB）被认为是电离辐射所致DNA损伤中最致命的形式，本实验方案介绍了一种检测血液样本中DNA DSB的方法。该方法基于检测荧光标记的磷酸化DNA修复蛋白γ-H2AX。利用自动化显微成像平台对每个细胞中γ-H2AX焦点数量进行计数，可实现标准化分析，并显著缩短检测周期。因此，γ-H2AX检测法有望成为生物剂量测定中最快且最灵敏的方法之一。在本方案中，将采集健康成年志愿者的全血样本并进行辐照处理 体外 为了说明自动化且高灵敏度的γ-H2AX焦点检测法在生物剂量测定中的应用，采用配备集成荧光显微镜的自动载玻片扫描系统与分析平台，可实现对DNA双链断裂（DSB）的快速、自动化计数，显著降低主观偏差。

引言

自从发现以来，电离辐射（IR）已成为现代医学和工业实践以及农业和军事应用中不可或缺的工具。然而，电离辐射的广泛应用也增加了职业放射工作人员和公众受到辐射过度暴露的风险。电离辐射是一种公认的物理性致癌物，可通过直接或间接方式诱导DNA损伤，从而带来显著的健康风险1,2。因此，进行剂量评估非常重要，因为暴露程度是辐射事故管理中至关重要的初步步骤1。

在发生大规模核或放射性突发事件时，需要进行剂量评估的人员数量可能从几人到数千人不等，具体取决于事故的规模。3在这些情况下，物理剂量测定可能也不明确（例如，剂量计佩戴不当）或无法获取，尤其是在涉及公众成员时。虽然临床症状可用于分诊，但它们并非一定具有辐射特异性，可能导致误诊。因此，建议将生物剂量测定与物理剂量测定及临床评估结合使用。该方法可实现对辐射诱导的细胞水平变化的分析，从而明确识别出需要接受医学治疗的受照个体。4医生随后可利用该生物学剂量评估结果，结合物理剂量重建及其他临床诊断，为患者制定适当的医疗方案。5在暴露情况不明确且受害者为公众成员时，生物剂量学的需求将尤为突出，尤其在对伤员进行分类和医疗管理方面。分类的主要目的是有效区分 "“担忧但健康”的个体，可能具有前驱症状，但未接受高剂量辐射，需与那些需要立即医疗救助和特殊护理的受照个体区分开来。可引起放射病的辐射剂量阈值约为0.75–1.00 Gy。随后，接受该剂量以上辐射的个体 > 暴露于2 Gy辐射的个体有较高风险发生急性放射病，应立即接受医疗救治6,7及时而准确的生物剂量估算对于在这些灾难中受到波及的受害者至关重要。此外，这也能为辐射暴露程度较低的受害者提供安慰和 reassurance8.

辐射防护机构采用多种生物剂量计标志物，这些标志物主要基于检测培养的人类淋巴细胞中的细胞遗传学损伤，例如双着丝粒染色体或微核9荧光法也可用于检测细胞遗传学损伤 原位 荧光原位杂交（FISH）易位检测10然而，传统细胞遗传学方法的主要缺点是在紧急情况下获得结果所需的时间较长8.

DNA 双链断裂（DSB）识别过程的最早步骤之一是组蛋白变体 H2AX 的磷酸化，从而形成 γ-H2AX，并进一步招募修复因子。在过去十年中，利用免疫荧光显微镜检测外周血淋巴细胞中辐射诱导产生的 γ-H2AX 焦点，作为一种可靠的生物剂量学工具，受到越来越多的关注11,12,13,14,15。根据辐射类型和细胞种类的不同，在照射后 0.5 至 1 小时内可检测到最大数量的 γ-H2AX 焦点16,17。人们预期，DNA DSB 的数量与 γ-H2AX 焦点数量之间，以及焦点的消失与 DSB 修复之间，存在密切的相关性。使用脉冲激光微束进行的激光剪切实验已证明，γ-H2AX 焦点定位于 DNA DSB 位点18。尽管这一问题仍在积极讨论中，但最早的一项使用 125I 的研究提示，每细胞中计算出的衰变次数（可代表辐射诱导的 DNA DSB 数量）与所计数的 γ-H2AX 焦点数量之间存在一对一的相关性19,20。

