本方案描述了在使用蛋白毒性抗菌剂处理后，从大肠杆菌（Escherichia coli）中提取并可视化聚集态和可溶性蛋白质的方法。通过执行该流程，可对不同细菌菌株和/或不同处理条件下体内（in vivo）蛋白质聚集体的形成进行定性比较。
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本文内容
摘要
摘要
生物体暴露于环境和细胞应激因素时，常会导致蛋白质稳态失衡，并可能引发蛋白质聚集。蛋白质聚集体在细菌细胞内的积累可引起细胞表型行为的显著改变，包括生长速率降低、应激抗性减弱以及毒力下降。目前已有多种实验方法用于检测这些由应激因素介导的表型变化。本文介绍了一种优化后的检测方法，用于提取并可视化经含银-钌抗菌化合物处理后不同大肠杆菌（Escherichia coli）菌株中的聚集态蛋白与可溶性蛋白。该化合物已知可产生活性氧，并引发广泛的蛋白质聚集。
该方法结合了基于离心的分离技术，从经处理与未经处理的细胞中分离蛋白质聚集体和可溶性蛋白质，随后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并利用考马斯亮蓝染色进行可视化。该方法操作简便、快速，可实现对不同条件下蛋白质聚集体形成的定性比较 E. coli 菌株。该方法具有广泛的应用范围，包括研究其他蛋白毒性抗菌剂对 体内 在多种细菌中检测蛋白质聚集。此外，该方案可用于鉴定有助于增强对蛋白毒性物质抗性的基因。凝胶条带可用于后续鉴定特别易于发生聚集的蛋白质。
引言
细菌不可避免地会暴露于多种环境压力之下，包括低pH值（例如哺乳动物胃中的环境）1,2、活性氧和氯物种（ROS/RCS）（例如吞噬细胞发生氧化爆发时）3,4,5、升高的温度（例如在温泉中或热激条件下）6,7，以及多种强效抗菌剂（例如本实验方案中使用的AGXX）8。蛋白质对上述任何一种应激因子都特别敏感，暴露可导致蛋白质去折叠或错误折叠，进而引发聚集。所有生物体都具备保护系统，以应对蛋白质错误折叠9。然而，严重的应激可能超出蛋白质质量控制系统的负荷，破坏蛋白质的二级和/或三级结构，最终导致蛋白质失活。因此，蛋白质聚集体可能严重损害细菌生长与存活、应激抗性及毒力所依赖的关键细胞功能10。因此，针对细菌中蛋白质聚集及其后果的研究具有重要意义，因其可能对传染病防控产生重要影响。
热诱导的蛋白质去折叠和聚集通常是可逆的
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方案
1. 应激处理 E. coli 菌株 MG1655 和 CFT073
- 接种一环共生菌单菌落至5 mL的溶菌肉汤（LB）培养基中 E. coli 菌株MG1655和尿路致病性 E. coli （UPEC）菌株 CFT073，并在 37 °C 下培养 14–16 小时（过夜） 37 °C 300 转/分钟。
注意： 大肠杆菌 CFT073 是一种人类病原体。处理 CFT073 必须在经认证的生物安全二级实验室中采取适当的生物安全措施进行。 - 将每种菌株稀释至含有70 mL 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）-葡萄糖（MOPS-g）（表1) 培养基在 600 nm 处的光密度（OD6000.1 的值。在 37 °C 以及300 rpm振荡培养至对数生长期中期（OD600 = 0.5-0.55).
- 将每种培养物各20 mL转移至三个预热的125 mL锥形瓶中，于指定条件下培养 37 °C 300 转/分钟，持续 2 分钟。
注意：由于样品需及时处理，每次处理的培养物不应超过6个。 - 在 MOPS-g 培养基中配制浓度为 2 mg/mL 的抗菌化合物溶液。将抗菌剂加入各培养物中，使其达到指定浓度。对于未处理对照组，加入相应体积的 MOPS-g 培养基。
注意：涡旋混....
