三维 体外 基于胶原支架的神经母细胞瘤仿生模型

摘要

本文列出了在先前描述的三维胶原基支架上接种神经母细胞瘤细胞系所需的步骤，包括在预定时间内维持细胞生长，并回收支架以进行多种细胞生长和细胞行为分析及后续应用，可根据不同的实验目的进行调整。

摘要

神经母细胞瘤是儿童中最常见的颅外实体瘤，占所有小儿癌症死亡病例的15%。原发肿瘤组织是一个复杂的三维（3D）微环境，由癌细胞和非癌细胞多层结构组成，并被细胞外基质（ECM）所包围。ECM提供物理和生物学支持，并影响疾病进展、患者预后及治疗反应。

本文介绍了一种利用神经母细胞瘤细胞系和基于胶原蛋白的支架组装三维支架系统以模拟神经母细胞瘤微环境的实验方案。支架中添加了纳米羟基磷灰石（nHA）或糖胺聚糖（GAGs），这些成分在骨组织和骨髓中天然存在且浓度较高，而骨和骨髓正是神经母细胞瘤最常见的转移部位。这些支架具有三维多孔结构，可促进神经母细胞瘤细胞的黏附、增殖和迁移，并形成细胞簇。在此三维基质中，细胞对治疗药物的反应更接近于体内实际情况。

基于支架的培养系统能够维持比传统二维（2D）细胞培养更高的细胞密度。因此，初始接种细胞数量的优化方案取决于预期的实验时间范围。该模型通过DNA定量评估细胞生长、通过代谢活性检测评估细胞活力，以及通过组织学染色评估细胞在支架内的分布情况来进行监测。

该模型的应用包括基因和蛋白质表达谱的评估，以及使用常规药物和miRNA进行细胞毒性检测。三维培养系统可精确调控细胞和细胞外基质（ECM）组分，从而构建出更接近天然肿瘤组织生理状态的微环境。因此，这种三维 体外 该模型将促进对疾病发病机制的理解，并提高所获得结果之间的相关性 体外, 体内 在 动物模型和人类受试者

引言

神经母细胞瘤是一种起源于胚胎发育期或出生后早期的儿童交感神经系统肿瘤，由神经嵴细胞的转化所致¹。它是儿童中最常见的实体性颅外肿瘤，占15岁以下患者所诊断恶性肿瘤的8%，并导致约15%的儿童癌症死亡。该疾病的临床表现具有高度异质性，其特征为特定的染色体、遗传和表观遗传改变以及组织病理学特征。

这些改变导致神经母细胞瘤更具侵袭性，并使儿科患者的预后不良。因此，目前的治疗方法对近80%临床表现为侵袭性疾病的患者长期疗效不佳²，这表明对该类患者的治疗仍面临挑战。这很可能是因为神经母细胞瘤的异质性和转移机制尚未被充分理解。然而，目前普遍认为肿瘤微环境（TME）在多种癌症的进展中发挥重要作用；但在神经母细胞瘤中，TME 仍缺乏充分研究^3,4。

原生肿瘤微环境（TME）是一种复杂的三维微环境，包含癌细胞和非癌细胞，并被细胞外基质（ECM）所包围。ECM是指组织中的非细胞成分，为细胞提供结构和生化支持，并影响疾病进展、患者预后及治疗反应⁵。这种对疾病进展的促进作用源于细胞与ECM之间持续的双向相互作用，即“动态互作”^6,7,8。随着癌症的发展，间质胶原蛋白常被重新排列成垂直于间质-癌组织界面的线性结构，癌细胞可利用这些结构作为迁移路径，实现转移^9,10,11。

该天然功能性生物支架的主要成分包括Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白构成的纤维网络以及其他蛋白质，如弹性蛋白、层粘连蛋白等糖蛋白，以及多种蛋白聚糖和其他可溶性成分^12,13这些天然细胞外基质中的蛋白质现已成为开发三维结构的有吸引力的天然生物分子 体外 模型³3D支架的应用 体外 细胞培养因其相较于传统二维单层培养更能真实反映肿瘤微环境（TME）的生理特性而日益受到关注。所制备的三维支架有助于细胞的黏附、增殖、迁移、代谢以及对刺激的响应，这些特性在体内环境中均可见到。 体内 生物系统。

这些三维支架的主要成分为胶原蛋白，它在多种正常的生物学过程中发挥关键作用，包括组织修复、血管生成、组织形态发生、细胞黏附和迁移¹¹基于胶原蛋白的三维基质在模拟细胞外基质（ECM）方面已展现出强大的功能性，可作为 体外 仿生微环境，同时支持细胞与细胞外基质的相互作用以及细胞的迁移和侵袭。在多种癌症模型中，这些三维基质相较于传统的二维或“平面”培养，能够更准确地分析细胞对化疗药物的反应。^14,15,16，包括神经母细胞瘤^17,18三维细胞培养的遗传学分析已表明，即使与动物模型相比，其与人体组织特征的相关性也更高¹⁹总体而言，这些三维支架的核心在于为细胞提供一个适宜的 体外 环境，可重现天然组织结构并促进分子间的双向串扰⁸.

为了提高基于胶原蛋白模型的复杂性，可在组织工程过程中引入其他常见的细胞外基质（ECM）成分，从而构建出更能反映不同组织特定微环境（TME）的生理相关模型。例如，糖胺聚糖（GAGs）是一类存在于所有哺乳动物组织中的带负电荷多糖²⁰，可促进细胞的黏附、迁移、增殖和分化。硫酸软骨素是一种存在于骨和软骨中的特定类型GAG，既往已用于骨修复相关的组织工程应用中^{21,22,23,24,25}。纳米羟基磷灰石（nHA）是人骨组织矿化成分中的主要无机成分，按重量计可占骨组织的65%²⁶，因此被广泛用于骨替代和骨再生²⁷。因此，GAGs和nHA是重建原发性神经母细胞瘤ECM以及模拟神经母细胞瘤最常见转移部位——骨髓（70.5%）和骨（55.7%）——的理想复合材料²⁸。

最初，包含这些细胞外基质（ECM）组分的支架是为骨组织工程应用而开发的，并对其生物相容性、毒性以及成骨传导性和成骨诱导性特征进行了广泛分析^29,30。这些支架是基于胶原蛋白的多孔基质，通过冷冻干燥技术制备，以调控其物理和生物学特性。添加了纳米羟基磷灰石（nHA）的胶原支架（Coll-I-nHA）或添加了硫酸软骨素-6（chondroitin-6-sulfate）的胶原支架（Coll-I-GAG），已成功用于模拟乳腺癌的主要肿瘤微环境（TME）³¹，以及前列腺癌¹⁵和神经母细胞瘤¹⁷向骨转移的过程。用于制造这些复合支架的冷冻干燥技术可使支架内部的孔径大小和孔隙率具有可重复的均一性^22,23,24。简而言之，通过将纤维状胶原与0.05 M乙酸混合，制备出0.5 wt%的胶原浆液。对于Coll-I-GAG支架，在混合过程中向胶原浆液中加入0.05 wt%从鲨鱼软骨中分离得到的硫酸软骨素-6。对于复合型Coll-I-nHA支架，纳米级羟基磷灰石颗粒按先前所述方法合成²⁷，并在混合过程中以与胶原质量比为2:1的比例加入胶原浆液中。所有支架均通过在105 °C下进行24小时的脱水热处理实现物理交联并完成灭菌²⁵。使用活检打孔器制得圆柱形支架（直径6 mm，高度4 mm），并可在蒸馏水（dH₂O）中用3 mM盐酸N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺和5.5 mM N-羟基琥珀酰亚胺（EDAC/NHS）进行化学交联，以改善支架的力学性能³⁰。这一高度优化的两种胶原支架制造工艺，可获得具有可重复力学性能的支架，包括孔径大小、孔隙率和刚度（kPa）。Coll-I-GAG和Coll-I-nHA支架具有不同的物理特性，从而形成不同的微环境条件。每种支架的具体特性见表1。