在过去十年中，欧盟资助了MULTIBIODOSE（多学科生物剂量学工具用于管理大规模放射性伤亡）和RENEB（实现欧洲生物剂量学网络）项目，旨在建立一个可持续的生物与回顾性剂量学网络21,22。该项目涵盖了欧洲多个实验室，以评估在发生放射性紧急事件时的应急响应能力14,21,22。γ-H2AX焦点检测法具有多项显著优势，包括处理时间短、可批量处理从而实现高通量，以及在暴露后数小时内使用时具有高灵敏度13,23,24。该方法在低剂量范围内的高灵敏度促使大量研究将其用作评估医学辐射暴露效应的指标，涵盖放射治疗和诊断成像应用25,26,27,28,29,30。这些特性使γ-H2AX焦点检测法成为在大型核事故早期分检中区分重度暴露者与低风险个体的一种极具竞争力的替代方法。多项优化实验表明，使用少量血液即可完成γ-H2AX焦点检测，例如Moquet等人的研究报道，仅需一滴血（指尖采血）即可实施该检测31。类似方法已被应用于全自动高通量RABIT（快速自动化生物剂量学工具）系统的开发中，该系统已优化为可检测来自指尖采血样本的γ-H2AX产率32,33。总体而言，MULTIBIODOSE和RENEB的比对研究结果表明，γ-H2AX焦点检测法在近期（不超过24小时）急性辐射暴露后可作为一种非常有用的分检工具12,13,14。在一项低剂量范围的比对研究中，检测可区分低至10 mGy的剂量与假照射对照样本，突显了该方法在低剂量范围的灵敏度34。需要指出的是，该检测的高灵敏度尤其适用于淋巴细胞，使其成为评估低剂量暴露最合适的细胞类型之一。淋巴细胞主要是非增殖细胞，构成一个同步化的细胞群体。这一特性避免了因DNA复制而导致的γ-H2AX表达，从而显著降低了该检测在细胞周期G2期和S期对辐射诱导的DNA双链断裂（DSB）的干扰35。除了对淋巴细胞在低剂量下的高灵敏度外，γ-H2AX焦点检测的周转时间也显著快于双着丝粒染色体和微核等细胞遗传学技术，因为它无需刺激淋巴细胞增殖。因此，结果可在数小时内获得，而细胞遗传学方法则需数天。该检测的主要缺点是γ-H2AX焦点信号迅速消失，通常在辐射暴露后数天内即恢复至基线水平，具体取决于DNA修复动力学36。因此，该检测在生物剂量学中最适宜的应用是用于初步分检，并优先为特定受害者安排更耗时的细胞遗传学生物剂量学后续检测。然而，对于精确的回顾性生物剂量评估和长期效应分析，若暴露发生在数年前，则必须依赖细胞遗传学技术，例如三色FISH分析以检测稳定的染色体畸变10。

作为多项生物剂量测定计划的一部分，多种检测方法 已评估用于大规模放射性突发事件中人员分诊的其他方法，包括γ-H2AX焦点检测法、双着丝粒检测法、细胞质分裂阻滞微核检测法、电子顺磁共振（EPR）、血清蛋白检测（SPA）、皮肤斑点检测（SSA）、光激发光（OSL）以及基因表达分析 37,38γ-H2AX 焦点检测可定量用于评估 DNA 双链断裂的形成与修复39然而，该检测具有时间依赖性，因为照射后γ-H2AX焦点水平会随着DNA双链断裂修复动力学而随时间变化。40一项比较研究表明，在1 Gy照射后，使用带有z轴载物台功能的显微镜评分可获得最准确的结果，而流式细胞术仅在较高剂量的电离辐射下才能提供可靠结果。41已有大量关于开发用于自动评分的图像分析解决方案的报道42,43,44,45,46在本方案中，采用一种自动化的高通量荧光显微镜平台分析外周血淋巴细胞中的γ-H2AX焦点。使用自动评分系统可避免实验室间和观察者间的评分偏差，同时仍具有足够的灵敏度以检测低于1 Gy的剂量。47. 与用于焦点计分的自由开源软件相比，该系统的主要优势在于从载玻片扫描到图像捕获和计分的整个过程均实现了自动化。用户可定义并保存分类器的设计理念确保了结果的可重复性，从而为结果提供了无偏倚的质量保障。因此，本研究展示了如何利用自动显微扫描与计分方法获得γ-H2AX焦点结果，该方法可用于放射生物学实验室在接收到可能受到过量辐射个体的血液样本后，开展生物学剂量估算。 