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结果
图6：共生菌中抗菌剂诱导的蛋白质聚集的代表性结果 大肠杆菌 菌株 MG1655 和尿路致病性大肠杆菌菌株 CFT073 E. coli 菌株MG1655和CFT073在指定条件下培养 37 °C 和 300 rpm 至 OD600在MOPS-g培养基中培养至OD600 = 0.5–0.55后，用指定浓度的抗菌剂处理45分钟（–，0 mg/mL；+，175 mg/mL；++，200 mg/mL）。可溶性和不溶性蛋白样品按本方案所述方法制备。
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讨论
本方案描述了一种优化的方法，用于分析不同大肠杆菌（E. coli）菌株经蛋白毒性抗菌剂处理后蛋白质聚集体的形成情况。该方案可同时从经处理和未处理的大肠杆菌（E. coli）细胞中提取不溶性和可溶性蛋白组分。与现有从细胞中分离蛋白质聚集体的方案14,15,16,20相比，本方法具有多项优势：(i) 仅需少量培养液体积（4–8 mL）；(ii) 细胞破碎过程无需依赖特殊设备，如法式压榨器、细胞破碎仪或超声波破碎仪；(iii) 即使是该领域中科研生涯初期的科研人员，也能轻松操作本方案。
细菌在其自然环境中会遭遇多种应激因素，其中许多因素尤其对蛋白质构成威胁，而蛋白质是细胞中最丰富的生物大分子21。本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了伊利诺伊州立大学生物科学学院启动资金、伊利诺伊州立大学新教员启动计划资助以及美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助项目R15AI164585（资助对象：J.-U. D.）的支持。G.M.A. 受到伊利诺伊州立大学本科生研究支持计划（资助对象：G.M.A.）的资助。K. P. H. 受到德国学术交流中心（DAAD）提供的RISE奖学金的支持。作者感谢Largentech Vertriebs GmbH公司的Uwe Landau博士和Carsten Meyer博士提供AGXX粉末。图1、图2、图3、图4和图5使用BioRender软件生成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | |||
| 丙酮 | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| 过硫酸铵 | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| 苯甲酸核酸酶 | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 蛋白质分子量标准（5-245 kDa） | GoldBio | P008-500 | |
| β-巯基乙醇 | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| 溴酚蓝 | GoldBio | B-092-25 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-蔗糖 | Acros Organics | 57-50-1 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| 冰乙酸 | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| 甘油，99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| 甘氨酸 | GoldBio | G-630-1 | |
| 盐酸，ACS 级试剂 | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| 异丙醇（2-丙醇） | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB 培养基（Miller 配方） | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| 含琼脂的 LB 培养基（Miller 配方） | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| 溶菌酶 | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS 缓冲液 | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| 磷酸二氢钾 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| 硫胺素 | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% 三氯乙酸 | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris 碱 | GoldBio | T-400-1 | |
| 材料/设备 | |||
| 离心管（15 mL） | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| 锥形瓶（125 mL） | Carolina | 726686 | |
| 锥形瓶（500 mL） | Carolina | 726694 | |
| 冷冻机：-80 °C | Fisher Scientific | ||
| 玻璃珠（0.5 mm） | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| 微量离心机 | Hermle | Z216MK | |
| 微量离心管（1.7 mL） | VWR International | 87003-294 | |
| 微量离心管（2.0 mL） | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| 塑料比色皿 | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| 电源装置 | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| 摇床 | Alkali Scientific | RS7235 | |
| 振荡培养箱（37 °C） | Benchmark Scientific | ||
| 小型玻璃板 | Bio-Rad | 1653311 | |
| 间隔板（1 mm） | Bio-Rad | 1653308 | |
| 分光光度计 | Thermoscientific | 3339053 | |
| 适用于 15 mL 离心管的台式离心机 | Beckman-Coulter | ||
| 垂直凝胶电泳槽 | Bio-Rad | 1658004 | |
| 涡旋振荡器 | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| 恒温混匀仪 | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 孔梳 | Bio-Rad | 1653359 |
参考文献
- Dahl, J. -U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation ....
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