	Coll-I-GAG	Coll-I-nHA
支架尺寸 （直径 [mm] × 高度 [mm]）	6 × 4 17	6 × 4 17
胶原蛋白浓度（wt. %）	0.5 17	0.5 17
基质浓度（wt. %） （基于胶原蛋白重量）	0.05 15,17	200 17
平均孔径（μm）	96 22	96 – 120 29
孔隙率（%）	99.5 23	98.9 – 99.4 27
刚度（kPa）	1.5 27	5.5 – 8.63 29

表1：用于研究神经母细胞瘤生物学的两种支架材料力学性能概述。

本文介绍了一种基于三维支架系统的构建方案，该系统通过使用神经母细胞瘤细胞系以及先前描述的胶原基支架（添加了nHA（Coll-I-nHA）或硫酸软骨素-6（Coll-I-GAG））来更好地模拟神经母细胞瘤的微环境。本方案包括下游分析方法，利用此前从二维单层培养中优化而来的经济高效的技术，以在更接近生理条件的环境中研究神经母细胞瘤细胞的生长机制图1。

图1：整体实验流程示意图。（A）将细胞培养至足够数量，进行传代、计数，并重悬于适当体积的培养基中。（B）对该细胞储备液进行系列稀释，制备共4种不同密度的细胞悬液。（C）将基于胶原的支架无菌接种于非黏附性24孔板中，（D）将20 µL细胞悬液加入每个支架中央，于37 °C、5% CO₂、95%湿度条件下孵育3–5小时。（E）随后缓慢向每个支架中加入完全培养基（1 mL），并将培养板放回培养箱中，使细胞在所需时间段内继续生长。（F）在每个预设的时间点，取出若干支架用于细胞活力与生长评估、基因表达分析以及组织学染色。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 实验设计

注意：每个实验所需的支架和细胞数量取决于实验规模，可使用本节实验设计中的工具进行计算。

1. 所需支架数量
   1. 确定整个实验的时间线以及细胞生物学变化（例如细胞生长和代谢）的评估间隔。
      注意：例如，实验时间为14天，每7天评估一次细胞生长情况。因此，实验时间点为第1、7、14天，共3个时间点。
   2. 接下来，确定在每个时间点需要进行的实验应用数量。尽量在每个时间点完成相同的分析，以监测变化。
      注意：在支架上进行细胞生长的典型分析包括细胞活力检测、DNA定量、组织学染色与成像以及基因表达分析。这些内容将在第5节中进一步讨论。
   3. 决定何时对同一支架进行多种下游应用，例如，在使用适当的检测方法完成细胞活力评估后，可将该支架重新用于DNA/RNA提取（见5.1.11节）。
   4. 每种应用至少保留3个生物学重复，例如，3个支架用于细胞活力和DNA定量，3个用于组织学分析，3个用于基因表达分析。由于每个时间点共需9个支架，因此3个时间点共需27个支架。
   5. 最后，将此数量乘以实验参数或条件的数量（例如，评估多种细胞系、初始接种密度、支架组成）。
      注意：在本方案中，针对一种细胞系评估了4种不同的初始接种密度，因此共需108个支架（27个支架 × 4种条件）。为避免人为误差并提供额外余量，建议在此基础上增加约10%，例如，若需108个支架，则准备120个支架。
2. 所需细胞数量
   注意：建议在第0天将20 µL细胞悬液接种于圆柱形支架（直径6 mm，高度4 mm）上。每20 µL细胞悬液中的细胞数量应根据实验设计进行调整，具体计算见第1.1节。常见的初始接种密度为每20 µL含2 × 10⁵个细胞，本方案以下内容以此为例。
   1. 为计算实验所需的总细胞数量，将每20 µL含2 × 10⁵个细胞的初始接种量乘以所需支架总数。
      ​注意：例如，30个支架 × 20 µL = 总体积600 µL。若每个支架需要2 × 10⁵个细胞，则600 µL悬液中共含6 × 10⁶个细胞（2 × 10⁵ × 30），即最终需要6 × 10⁶个细胞置于600 µL中。实验参数的数量将决定所需细胞的总数。因此，本方案采用多层细胞培养瓶进行细胞培养，其容量相当于10个传统的175 cm²培养瓶。

2. 胶原蛋白支架的制备

注意：采用既定方法制备 Coll-I-nHA 和 Coll-I-GAG 圆柱形支架（直径 6 mm，高度 4 mm）^15,21,27. 按照先前发表的方法进行化学交联后¹⁷支架必须在1周内使用。

1. 在制备具有理想机械性能的支架后，确保支架完全水化，并用磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤。
   注意：此过程通常在支架交联后约需 12 小时，可在 4 °C 条件下使用 100 mL 组织培养废液容器进行，每个容器最多放置 50 个支架，每支架使用 2 mL PBS。
2. 将支架保存在 4 °C 的 PBS 中，直至使用前。

3. 在多层细胞培养瓶中扩增神经母细胞瘤细胞

注意：多层培养瓶的最佳接种密度会有所变化。对于本实验所用的培养瓶，根据制造商的说明，最佳密度为 1 × 10⁷ 个细胞。在接种多层培养瓶之前（见第 3.1 节），需先在适当的组织培养瓶（例如 T175 cm² 组织培养瓶）中将细胞扩增至 1 × 10⁷ 个细胞或更高的密度。为接种细胞至多层培养瓶，需将细胞培养至 70–80% 汇合度，然后收集细胞并计数每毫升的细胞数量，具体操作参见步骤 3.2.16–3.2.20 中的细胞计数方法。细胞悬液计数完成后，应立即进行多层培养瓶的接种。所有细胞培养操作均须在超净工作台内进行，以维持无菌环境。