方案

本研究已获得西开普大学伦理委员会生物医学研究伦理委员会批准，批准编号 BM18/6/12。

1. 溶液的配制48

  1. 细胞固定液（PBS 中含 3% PFA）
    1. 佩戴适当的个人防护装备（PPE），在通风橱中操作，将 20 g 多聚甲醛加入 200 mL 蒸馏 H2O 中。加热混合物至 60 °C 以促进溶解。
    2. 待 PFA 溶解后，在 30 分钟内小心逐滴加入 40 滴 5 N NaOH，并冷却至室温。用 1 M HCl 调节 pH 至 7，再用蒸馏 H2O 定容至 250 mL（可分装后于 -20 °C 保存 1 年）。取 25 mL 该溶液加入 41.7 mL PBS 中，配制成 3% PFA 溶液。
  2. 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶液：将 10 g BSA 加入 1000 mL PBS 中，搅拌至完全溶解。4 °C 保存备用（最多 72 小时）。
  3. 浓度为 1:500 的 Triton-X 溶液：将 1 µL Triton-X 加入 500 µL PBS 中，4 °C 保存备用（最多 24 小时）。
  4. 抗体溶液
    1. 一抗 — Anti-γ-H2AX，浓度为 1:500：将 1 µL anti-γ-H2AX 加入 500 µL 1% BSA 溶液中，4 °C 保存备用（最多 24 小时）。
    2. 二抗 — DAM-TRITC，浓度为 1:1000：将 1 µL DAM-TRITC 加入 1000 µL 1% BSA 溶液中，4 °C 保存备用（最多 24 小时）。
  5. 完全 Roswell Park Memorial Institute（cRPMI）培养基
    1. 在无菌瓶中向 RPMI 1640 培养基中加入过滤除菌的胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液，终浓度为 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素。

2. 样品制备

注意：本实验方案中，通过静脉穿刺从健康成年志愿者（已签署知情同意书——编号 BM18/6/12，开普敦大学生物医学研究伦理委员会）采集外周全血样本，并收集于含锂肝素的采血管中。开始实验前，确保血液样本和密度为 1.077 g/mL 的密度介质均已平衡至室温。

  1. 在准备好的生物安全柜中，将外周全血以1:1体积比用PBS稀释，并将稀释后的血液轻柔地铺加到等体积至两倍体积、密度为1.077 g/mL的分离液上。铺加时应将离心管倾斜约45°，缓慢加入，确保血液与分离液之间形成清晰界面，避免混合。
  2. 小心将悬液转移至离心机，以900 × g离心20分钟。随后，仅吸取“云雾状”中间层转移至新的无菌锥形管中，用PBS充满该管，再以1000 × g离心10分钟。离心后，用移液器小心吸除上清液，注意勿扰动沉淀；将PBMC沉淀轻柔重悬于1 mL PBS中，再加满PBS至管满。
  3. 重复上述洗涤步骤两次，共完成三次洗涤。
  4. 使用血细胞计数板对PBMC数量进行计数，需知每毫升成人外周血通常可获得约1–1.5 × 106个PBMC49。计数后，将PBMC沉淀重悬并调整浓度至每1 mL完全RPMI培养基（cRPMI）中含有8 × 105个淋巴细胞。然后，取约2 × 106个PBMC或2.5 mL分离所得的PBMC悬液，加入无菌锥形管中，用于后续辐照处理。

3. 样品辐照

警告：应根据辐射防护指南操作辐射设备，并始终佩戴物理剂量计。确保所使用的辐照系统经过校准并正确设置，以达到预期的准确剂量。

  1. 使用 60Co 源在室温下照射外周血单个核细胞（PBMCs）。使用来自南非国家计量研究院（NMISA）获得校准因子的 Farmer 117 型电离室进行校准（TRS-398 协议）50。
    1. 在此项检测中，将锥形管置于 5 mm 厚的丙烯酸板（用于射束入射建成）与 50 mm 厚的反向散射材料之间，当前 60Co 源的剂量率为 0.57 Gy/min，照射野尺寸为 300 mm × 300 mm，源至表面距离为 750 mm，确保剂量分布均匀。
  2. 以 0.125、0.500、1.000、1.500 和 2.000 Gy 的梯度剂量照射 PBMCs，并在对照组房间中保留假照射对照样本，使其仅暴露于环境本底辐射。
  3. 将照射后的样本置于湿润、含 5% CO2 的培养箱中，在 37 °C 下孵育 1 小时，以达到最大数量的 γ-H2AX 焦点。
    ​注意：孵育时间可根据实验设计进行调整。

4. 载玻片制备

注意：载玻片设置请参见图1。

  1. 每种照射条件（或每个锥形管）使用3张涂有正电荷表面的载玻片制备样本（技术重复），以增强细胞黏附。将载玻片放入夹具中，其上放置滤纸卡，再放上漏斗。固定载玻片夹具后，放入细胞离心机中。
  2. 向漏斗中加入250 µL细胞悬液（每张载玻片含200,000个细胞），使用细胞离心机在30 × g条件下离心5分钟。
  3. 细胞离心后，从夹具中取出载玻片，用疏水笔在细胞聚集区域周围画圈，以便在染色过程中使免疫荧光染料保留在贴壁细胞区域。

5. 固定与免疫荧光γ-H2AX染色

注意：所有溶液均需小心地直接添加到由疏水性圆圈标记的细胞区域。染色液应滴加在载玻片上方稍高处，避免移液器吸头扰动细胞。切勿将溶液加至整个载玻片。

  1. 用新鲜配制的3% PFA固定载玻片20分钟。
    注意：载玻片可在含0.5% PFA的PBS中于4 °C保存最多2天，之后再进行免疫染色。随后，在Coplin染色缸中用PBS洗涤载玻片5分钟，然后每张载玻片上加100 µL冷Triton-X溶液，作用10分钟以实现通透化。
  2. 将Triton-X溶液用纸巾吸去，并在1% BSA溶液中洗涤载玻片三次，每次10分钟。此步骤旨在通过阻断非特异性抗体结合来防止非预期背景信号。
  3. 在湿润盒中，室温下每张载玻片加入100 µL 1:500稀释的一抗（抗γ-H2AX抗体），孵育1小时。湿润盒可通过在矩形载玻片储存盒底部放入湿润的纸巾轻松制备。
    1. 用纸巾吸去一抗溶液，在Coplin染色缸中用1% BSA溶液洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的一抗，并防止二抗发生非特异性结合。
  4. 在湿润盒中，每张载玻片加入100 µL 1:1000稀释的二抗（DAM-TRITC抗体）溶液，孵育1小时。用纸巾吸去抗体溶液后，在PBS中洗涤载玻片三次，每次10分钟。
  5. 最后，用柔软无尘的纸巾将载玻片上疏水圈外的液体吸干，加入 1–2滴溶于水性封片剂中的DAPI，轻轻盖上24 × 50 mm的盖玻片，确保无气泡残留，并将载玻片置于4 °C冰箱中过夜。载玻片可在4 °C保存最多2周后再进行扫描。

6. 玻片的自动扫描与评分

注意：扫描系统需要配备荧光显微镜、连接帧抓取器以实现视频图像实时数字化的高分辨率CCD（电荷耦合器件）相机、扫描载物台、用于手动移动的轨迹球、3D鼠标、高速计算机和显示器，以及用于存档的硬盘（图2）。