1. 多层细胞培养瓶的接种
   1. 将550 mL完全培养基（根据所用细胞系不同而有所变化）和100 mL无菌PBS在37 °C水浴中预热20分钟。
   2. 利用收获的细胞悬液，根据公式（1）计算达到最佳接种密度（1 × 10⁷ 个细胞）所需的细胞悬液体积，其中WANT表示多层培养瓶接种所需细胞数量，HAVE表示细胞悬液中每毫升的细胞数：
        (1)
      ​例如，
   3. 将所需体积的细胞悬液加入100 mL预热的培养基中。
   4. 在生物安全柜中取一个新的多层培养瓶，打开瓶盖，将培养瓶保持在60°倾斜角度。沿瓶颈倾斜侧缓慢移取全部100 mL细胞悬液注入瓶内。盖上瓶盖，将培养瓶侧放，使细胞均匀分布于各层中。
   5. 保持60°倾斜角度，通过缓慢倾倒或沿瓶颈倾斜侧移液的方式向多层培养瓶中加入400 mL预热的培养基。若瓶颈已满，可将培养瓶恢复直立状态，或盖上瓶盖后侧放，再继续加液。
      注意：倾倒时应缓慢进行，以避免产生过多气泡。轻轻敲击直立状态的培养瓶，使所有气泡上升至顶部，并用10 mL移液器将其去除。确保培养基加至瓶颈螺纹底部；如有需要，可补充更多培养基以达到该液位。
   6. 盖紧多层培养瓶，置于37 °C、5% CO₂、95%湿度条件下培养。
   7. 每2–3天观察一次细胞生长情况，评估汇合度。为观察多层培养瓶底部两层的细胞汇合情况，可在倒置显微镜下使用4倍物镜进行检查。
      注意：当接种1 × 10⁷个神经母细胞瘤细胞时，10层培养瓶通常需要一周时间达到汇合状态，但具体时间可能因所用细胞系而异。
2. 多层培养瓶中细胞的常规维护
   1. 将550 mL完全培养基（根据所用细胞系不同而有所变化）、50–100 mL胰蛋白酶溶液和300 mL无菌PBS在37 °C水浴中预热20分钟。
   2. 检查多层培养瓶中细胞是否达到70–80%汇合度。
   3. 将多层培养瓶放入超净工作台，倾倒弃去废培养基。开始时倾斜培养瓶，使液体经气坝流入废液容器。倾倒过程中，将培养瓶旋转180°，使液体沿倾斜瓶颈流下。沿此轴线来回旋转培养瓶，以尽可能去除残留液体。
   4. 沿倾斜瓶颈缓慢加入100 mL预热的无菌PBS洗涤细胞。盖上瓶盖，将培养瓶侧放以使PBS均匀分布，并来回轻轻旋转培养瓶以充分洗涤细胞。
   5. 以与步骤3.2.3相同的方式弃去PBS洗涤液，重复洗涤步骤。
   6. 将50 mL预热的胰蛋白酶与50 mL预热的无菌PBS混合稀释。向多层培养瓶中加入100 mL稀释后的胰蛋白酶溶液，盖上瓶盖，将培养瓶侧放，使胰蛋白酶均匀分布。若细胞系贴壁性较强，可使用100 mL未稀释的胰蛋白酶。
   7. 将培养瓶置于37 °C、5% CO₂、95%湿度条件下孵育2–5分钟，并在显微镜下观察细胞脱落情况。如有需要，可轻敲培养瓶以促进细胞脱落，或将其放回培养箱继续孵育1分钟。
   8. 将多层培养瓶放回超净工作台，加入100 mL培养基以中和胰蛋白酶。盖上瓶盖，将培养瓶侧放，并来回轻轻摇动，确保胰蛋白酶完全中和。
   9. 将中和后的细胞悬液倾入4个50 mL锥形离心管中。
      注意：如需完全收获所有细胞，应再次用100 mL无菌PBS冲洗多层培养瓶，并将冲洗液倒入2个50 mL离心管中。
   10. 将细胞悬液在50 mL离心管中以340 × g离心3–4分钟，使细胞沉淀。
   11. 将离心管放回超净工作台，小心弃去尽可能多的上清液。
       注意：沉淀体积较大且较为疏松，容易被破坏。
   12. 向每个沉淀中加入1–5 mL培养基，通过反复吹打数次重悬细胞。
   13. 将4个重悬的细胞悬液合并至一个50 mL离心管中，用移液器充分混匀，并记录总体积。
   14. 对细胞悬液进行适当稀释以便计数，使血细胞计数板每个外侧大方格内的细胞数在30–100个之间。
       ​注意：合适的起始稀释比例为1:100；操作时，取10 µL细胞悬液加入新的15 mL锥形离心管中，加入990 µL无菌PBS稀释。反复吹打数次以充分混匀。
   15. 在进行细胞计数的同时，将装有细胞储备液的50 mL离心管放回培养箱中保温。
   16. 取一块洁净的血细胞计数板，如图2所示，盖上盖玻片。
   17. 向血细胞计数板计数室中加入10 µL稀释后的细胞悬液。若未加完10 µL时计数室已满，则停止加样。
   18. 将血细胞计数板置于光学显微镜的4倍物镜下，调节粗调和细调焦旋钮以清晰观察细胞。
   19. 计数计数室四个角的大方格中的细胞数量，如图2所示。将四个计数结果相加后除以4，计算每个大方格的平均细胞数。

图2：使用血细胞计数板进行细胞计数。 将10μl细胞悬液加入血细胞计数板盖玻片下方。然后将计数板置于显微镜的4倍物镜下，计数网格四个外角区域内的细胞数量。请点击此处查看该图的放大版本。

20. 将平均计数值乘以稀释倍数（例如 100），再将所得数值乘以 10,000，使用公式（2）计算每毫升的细胞数量。
    (2)
21. 通过将细胞浓度（细胞/mL）乘以细胞储备液的总体积，计算储备液中细胞的总数（例如，若将 4 个重悬的沉淀混合后得到 20 mL 溶液，则将细胞/mL 数乘以 20）。
22. 为维持多层培养瓶的培养，使用步骤 3.1.2 中所述公式（1）计算重新接种 1 × 10⁷ 个细胞至培养瓶所需的细胞储备液体积，并执行步骤 3.1.3–3.1.6 以重新接种培养瓶。若准备接种支架，则进入下一节。

4. 在支架上接种神经母细胞瘤细胞

1. 制备细胞储备悬液
   注意：本方案将概述制备四种不同接种密度的神经母细胞瘤细胞的步骤，每种密度之间相差2倍。因此，将通过连续稀释法从储备悬液中制备另外三种细胞悬液。细胞培养操作必须在超净工作台中进行，以保持无菌状态。
   1. 使用公式（3）根据多层培养瓶中的总细胞数（见第3.2.19节计数结果），计算制备第一种接种密度或细胞储备悬液所需的细胞体积。
       (3)
      注意：例如，若最高接种密度为每个支架接种6 × 10⁵个细胞，共需30个支架，每个支架接种20 µL细胞悬液，则储备细胞悬液需含1.8 × 10⁷个细胞（6 × 10⁵个细胞 × 30个支架），总体积为600 µL（20 µL × 30个支架）。
      由于将从此悬液进行连续稀释，因此上述数值需加倍，即总共1200 µL体积中含有3.6 × 10⁷个细胞。将其换算为每毫升所需细胞数（WANT）：将3.6 × 10⁷除以1200 µL，再乘以1000 µL，得到3 × 10⁷个细胞/mL。
      ​
   2. 将所需体积的细胞储备液加入无菌的2 mL或15 mL离心管中，并用培养基补足至终体积1200 µL。将此管标记为密度1（图3）。
2. 通过连续稀释法制备多种接种密度的细胞悬液。
   1. 根据步骤4.1.1中制备的密度1，按照图3所示方法，通过连续稀释法制备另外三种细胞悬液密度。
   2. 用培养基将每种密度稀释2倍。首先，在三个无菌的2 mL或15 mL离心管中各加入所需的终体积（以上述例子为600 µL）的培养基。
   3. 将密度1的一半（600 µL）转移至其中一个离心管中，充分混匀细胞悬液与培养基以完成稀释。将该管标记为密度2。
   4. 将密度2的一半（600 µL）转移至下一个离心管中，充分混匀细胞悬液与培养基以完成稀释。将该管标记为密度3。
   5. 将密度3的一半（600 µL）转移至下一个离心管中，充分混匀细胞悬液与培养基以完成稀释。将该管标记为密度4。
   6. 从密度4中弃去600 µL，使所有四种悬液的最终体积均为600 µL。
   7. 作为阴性对照，仅向一个无菌的2 mL离心管中加入600 µL培养基。连续稀释过程的示意图见图3。