  1. 分类器设置
    注意：分类器是一组参数，用于定义系统如何检测细胞。该分类器基于预先分类的图像区域训练获得，针对特定显微镜放大倍数、细胞类型和实验室而设定。因此，在当前实验条件下，可能需要对以下参数进行调整以适配实际情况。建议在正式评估前使用参考玻片测试设置。
    1. 图像采集：使用40倍干镜进行成像。为确保所有细胞的图像质量具有一致性，将相机积分时间设为自动模式，并将两个颜色通道的最大积分时间设置为至少1秒（相机增益为4.0）。信号通道采集时使用10个焦平面，平面间距为14/40 µm。
    2. 细胞选择：检测面积在20.00 µm2 至 76.00 µm2 范围内的外周血单个核细胞（PBMCs）。将最大凹陷深度设为0.05，最大长宽比设为1.4，相对灰度阈值设为20%。
    3. 细胞处理：对DAPI复染通道采用直方图最大值算法处理以降低背景。信号通道采用TopHat滤波器处理（强度为7，平滑因子为0），以减少背景并增强信号。
    4. 信号计数：使用设备的“对象计数”（Object Count）功能进行焦点计数。为避免对残留背景信号产生假阳性判断，仅将强度达到细胞内最亮对象强度30%以上的信号计入计数。
  2. 将玻片轻轻用70%乙醇清洁以去除灰尘后，插入或放置到自动扫描平台或载物台。
  3. 玻片设置 — 打开玻片设置对话菜单（图3）
    1. 选择正确的 数据路径，该路径用于指定搜索生成的玻片文件的存储位置。
    2. 为玻片命名，每张玻片必须具有唯一名称。若输入一系列编号列表形式的玻片，可使用“?”作为玻片编号的通配符。
    3. 选择适当的分类器，具体如第1.1–1.4节所述（图4）。
    4. 选择 搜索窗口，若存在与细胞离心机形成的细胞圈匹配的预定义搜索窗口，则选择 预定义，并在“尺寸”列中选择相应的定义；若无可用的预定义搜索窗口，则选择“手动”。此情况下，“尺寸”列无需设置。
    5. 选择 最大细胞计数，并输入所需扫描的最大细胞数量。一旦达到设定的最大细胞计数，即使所选搜索区域尚未完全扫描，搜索也将终止。在生物剂量学应用中，每张玻片自动评分1000个细胞已足够，考虑到每个血样制备3张玻片。点击 确定 以确认设置。
  4. 玻片扫描设置
    1. 点击侧边栏上的 搜索 按钮。若在玻片设置中选择了“手动搜索窗口”，将弹出对话框以确定扫描区域（图5）。使用10倍物镜，通过鼠标左键点击固定搜索区域的两个对角点，交互式地选择矩形搜索区域，并点击 确定 按钮确认。若搜索窗口引用的是预定义窗口，则跳过此步骤。
    2. 系统将提示用户调整对焦起始位置。软件将自动选择参考对象，并提示用户使用40倍物镜对每张玻片的参考细胞核进行对焦和居中，并点击 确定 确认设置。系统将按顺序自动移动至所有玻片。如有需要，可在此步骤中调整 实时图像设置 - 积分时间（图5）。
    3. 检查所有显微镜设置，并点击 确定 确认系统提示。系统将开始自动对焦和扫描程序。扫描完成后，数据将保存至计算机用于分析。扫描系统在完成后将自动关闭。
      注意：请确保显微镜镜筒的拨杆处于将所有光线导向相机的位置。
    4. 搜索结束：当整个搜索区域已完成扫描、达到最大细胞计数或搜索被手动取消时，搜索过程终止。
  5. 玻片分析
    注意：完成的扫描结果如 图6 所示。
    1. 扫描完成后，点击侧边栏上的 图库 按钮。查看由已检测细胞的小图像组成的图库。在此窗口（图7）中，可从下拉菜单中选择标准对图库中存储的细胞进行筛选。细胞通常按检测顺序显示。
    2. 点击 质量直方图/特征值图（图8），以显示已检测细胞的质量度量分布，以及焦点计数的均值和标准差。

结果

本实验方案中，从四名健康成年志愿者的全血中分离出人外周血单个核细胞（PMBCs），并暴露于0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 Gy的辐射剂量。随后，样品在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育1小时。经固定和免疫荧光染色后，载玻片由仪器自动扫描并计数。 图6、7和8展示了软件向用户输出的结果示例。扫描完成后会弹出一个分析窗口，显示所计数焦点的总体概览。结果画廊包含所有被计数的焦点，并配有可交互的菜单，可用于删除异常值，最后提供一个包含详细数据汇总的直方图。

暴露于γ射线后γ-H2AX焦点的产额如图9所示。随着剂量增加，γ-H2AX焦点数量逐渐上升。该图不仅展示了该检测方法的剂量依赖性和灵敏度，还可通过拟合曲线对接受过未知剂量辐射的个体样本进行剂量估算。需要注意的是，对于该个体，无法获得假照射对照组或本底焦点水平的数据。因此，图9中包含了假照射对照样本的0 Gy数据点，本研究中四位成年供体的该值为0.57 ± 0.23 Gy。

显示样本制备、设备和结果布局的离心过程示意图。
图1：细胞离心涂片的制备。 将载玻片放入夹具中，其上放置滤纸片，最后放上漏斗。固定好载玻片夹具后，将其放入细胞离心机中。完成细胞离心后，从夹具中取出载玻片，并使用疏水笔在细胞沉淀区域周围画一个圆圈。请点击此处查看该图的放大版本。

荧光成像显微镜装置；光学分析，屏幕上的数据可视化。
图 2：本方案中使用的自动扫描平台，包含连接至荧光显微镜的自动扫描仪。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于自动显微镜数据处理的图像分析软件界面；MetaSystems 设置。
图 3：载玻片设置菜单。 点击侧边栏中的 SETUP 按钮以打开对话框。选择或输入结果文件的目标目录 请点击此处查看此图的放大版本。