图3：对细胞原液进行梯度稀释，以制备用于四种不同支架接种密度的4种细胞悬液。（A）数值可根据每块支架所需的接种密度进行调整，（B）再乘以每个密度所需的支架总数，每块支架接种20 µL细胞悬液。本示例中，密度1要求每块支架接种6 × 10⁵ 个细胞，即30块支架共需1.8 × 10⁷ 个细胞溶于600 µL培养基中。该体积的细胞悬液需加倍以启动梯度稀释过程，即将600 µL转移至下一管并加入600 µL新鲜培养基进行稀释。此过程依次进行，直至获得4种细胞悬液，每种之间浓度相差2倍。通过向一支试管中仅加入600 µL培养基制备阴性对照。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 将细胞悬液加入支架中
   注意：将保存在 PBS 中的支架从冰箱中取出，并在添加细胞前使其恢复至室温（RT）。
   1. 将含 PBS 的支架移入超净工作台。
   2. 使用无菌镊子将支架转移至非黏附性 24 孔板中，每孔放置一个支架（图 1C）。用镊子轻轻夹住支架的角部，将其轻压在容器壁上以去除多余的 PBS。将支架以皮肤面朝下的方向置于孔中央（即支架的光滑层朝下，贴向塑料 24 孔板）。
   3. 在 24 孔板上标记细胞系名称、相关参数（例如接种密度）和时间点。每次操作一种细胞接种密度，其余密度的细胞继续保留在 37 °C 培养箱中，待使用时再取出。
   4. 在超净工作台内，使用 P20 移液器和无菌吸头，将 20 µL 相应的细胞悬液轻轻加至每个支架的中央（图 1D）。在向支架加样过程中，需充分混匀细胞悬液以保持细胞均匀悬浮。确保悬液停留在支架表面而不滑落至孔底，否则将影响细胞在支架上的附着。
   5. 加完细胞后，将 24 孔板置于培养箱中孵育 3–5 小时（37 °C，5% CO₂，95% 湿度），以使大部分细胞完成附着。
   6. 孵育结束后，缓慢而轻柔地向每孔加入 1 mL 预热的生长培养基（图 1E）。使用 P1000 移液器加液，以便更缓慢、可控地操作，防止支架移位。若处理大量支架，可使用 10 mL 移液器，并将移液枪调至“滴加”和“低速”模式。
   7. 将 24 孔板在培养箱中过夜孵育（37 °C，5% CO₂，95% 湿度）。
4. 支架上细胞的维持培养
   1. 细胞附着后的第一个 24 小时（第 1 天），将已接种的支架转移至新的非黏附性 24 孔板中，并加入 1–2 mL 新鲜生长培养基。
      注意：此步骤可去除未附着于支架而沉降至塑料 24 孔板底部的细胞。如第 5 节所述，指定为第 1 天的支架将在 24 小时后终止实验，因此这些支架无需进行后续维持操作。
   2. 初期每隔 2–3 天观察一次支架，注意生长培养基颜色的变化。随着培养时间延长及细胞在支架内增殖，应增加换液频率。
   3. 使用 10 mL 移液器，在慢速模式下吸除 1 mL 废培养基并弃去。若实验需要收集条件培养基，则将生物学重复样本的废培养基收集于 15 mL 离心管中，以 340 × g 离心 2 分钟以沉淀细胞碎片，将上清液转移至新管中，并于 -80 °C 保存。
   4. 再次使用移液器的滴加功能，轻柔地向支架中加入 2 mL 预热的生长培养基，并将 24 孔板放回培养箱（37 °C，5% CO₂，95% 湿度）。在整个目标培养期间，每当培养基耗尽时均需重复此步骤。

5. 支架的回收与应用

注意：在每个时间点，可采用多种方法来监测细胞在支架上的生长情况，或评估基因和蛋白质的表达谱。支架的取出条件取决于后续要进行的分析，不同的取出方法将在下述小节中详细说明，并在图4中进行演示。

1. 评估支架内细胞活力
   1. 在超净工作台中，将适量的细胞活力检测试剂通过0.2 µm无菌滤膜过滤至离心管中进行灭菌。将此无菌溶液连同完全培养基和无菌PBS一同置于37 °C水浴中预热。
   2. 在超净工作台中，使用无菌镊子将待检测的支架转移至新的24孔板中，并在板上标记所有相关信息。
      注意：实验需设三个重复。
   3. 向每个孔中加入900 µL预热的培养基，随后加入100 µL无菌细胞活力检测试剂。设置阴性对照：在不含支架的孔中加入900 µL培养基和100 µL无菌细胞活力检测试剂。盖上孔板盖后，轻轻摇动约3分钟，使稀释后的细胞活力检测试剂均匀分布。将孔板置于37 °C、5% CO₂、95%湿度条件下孵育。
      注意：不同细胞系的孵育时间需优化，具体请参考试剂生产商的说明书。对于神经母细胞瘤细胞系，4–6小时的孵育时间较为理想。
   4. 孵育结束后，从培养箱中取出孔板，轻轻摇动数秒。
   5. 在超净工作台中打开一个新的半透明96孔板。从24孔板的每个孔中取出孵育后的培养基与试剂，分别转移100 µL至96孔板中的三个孔，形成技术重复。
      注意：此操作后，24孔板每孔中将剩余700 µL液体。
   6. 用铝箔纸包裹96孔板，避免细胞活力检测试剂暴露于光线下。
   7. 移除并弃去24孔板中每个支架孔内剩余的700 µL液体。用1 mL无菌PBS对每个支架清洗两次。
      ​注意：支架中的颜色可能无法完全清除。清洗后的支架可用于后续实验，例如DNA定量分析，方法是将其置于含1% Triton X-100的0.1 M碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液中1 mL，并于-80 °C保存（参见第5.2节，图4B）。
   8. 将96孔板从超净工作台中取出，使用酶标仪在570 nm和600 nm波长下测定各孔的吸光度。记录两个波长下的吸光度值，并根据试剂生产商的说明计算细胞对检测试剂的还原百分比。
   9. 使用适当的软件绘制细胞活力结果图表并进行统计分析。输入生物学重复数据以生成误差线，反映实验的变异性。
   10. 为分析实验时间段内细胞活力的变化，使用适当的生物统计学软件进行单因素方差分析（ANOVA），并进行均值间的多重比较。
   11. 在图表中标注不同时间点之间的显著性差异：ns（P>0.05）、*（P≤0.05）、**（P≤0.01）、***（P≤0.001）和****（P≤0.0001）。