显示细胞分析参数和DAPI染色数据的荧光显微镜软件界面。
图4：分类器设置菜单。 确保所选的分类器设置与当前的细胞类型、制备条件以及样品的染色模式相匹配。请点击此处查看此图的放大版本。

用于显微镜图像分析的 MetaSystems 软件界面，显示手动搜索窗口的设置。
图 5：手动搜索窗口的设置菜单。 在载玻片设置中选择窗口后，将弹出对话框，用于确定扫描区域。使用 10x 物镜时，可通过鼠标左键单击确定搜索区域的两个对角顶点，从而在载玻片上交互式地选定矩形搜索区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

MetaCyte 分析软件界面；细胞成像结果、直方图数据分析、显微镜设置。
图 6：分析窗口，扫描完成后，分析窗口将显示扫描结果。 请点击此处查看此图的放大版本。

使用 Metafer 4 系统进行中期染色体铺展分析；用于 DNA 损伤评估的细胞成像结果。
图 7：选定玻片的图库视图。 图库选项卡位于侧边栏中。图像库由检测到的细胞的小图像组成，以DAPI-TRITC合并图像形式显示。每张图像的左下角和右下角分别显示直接焦点计数和校正后的焦点计数。请点击此处查看此图的放大版本。

用于细胞计数的显微镜数据分析软件界面；直方图；荧光强度
图8：所选载玻片的直方图图像。通过右键单击直方图可打开此窗口。单击直方图后，直方图选项卡页会提供数据分析摘要，列出所分析细胞的平均值、标准差、变异系数、最小值、最大值和中位数。 请点击此处查看该图的放大版本。

辐射剂量-响应；图表、显微镜图像；每细胞焦点分析；剂量与平均焦点数关系图。
图9：淋巴细胞经60Co γ射线照射后，γ-H2AX焦点数量随剂量变化的关系。 误差棒表示供者间个体差异的标准差。数据代表四名健康志愿者的γ-H2AX焦点平均数 ± 标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了一种逐步操作的流程 的 基于自动荧光显微镜的γ-H2AX评分 焦点检测实验。该方法展示了焦点检测实验作为一种高效的时间分辨方法，用于分析辐射诱导的DNA双链断裂（DSB）数量。 在外周血淋巴细胞中进行辐射事故情况下的生物剂量评估 个体可能暴露于未知剂量的电离辐射的环境中。

在本特定方案中，外周血单个核细胞（PBMCs）在体外（in vitro）接受照射，以模拟体内（in vivo）的辐射暴露。照射完成后，细胞在37 °C下孵育1小时，随后使用细胞离心涂片机（cytocentrifuge）制备载玻片，使细胞在玻片上形成集中的细胞斑点。使用细胞离心涂片机对于实现自动化评分的标准化条件至关重要。制片完成后，需使用疏水性记号笔在细胞周围画圈，以限制试剂扩散，减少试剂浪费，并使染色试剂精准覆盖目标区域。此类记号笔可广泛应用于多种免疫染色技术，包括石蜡切片、冰冻切片及细胞学制片。此外，选择一种与酶标和荧光检测系统兼容的疏水性记号笔尤为重要。在完成玻片制备后，进行固定及免疫荧光γ-H2AX染色。本方案中，细胞使用含3%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定20分钟。为确保免疫染色成功，必须保持细胞形态完整，并使抗原位点充分暴露，以便检测试剂有效结合。PFA是一种相对温和的固定剂，可在稳定细胞结构的同时较好地保留蛋白质构象51。优化实验表明，提高PFA浓度或延长固定时间会对玻片质量产生不利影响；但将样本在0.5% PFA中保存（过夜）最长至24小时，仍可获得良好结果。

本方案中使用的初级单克隆抗体2F3可特异性识别DNA双链断裂（DSB）诱导后在丝氨酸139位点发生磷酸化的组蛋白变体H2AX。该抗体能够结合磷酸化位点，且不与其他磷酸化组蛋白发生交叉反应52。由于该初级抗体为鼠源单克隆抗体，因此选择在异源宿主（驴）中制备的抗小鼠次级抗体（DAM-TRITC）进行检测。尽管免疫荧光染色依赖于抗体与表位的特异性结合，但多种分子间作用力仍可能导致非特异性背景染色。为减少非特异性结合，在免疫荧光染色流程中使用封闭试剂至关重要53；本实验采用牛血清白蛋白（BSA）溶液作为封闭剂。此外，应给予充分的封闭时间，在进行初级和次级抗体染色前，将载玻片置于封闭液中孵育至少20分钟。同时，BSA溶液也应作为初级和次级抗体的稀释液。根据所使用的抗-γ-H2AX抗体及次级抗体的具体情况，建议尝试不同的抗体稀释比例，以确定最佳工作浓度。为实现更精确的评分，可进行双重染色，即加入针对其他DNA双链断裂修复蛋白的抗体。