图4：各时间点用于不同分析的支架回收流程。（A）回收三个支架重复样本用于细胞活力分析。（B）这些支架随后可在PBS中洗涤，置于含1% Triton X-100的0.1 M NaHCO₃溶液中，并于-80 °C保存，用于DNA定量。（C）另取三个重复样本用10% PFA固定15分钟，PBS中中和后于4 °C保存，用于组织学染色与成像。（D）最后，再取三个重复样本加入基于苯酚/胍的细胞裂解试剂中，于-20 °C保存，用于基因表达分析。缩写：PBS = 磷酸盐缓冲盐水；PFA = 多聚甲醛。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 支架中细胞DNA的定量
   注意：如步骤5.1.7后的注释所述，用于DNA定量的支架回收过程包括将支架放入含有1 mL 1% Triton X-100的0.1 M NaHCO₃溶液的2 mL离心管中，随后在-80 °C下保存。在进行DNA分析之前，细胞必须经历三次冻融循环，以充分裂解神经母细胞瘤细胞并释放可用于定量的DNA。
   1. 将先前在-80 °C下保存于Triton X-100中的样品取出，在室温下放置1–3小时，或直至完全解冻。
   2. 涡旋振荡样品10–20秒，然后将样品重新置于-80 °C下冷冻18–24小时，或直至完全冻结。重复此过程，共完成三次冻融循环。
   3. 为最大化DNA得率，使用组织破碎仪对支架中的细胞进行机械裂解。
      1. 在装有支架和Triton X-100的2 mL离心管中加入一个金属珠，将离心管放入适配器中，以每秒50次振荡的频率震荡2–3分钟。
         注意：请使用圆底离心管，因为金属珠可能卡在锥形底管中。
   4. 通过添加荧光双链DNA（dsDNA）染料，并使用微孔板读数仪检测荧光发射值，对Triton X-100溶液中的DNA进行定量。参照试剂制造商的操作指南，用Tris-乙二胺四乙酸（TE）缓冲液适当稀释样品，通过连续稀释法在TE缓冲液中配制8个dsDNA标准品（图5）。
   5. 在黑色不透光的96孔板中，将每种标准品或样品各100 µL以技术重复三次的方式加入孔中。
   6. 将荧光dsDNA染料用TE缓冲液稀释200倍，使用多通道移液器向每个标准品/样品孔中加入100 µL。用锡箔纸覆盖孔板，在室温下孵育5分钟。
   7. 在520 nm处测定并记录每个孔的荧光值。根据制造商提供的指南计算各样品中DNA的浓度。
      注意：若已知所用细胞系每个细胞的平均DNA含量，则可利用公式（4）将DNA浓度值转换为细胞数量。
      （4）
   8. 使用适当的软件绘制DNA定量结果图表并进行统计分析。输入生物学重复三次的数据以生成误差线，反映实验变异性。
   9. 为考察实验时间段内DNA浓度/细胞数量的变化情况，使用适当的生物统计学软件对各时间点均值进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及多重比较。
   10. 在图表上用以下符号标明不同时间点之间的显著性差异：ns（P>0.05）、*（P≤0.05）、**（P≤0.01）、***（P≤0.001）和****（P≤0.0001）。

图5：标准曲线用八种DNA标准品的制备。 提供的λDNA储备液浓度为100 µg/mL。将其在TE缓冲液中稀释50倍，得到浓度为2000 ng/mL的标准品A；取400 µL的A加入含有400 µL TE缓冲液的试管B中；再取400 µL的B转移至C管并进行2倍稀释，依此类推至G管。标准品H仅含TE缓冲液，因此其DNA浓度为0 ng/mL。缩写：TE = Tris-EDTA。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 组织学染色用支架的制备
   注意：支架可整体固定并染色用于显微镜观察和成像，适用于免疫荧光（IF）检测；也可制成福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，用于组织学染色或免疫组化（IHC）检测。该方法可用于定性评估细胞在支架内的渗透和分布情况，并可用于检测蛋白表达水平。
   1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制10%多聚甲醛（PFA）溶液。确保每份支架所需的终体积为500 µL。
   2. 将该溶液预热至37 °C，并向已标记的2 mL离心管中各加入500 µL，用于回收支架。
   3. 从非黏附性24孔板（步骤4.4.4）中取出支架，置于超净工作台内。
   4. 使用无菌镊子将支架转移至含有10% PFA的已标记离心管中，室温固定15分钟。每管加入500 µL PBS以中和PFA，并于4 °C保存。
   5. 为进行自动组织处理机操作，将支架从4 °C取出，用镊子将其放入塑料包埋盒中，并用铅笔标注所有相关信息。将所有包埋盒放入组织处理机的金属容器中。
   6. 启动组织处理机的12步程序，对支架进行固定、脱水、透明处理，并过夜浸蜡。收集处理完毕的包埋盒。
   7. 随后，将支架包埋于石蜡块中，以便进行切片，获得极薄的切片用于染色。
      注意：从包埋盒中取出支架并进行石蜡包埋时，必须特别注意支架的方向，因为这将影响后续成像的角度。在评估细胞向支架内部浸润时，此步骤尤为重要。
   8. 打开石蜡包埋仪和冷台，掀开盖子检查石蜡液面高度，必要时补充石蜡。
   9. 每次处理一个样本，打开包埋盒，取出支架，并将其居中放置于塑料模具中。
   10. 将热石蜡倒入样本上，确保保持正确的方向；若需要，可在石蜡凝固前用温热的镊子进行调整。继续加蜡至填满模具。
   11. 将已标记的包埋盒盖盖在塑料模具上方，并在顶部加蜡。将模具置于冷台上使石蜡凝固。于4 °C过夜保存，以确保石蜡完全固化后再进行切片。
   12. 为切片做准备，开启35 °C水浴锅、烘片台和切片机。
   13. 将刀片插入刀架中，并拧紧杠杆固定刀片。
   14. 设定修片和切片厚度，支架切片通常设为5 mm。
   15. 从模具中取出FFPE支架，将其固定在切片机前端的夹持器上，在切片前小心修去样本边缘多余的石蜡。
   16. 通过旋转切片机手轮开始切入石蜡块，确保动作平稳流畅。
   17. 收集带状切片，每次约3个支架切片，轻轻放入35 °C水浴中以去除皱褶。在水浴中用镊子轻轻分离各切片。
   18. 使用多聚赖氨酸涂层的玻璃载玻片，将每个切片从水浴中捞起，使切片位于载玻片中央。用铅笔标记每张载玻片。
   19. 将玻璃载玻片置于烘片台或60 °C烘箱中干燥。干燥后于4 °C保存，随后进行所需的组织学染色或免疫组化（IHC）染色。
4. 用于基因表达分析的支架回收
   1. 从培养箱中的非黏附性24孔板（步骤4.4.4）中取出支架，置于超净工作台内。
   2. 使用无菌镊子将支架转移至新鲜的已标记2 mL离心管中。
   3. 在通风橱中，向每管加入1 mL基于苯酚/胍的细胞裂解试剂，以裂解支架中的细胞，从而回收高质量RNA。
   4. 将离心管于-20 °C保存，待使用合适的试剂盒进行RNA提取。采用标准的逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）¹⁷检测支架中细胞的基因表达水平。

结果

本文所述的基于胶原蛋白的支架模型具有多种应用，可从研究神经母细胞瘤生物学特性，到在比传统二维细胞培养更接近天然肿瘤生理环境的条件下筛选抗癌治疗药物。在测试特定研究问题之前，至关重要的是在所需的实验时间范围内，全面表征细胞在支架上的黏附、增殖和浸润情况。细胞的生长条件将取决于每种特定细胞系的生物学特性。重要的是，必须采用多种细胞生长评估方法，以确定最佳培养条件并确保实验结果的可靠性。

本实验采用比色法细胞活力检测评估在支架上培养的神经母细胞瘤细胞的活力。该检测可在实验期间根据需要随时进行。在本描述的实验中，对两种在四种不同密度的 Coll-I-nHA 支架上培养的神经母细胞瘤细胞系（KellyLuc 和 IMR32）分别于第 1、7 和 14 天进行细胞活力检测（图 6）。以第 1 天的活力值作为基线，用于比较后续所有时间点的测量结果。细胞活力检测试剂的还原速率反映了各细胞系的细胞生物学特性及生长特征，包括其增殖速率和代谢活性。预期在支架上接种的细胞数量与还原水平之间存在相关性。本实验结果显示，如预期所示，对于两种细胞系，在所有密度条件下，随着培养时间的推移，细胞活力检测试剂的还原程度总体呈上升趋势。

随后对两种细胞系的每种密度分别进行评估，以比较不同时间点的减少情况。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验，检测各时间点间减少程度的显著性差异（图7）。对于两种细胞系及所有接种密度，第1天与第14天相比，细胞活力检测试剂的减少量均显著增加（P<0.05），表明支架上代谢活跃的细胞数量显著增加。然而，在分析7天间隔（第1天与第7天、第7天与第14天）时，并非所有情况均达到显著性差异，这说明优化接种密度对于实现理想的生长窗口具有重要意义。

为了支持细胞活力检测的结果，还可通过荧光双链DNA染料对从支架中提取的双链DNA（dsDNA）进行定量，从而间接测量细胞在支架上的生长情况（图8A）。与细胞活力检测类似，DNA定量可在实验时间范围内根据需要进行多次检测。然而，该分析需要完全回收支架并终止细胞生长，因此必须在实验设计阶段予以考虑，如第1节所述。在本实验中，对两种神经母细胞瘤细胞系KellyLuc和IMR32在四种不同密度的Coll-I-nHA支架上培养1、7和14天后的DNA进行了定量。由于已知这两种细胞系每细胞的平均dsDNA含量，因此可根据定量得到的DNA推算出每个样本中的细胞数量（图8B）。

DNA定量在生物学重复之间的变异性高于细胞活力评估，但总体上随时间点增加，在第14天测得的水平最高。根据DNA浓度显示，IMR32细胞在Coll-I-nHA支架上的细胞数量似乎高于KellyLuc细胞。随后针对两种细胞系分别评估了每种密度随时间点变化的减少情况。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验，以检测不同时间点间减少程度的显著性差异（图8B）。

对于两种细胞系及所有接种密度，在比较第1天和第14天时，细胞数量均显著增加（P<0.05），但KellyLuc在接种密度4（1 × 10⁵ cells/scaffold）时除外，该组在任意时间点之间均未表现出显著增加。与细胞活力结果类似，在评估7天间隔（第1天 vs. 第7天，第7天 vs. 第14天）时，并非所有情况下的增加均具有显著性。比较细胞活力与DNA定量的时间点变化趋势时，两种分析之间存在一些细微差异。然而，总体趋势相似，大多数密度条件下，7天间隔之间的平均值均呈上升趋势。这表明使用多种方法监测细胞生长的重要性。

接下来对细胞在支架上的生长形态和分布进行了可视化评估，包括传统的苏木精-伊红（H&E）染色以及免疫组化（IHC）。预计不同细胞系的生长模式将在支架上形成不同的空间排列，包括细胞向支架内部渗透的程度以及细胞聚集成簇的情况。支架经福尔马林固定、石蜡包埋后切成5 mm切片（图9A），以用于多种可视化技术，包括组织学染色和免疫组化。

对在第1、7和14天生长于基于胶原的支架上的Kelly、KellyCis83和IMR32细胞进行常规H&E染色（图9B）。这使得能够在14天内观察细胞在两种基于胶原的支架上的空间取向。顺铂敏感的Kelly细胞和耐药的KellyCis83细胞均在Coll-I-nHA支架（图9B，i）和Coll-I-GAG支架（图9B，ii）上培养。与先前发表的数据一致，KellyCis83细胞增殖速度更快，并且比侵袭性较弱的Kelly细胞系更深地浸润到两种支架结构中。在Coll-I-nHA上培养的另一种神经母细胞瘤细胞系IMR32的H&E染色显示出不同的生长模式（图9B，iii）。该细胞系在14天内于胶原支架上形成大而紧密堆积的细胞簇。由于胶原纤维具有自发荧光特性，可通过明场共聚焦显微镜观察基于胶原的支架的多孔结构（图9C）。

我们使用鬼笔环肽对细胞骨架肌动蛋白进行染色，并用细胞核复染剂4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，以在整个实验过程中监测特定的细胞特征。通过该技术，在Coll-I-GAG支架上的Kelly和KellyCis83细胞中观察到大量肌动蛋白的存在（图9D）。这些结果表明，如何利用多种成像技术，结合本实验方案，从生长在支架上的神经母细胞瘤细胞中获取具有空间分辨的信息。在特定时间段内对基于胶原的支架上细胞生长模式的表征，将有助于更好地理解与解读后续的生物化学检测结果。

通过分析在基于胶原的支架上生长的细胞的蛋白质表达，可将细胞活性与体内情况相比较。既往发表的数据研究了KellyLuc和KellyCis83Luc细胞在单层培养以及在Coll-I-nHA和Coll-I-GAG支架上生长时，嗜铬粒蛋白A（CgA）作为神经母细胞瘤分泌标志物的表达情况（图10）。使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测条件培养基中的CgA（图10A）。在更具侵袭性的耐化疗KellyCis83细胞系中，CgA的分泌速率高于Kelly细胞（图10B、C）。在培养第7天时，这一差异在Coll-I-GAG和Coll-I-nHA支架上均具有统计学意义（P<0.05），而在传统二维培养的单层细胞中，该时间点无显著差异。

这些结果还凸显了在单层培养细胞时实验时间的局限性，细胞仅能生长7天便达到汇合状态。而利用支架培养细胞则克服了这一限制，可在更接近生理条件的环境中维持更长时间的培养。上述技术组合可获取有关细胞活力、DNA含量、细胞形态与空间排列以及表达谱的信息，有助于评估神经母细胞瘤细胞在多种胶原基支架上的生长情况。该方案也可轻松调整，以满足特定的实验需求和预期应用。

图6：细胞活力分析。（A）使用比色法细胞活力检测试剂盒测定神经母细胞瘤细胞在胶原基支架上活力的一般流程。每种新细胞系的孵育时间需根据试剂盒制造商的说明进行优化。（B）KellyLuc 和 IMR32 细胞在四种不同初始接种密度下，于 Coll-I-nHA 支架上培养第1、7和14天时细胞活力检测试剂的还原百分比。样品均设生物学重复三次，误差线表示标准偏差。缩写：nHA = 纳米羟基磷灰石；Coll-I-nHA = 添加 nHA 的胶原支架。请点击此处查看该图的放大版本。

图 7：在 Coll-I-nHA 上培养的细胞在 14 天期间按接种密度测定的细胞活力。（A）KellyLuc；（B）IMR32。标示的细胞数量指第 0 天在支架上的初始细胞接种密度。样品进行了三次生物学重复实验，以三个重复数据点表示，误差线代表均值。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）与多重比较法检测三个时间点间细胞活力试剂还原率的显著性差异，图中已标注（ns P > 0.05，* P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001，**** P ≤ 0.0001）。缩写：nHA = 纳米羟基磷灰石；Coll-I-nHA = 添加 nHA 的胶原支架；ANOVA = 方差分析；ns = 无显著性差异。请点击此处查看此图的放大版本。