此类分析的一个主要缺点是需要在暴露后尽快采集血样，因为已知照射后48小时内，焦点的最大数量会逐渐下降至正常水平。因此，当辐射事故发生时间及后续采血时间明确时，采用不同照射后时间点建立的校准曲线进行分析可能更为合适 体外 照射（例如，4、8、12 和 24 小时）。然而，正如本文引言部分已提到的，γ-H2AX 焦点检测的优势在于初期快速分诊，应将其用于优先安排更耗时的细胞遗传学生物剂量测定。将多种生物剂量标志物并行使用的联合方案可获得最可靠的剂量估算结果，全球多个生物剂量测定实验室已联合建立全国性网络，可在需要时启动，由具备不同专长的实验室开展多项并行的生物剂量评估。37,54,55此外，针对事故现场或其附近区域的超快速分析，移动实验室的相关研发工作仍在持续进行中56新的、有前景的生物剂量学方法正在不断开发中，有望在未来实现更快速、更可靠的检测通量57.

对于自动图像分析系统，需将载玻片插入或放置在自动扫描平台或载片台上。随后，在连接的计算机上相应文件夹中命名并保存载玻片信息。本实验中，细胞核和焦点的自动检测基于相应的分类器设置。创建分类器时，应确保所选的分类器设置与当前的细胞类型、制备条件以及样本的免疫荧光染色相匹配。分类器中需设定与一抗和二抗激发光谱相匹配的适当荧光通道。如有需要，分类器还允许设置其他评分参数（例如细胞核大小、荧光强度，详见第6.1节）。若实验中联合检测两种或多种DNA修复蛋白（如γ-H2AX和53BP1），系统还可识别信号的共定位。首先，系统获取DAPI图像，进行图像处理，并依据分类器中设定的形态学标准识别细胞核。TRITC信号通过10层z轴堆栈图像获取，焦平面之间的步进尺寸为0.35 mm47。本实验采用“直接焦点计数”分类器，即对细胞核内独立的TRITC信号数量进行计数。需要注意的是，随着辐射剂量增加，焦点信号倾向于融合成更大的结构，若直接计数对象，可能导致实际焦点数量被低估。本研究描述的分析未要求此步骤，但可引入“校正焦点计数”附加步骤以解决该问题。后者使系统能够获取所检测信号的大小，并据此进行加权。结合使用这两种计数方法，可在较高剂量下更真实地估算实际焦点数量。