图8：从支架中细胞提取的DNA的定量分析。（A）使用荧光双链DNA染料对在胶原基支架上生长的细胞中的双链DNA进行定量的流程。（B）在14天内，KellyLuc和IMR32细胞在Coll-I-nHA支架上生长时，基于接种密度的DNA定量分析所得的细胞数量。标注的细胞数量指第0天接种到支架上的初始细胞密度。样品进行了三次生物学重复实验，以三个重复数据点表示，误差线代表均值。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）结合多重比较方法检测三个时间点间细胞数量的显著性差异，图中已标明（ns P > 0.05，* P ≤ 0.05，** P ≤ 0.01，*** P ≤ 0.001，**** P ≤ 0.0001）。缩写：nHA = 纳米羟基磷灰石；Coll-I-nHA = 添加nHA的胶原支架；dsDNA = 双链DNA；TE = Tris-EDTA缓冲液；ANOVA = 方差分析；ns = 无显著性差异。请点击此处查看该图的放大版本。

图9：用于支架免疫组织化学分析的组织处理步骤。 （A）用于图像分析的支架处理流程示意图。该流程可用于常规组织学染色，并利用一抗和荧光标记的二抗进行特异性抗体探查。（B）三种神经母细胞瘤细胞系经H&E染色后的代表性图像。在实验过程中第1、7、14天采集H&E图像，以监测细胞生长模式。比例尺 = 200 µm。虚线方框表示在左下角区域选择的放大20倍图像区域，比例尺 = 20 µm。（i 和 ii）Kelly 和 KellyCis83 神经母细胞瘤细胞系（分别为上、下图）在两种不同胶原基支架上的H&E染色结果。（iii）IMR32细胞系的H&E染色图像，显示其在Coll-I-nHA支架上呈簇状细胞生长。（C）Kelly细胞系经明场共聚焦显微镜观察的代表性图像。胶原蛋白的自发荧光可清晰显示多孔支架结构。10倍比例尺 = 200 µm，20倍比例尺 = 20 µm。（D）包埋支架经鬼笔环肽（phalloidin）和DAPI免疫组织化学分析后的代表性图像（10倍放大），比例尺 = 200 µm。内部较小方框表示放大图像（20倍），比例尺 = 20 µm。缩写：nHA = 纳米羟基磷灰石；Coll-I-nHA = 添加nHA的胶原支架；GAG = 糖胺聚糖；Coll-I-GAG = 添加硫酸软骨素-6的胶原支架；H&E = 苏木精-伊红；IHC = 免疫组织化学；DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的高清版本。

图 10：神经母细胞瘤细胞在三维胶原基支架与二维塑料表面培养时的蛋白表达比较。（A）示意图展示如何对在二维塑料或三维胶原基支架上培养的细胞的条件培养基进行 CgA ELISA 检测。（B）从二维塑料单层培养细胞的条件培养基中检测到的 CgA 蛋白表达水平。当细胞在第 7 天达到汇合状态后，第 14 天的数据无法读取。在塑料表面培养第 7 天时，Kelly 与 KellyCis83 细胞系之间的 CgA 水平无显著差异。（C）使用在胶原基支架上连续培养 14 天的细胞的条件培养基进行的 CgA ELISA 检测。在第 7 天，两种胶原支架上的 CgA 水平均显示更具侵袭性的 KellyCis83 细胞系表达更高，表明在三维基质中 CgA 的表达水平比二维单层更接近生理状态。本图经 Curtin 等人¹⁷ 修改。缩写：3D = 三维；2D = 二维；CgA = 嗜铬粒蛋白 A；ELISA = 酶联免疫吸附测定；nHA = 纳米羟基磷灰石；Coll-I-nHA = 添加 nHA 的胶原支架；GAG = 糖胺聚糖；Coll-I-GAG = 添加硫酸软骨素-6 的胶原支架；TMB = 3,3',5,5'-四甲基联苯胺；HRP = 辣根过氧化物酶。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

三维支架-癌细胞模型已被证实是一种有价值且多功能的工具，可用于深入理解神经母细胞瘤细胞在简化的肿瘤微环境中的生长、存活及细胞浸润机制³². 此处描述的三维神经母细胞瘤模型模拟了最简化的肿瘤微环境，相较于二维单层培养，可提供更具生理相关性的数据。三维细胞培养的主要缺点是实验复杂性增加以及所需时间更长。本文介绍了一种经过优化的实验方案，涵盖神经母细胞瘤细胞在基于胶原蛋白支架上的接种、生长与维持，以及后续分析与应用，从而实现对细胞生长的可靠表征。本研究旨在明确支架上最佳的细胞接种密度，以建立可预测且可控的实验环境，便于在14天的高效实验周期内评估抗癌药物的治疗效果。上述各项简便实验步骤的整合，为基于支架的神经母细胞瘤细胞生长提供了全面的评估方法 体外 培养系统。

已强调实验方案建立过程中的关键步骤，以便科研人员能够快速在各自实验室中建立相同实验条件。例如，显色法细胞活力检测中建议的孵育时间有助于试剂更充分地渗透至支架孔隙，从而接触所有细胞。此外，荧光dsDNA染色技术具有良好的稳健性和操作简便性；然而，由于细胞被“困在”胶原纤维内部，从支架中释放DNA需要进行强烈的细胞裂解处理。

通过所述的简单DNA定量检测方法，我们可以确定基于胶原蛋白支架的抗癌药物筛选模型中细胞的对数生长期。在本实验设置中，采用了4种初始细胞接种密度，总体培养周期为14天，并在第1、7和14天进行分析。我们发现，以4 × 10⁵ 个细胞/支架密度接种的KellyLuc细胞在第7至第14天期间表现出最显著的活跃增殖窗口。该对数期生长数据将有助于可靠地解读多种细胞毒性实验结果，避免将3D多孔支架上细胞生长受抑或细胞死亡归因于药物毒性之外的因素。细胞活力也是广泛用于评估3D平台是否适合支持不同类型细胞生长的重要指标^33,34。尽管存在多种检测细胞活力的方法，包括活/死细胞染色、ATP含量测定和增殖检测等，我们发现Alamar Blue比色法是一种简单且有效的技术，可辅助支持DNA定量数据。

DNA 定量与细胞活力的联合使用提供了互补的证据，表明平均而言，为实现为期 14 天的持续生长，每支架接种细胞的最佳密度为 2–4 × 10⁵ 个细胞/支架。然而，本方案可轻松调整以满足不同的实验时间、分析时间点及下游应用需求。尽管本方案描述了神经母细胞瘤细胞在支架上单培养条件下的生长评估，但这些支架易于改造，可用作共培养平台；do Amaral 等人已对此进行了描述，他们利用胶原-糖胺聚糖（collagen-GAG）支架在伤口愈合研究中实现了角质形成细胞与成纤维细胞的共培养³⁵。