开始自动扫描时，使用显微镜的10倍物镜，通过鼠标左键单击确定搜索区域的两个对角点，以设定矩形扫描范围。图5），然后聚焦起始位置。系统将自动选择参考物体，并提示用户使用40倍物镜对每张玻片上的参考细胞核进行聚焦和居中。搜索开始后，系统会移动至第一张选定玻片的搜索区域中心，并要求用户居中并聚焦参考物体。该参考物体后续将用作位置参照，以校正细胞位置的任何偏移。参考视野的第二个作用是实现自动光照调节：在透射光模式下，系统会调节光照强度直至达到最佳光照水平；在荧光模式下，光照强度保持固定，但可增加CCD相机的积分时间，直至检测到所需的信号强度。为了实现准确的光照调节，参考视野应包含具有典型染色特征的结构，应避免使用存在高强度染色伪影的视野。完成光照调节后，系统将在最接近参考视野的网格位置启动网格自动聚焦，并继续在规则网格上进行聚焦，以蛇形路径向搜索区域的前方和后方推进。网格自动聚焦完成后即开始扫描。载物台按蛇形路径逐个移动视野以采集数据。当检测到细胞时，其位置和图库图像将被存储并在屏幕上显示，同时细胞计数将更新。若显微镜、载物台或进样器发生错误，搜索将自动中止。整个过程中唯一需要操作人员手动干预的步骤是 在载玻片扫描设置过程中进行快速质量控制检查（如气泡、细胞数量过少、荧光信号褪色或染色伪影），并可根据检查结果决定是否中止对质量不佳载玻片的扫描。当完成全片扫描、达到最大细胞计数或搜索被手动取消时，搜索过程即告终止。扫描完成后，数据将呈现如下所示结果 图6要查看已扫描的细胞，可打开画廊窗口，逐个查看每个细胞（图7）。操作者可通过检查图库图像的聚焦情况以及已计数的细胞总数来进行质量控制。如果大量细胞失焦，或系统检测到的细胞数量过少，无法进行可靠的剂量估算（例如仅检测到100个细胞，而非预设的1000个细胞），则应决定将该玻片及相应的自动计分结果从最终评估中剔除。所有数据均汇总为直方图（图8），以及每个细胞中焦点计数的分布、均值和标准差信息。直方图还可用于根据自动分析结果选择并显示特定的细胞核亚群，以便进行复查。在手动记录每细胞焦点数的分布、均值和标准差后，可对结果进行统计学分析。该图形可用作校准曲线，对生物剂量学样本进行剂量估算，通过趋势线方程对受照剂量进行近似估算。此外， 图9 说明自动扫描具有足够的灵敏度，可检测低剂量下诱导的焦点。此外，结果显示出每细胞焦点数量随剂量呈明显的线性增加。需要注意的是，这些结果仅代表所使用的分类器参数条件下的情况，若分类器参数不同，结果可能会有所差异。因此，在进行生物剂量估算分析时，必须使用与建立校准曲线时相同的分类器和玻片制备方法，以确保剂量估算的准确性。尽管本研究未涉及此方面，但需要指出的是，γ-H2AX焦点检测法也可用于判断局部照射情况。大多数意外辐射暴露属于非均匀或局部照射，即仅身体的局部区域接受了高剂量辐射。已有多个研究表明，利用γ-H2AX焦点检测法可以估算受照射的身体部位所占比例以及该部分所受的辐射剂量。42当进行全身照射时，将随机诱导DNA双链断裂 在所有细胞中均可预期呈现泊松分布。类似于细胞遗传学方法，在外周血淋巴细胞中染色体畸变的诱导往往呈现过分散现象，表现为大量细胞具有多个畸变，同时存在正常中期相的细胞；对γ-H2AX焦点进行污染泊松模型的分散分析同样提示焦点分布呈过分散状态58后者也在 体内 使用小型猪和恒河猴的实验59.

披露

C. Schunck 是德国阿尔特吕斯海姆 MetaSystems Hard & Software GmbH 公司的员工。

致谢

作者谨此感谢研究参与者提供的血液捐献，以及护士 V. Prince 在血液样本采集方面的协助。本研究得到了南非国家研究基金会（NRF）的财政资助，特此致谢。文中表达的观点和得出的结论均为作者个人观点，不一定代表 NRF 的立场。本工作还得到了国际原子能机构（IAEA）的财政支持，包括通过技术合作项目（编号：URU6042）对 W. Martínez-López 提供的支持，以及协调研究项目 E35010（合同编号：22248）的支持。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白 - BSA默克A3059
科普林瓶SigmaS6016
盖玻片（24 x 50 mm）LasecGlass2C29M2450Rec
冻存管（1.2 mL）WhiteSci607101
细胞离心涂片医疗科技JC370-12-L
细胞离心涂片夹医疗科技JC302
细胞离心涂片滤纸卡医疗科技JC307
细胞离心涂片漏斗医疗科技JC372
DAM-TRITCInvitrogenA16022
DAPI-FluroshieldSigma/MerckF6057
乙醇KimixETD901
滤器吸头WhiteSci 200 µl (312012) 和 1000 µl (313012)
盐酸 - HCl默克
HistopaqueSigma/Merck10771
锂–肝素采血管科学团队367526
美迪生 - Metafer元系统Azio Imager Z2：195-041848
NaOH默克221465
NovoPenLeica BiosystemsNCL-PEN
多聚甲醛Sigma/Merck158127
磷酸盐缓冲液片剂分离技术SH30028,02
移液器WhiteSciP11037 和 P1033X-tra 切角载玻片在 45 度角处切角° 角度以帮助减少玻璃破损。
纯化的抗H2A.X磷酸化（Ser139）抗体Biolegend613402 / 100 μg
RPMI 培养基WhiteSciBE12-702F
Triton X-100（辛基苯基聚氧乙烯醚-9）Sigma/MerckT-9284
15 ml 离心管WhiteSci601002
X-Tra 粘附载玻片 – 剪取组织块SMM Technologies3800200E

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H2AX DNA
一种用于人外周血淋巴细胞γ-H2AX焦点检测的自动化显微评分方法
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