所述的3D模型能够利用多种已知技术（如免疫荧光和标准H&E染色）对细胞生长和浸润进行可视化观察。由于细胞在支架上的形态和生长模式具有多样性，因此在通过生化检测对生长特性进行表征的同时，对细胞进行可视化观察尤为重要。了解细胞的生长模式有助于揭示其生长行为以及未来对抗癌药物的反应。例如，通过DNA定量分析显示，IMR32细胞的生长模式与Kelly细胞相似；但通过H&E染色观察发现，IMR32细胞形成的细胞簇比Kelly细胞更大，而Kelly细胞则表现出更为分散的生长方式（图9）。不同细胞系在支架中呈现的多样化生长模式反映了肿瘤异质性的临床实际情况。通过在3D支架中使用具有不同形态特征的多种细胞系来检测抗癌药物的反应，将提高对患者药物反应的预测价值。

如果目的蛋白是分泌型蛋白，也可采用其他方法检测基因或蛋白的表达，例如 RT-qPCR 或 ELISA。为更全面地表征神经母细胞瘤在三维条件下的细胞生长情况，本研究使用嗜铬粒蛋白 A（chromogranin A, CgA）作为神经母细胞瘤进展的替代标志物³⁶。如先前研究所述¹⁷，随着细胞增殖，CgA 的分泌量增加（图 10）。在单层细胞培养中，由于细胞增殖后迅速达到培养皿的完全汇合状态，无法有效检测到 CgA 分泌的动态变化；而采用三维胶原支架则可实现对 CgA 分泌的长期评估。

这个3D 体外 该模型可能并不适用于所有研究神经母细胞瘤生物学特性及治疗反应的研究问题。其中一个局限性在于细胞在支架内的渗透不均，以及形成大小不一的细胞簇，这一现象取决于特定的细胞系，可能导致营养物质和待测药物的扩散不可控，从而影响药物筛选的稳健性。然而，尽管存在这一局限，需要认识到的是，天然肿瘤在大小和癌细胞分布上同样具有异质性，并且肿瘤组织内还包含多种其他类型的细胞。为克服这一局限，我们建议将每个接种细胞的支架作为一个独立的微组织，并优化以下参数：（a）细胞活力检测试剂孵育时间，以确保试剂能够充分渗透至细胞及细胞簇；（b）在使用Triton X-100缓冲液裂解细胞前，采用组织破碎仪对支架上的细胞进行预处理，以释放深藏于支架内部细胞的DNA。

该方案的另一项技术局限在于，此模型中每批新制备的支架缺乏机械性能测试。然而，由于支架的制备工艺成熟，且已对其物理和化学特性（如压缩模量、拉伸模量、孔隙率、孔结构形貌以及均一性）进行了广泛表征，因此可确保不同批次间支架质量的一致性^{21,24,27,30,37}。

综上所述，本文介绍了一系列用于分析细胞在胶原基支架上生长的简单方法。实验时间线和分析节点可根据具体的研究问题进行调整。该方案也可适用于其他类型的细胞。上述结果表明，这一系列方法的整合有助于确定多种神经母细胞瘤细胞系在14天内实现连续生长的最佳接种密度。通过本方案中所有方法获得的结果综合起来，可更深入地理解细胞在三维胶原基质中的生长行为。未来对该模型的应用可能涉及针对神经母细胞瘤肿瘤微环境（TME）的共培养系统，以及多种新型抗癌药物的测试。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞
IMR-32	ATCC	CCL-127
Kelly	ECACC	82110411
KellyCis83	实验室制备 – 来源于 Kelly（Piskareva 等，2015）	-	逐步增加顺铂暴露。获得交叉耐药性
SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266
一次性耗材
0.22 µm 注射器滤器	Millex	SLHP033RS
1.5 mL Eppendorf 管	Eppendorf	0030 120.086
100 mL 无菌烧杯	Starstedt	-
10 mL 塑料移液管	Cellstar	607 180
15 mL Falcon 管	Starstedt	62.554.502
25 mL 塑料移液管	Cellstar	760 180
50 mL Falcon 管	Starstedt	62.547.254
5 mL 塑料移液管	Cellstar	606 180
6 mm 活检打孔器	Kai Medical	BP-60F
铝箔	-	-
盖玻片	Menzel-Glaser	-
HYPERflask	Corning	CLS10030
显微镜载玻片	Thermo Scientific	J1840AMNT
不透明黑色 96 孔板	Costar	3915
无菌 P10 吸头	Starlab	S1121-3810
无菌 P1000 吸头	Starlab	S1122-1830
无菌 P20 吸头	Starlab	S1123-1810
无菌 P200 吸头	Starlab	S1120-8810
T-175（175 cm2 培养瓶）	Sarstedt	83.3912
T-75（75 cm2 培养瓶）	Sarstedt	83.3911.302
透明清亮 96 孔板	Cellstar	655180
半透明非黏附 24 孔板	Cellstar	83.3922.500
设备
高压灭菌器	Astell	-
自动组织处理仪	Leica	TP1020
Centrifuge 5804	Eppendorf	-
血细胞计数板	Hausser  Scientific	-
培养箱	ThermoScientific	-
切片机	Leica	RM2255
烘箱	Memmert		校准单位：Cruinn diagnostics Ltd
P10 移液器	Gilson
P100 移液器	Gilson
P1000 移液器	Gilson
P20 移液器	Gilson		校准单位：Cruinn diagnostics Ltd
P200 移液器	Gilson		校准单位：Cruinn diagnostics Ltd
石蜡切片漂浮浴	Electrothermal	MH8517	校准单位：Cruinn diagnostics Ltd
移液器电子分液器	Corning	StripipetterUltra	校准单位：Cruinn diagnostics Ltd
载片冷却仪	Leica	EG1140C	校准单位：Cruinn diagnostics Ltd
冰箱 -20 °C	Liebherr	-
冰箱 -80 °C	Liebherr	-
冰箱 4 °C	Liebherr	-
往复式摇床	DLAb	SK-D1807-E
分光光度计 – Victor3V 酶标仪	PerkinElmer	1420
组织培养罩/层流罩	GMI	8038-30-1044
组织研磨仪	Qiagen	TissueLyser LT
镊子	-	-
水浴锅	Grant	-
石蜡包埋机	Leica	EG1140H
材料
1 L 水	Adrona - Biosciences	568
1% Triton-X	Sigma Aldrich	9002-93-1
10x PBS 片剂	Sigma Aldrich	P4417-100TAB
37% 多聚甲醛	Sigma-Aldrich	F8775
Alamar Blue 细胞活力检测试剂	Invitrogen	DAL1100
胶原-糖胺聚糖支架	组织工程研究组（TERG）
胶原-纳米羟基磷灰石支架	组织工程研究组（TERG）
dH20	Adrona - Biosciences	568
伊红	Sigma-Aldrich	E4009	配制方法参考：（Cunniffe 等，2010；Fitzgerald 等，2015；O’Brien 等，2005）
乙醇（EtOH）	Sigma-Aldrich	1.00983.2500	配制方法参考：（Cunniffe 等，2010；Fitzgerald 等，2015；O’Brien 等，2005）
F12 培养基	Gibco	21765-029
胎牛血清（FBS）	Gibco	10270-106
苏木精	Sigma-Aldrich	HHS32-1L
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-024
MEM 培养基	Gibco	21090-022
miRNA easy 试剂盒	Qiagen	217004
MNEAA’s	Gibco	11140-035
青霉素/链霉素	Gibco	015140-122
Qiazol	Qiagen	79306
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒	Invitrogen	P11496
RPMI 培养基	Gibco	21875-034
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S7795-500G
组织包埋介质	Sigma	A6330-4LB
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054
软件
Excel	-	Excel 2016
ImageJ	-	-
Prism	-	版本 9