本方案描述了在使用蛋白毒性抗菌剂处理后，从大肠杆菌（Escherichia coli）中提取并可视化聚集态和可溶性蛋白质的方法。通过执行该流程，可对不同细菌菌株和/或不同处理条件下体内（in vivo）蛋白质聚集体的形成进行定性比较。
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摘要
摘要
生物体暴露于环境和细胞应激因素时，常会导致蛋白质稳态失衡，并可能引发蛋白质聚集。蛋白质聚集体在细菌细胞内的积累可引起细胞表型行为的显著改变，包括生长速率降低、应激抗性减弱以及毒力下降。目前已有多种实验方法用于检测这些由应激因素介导的表型变化。本文介绍了一种优化后的检测方法，用于提取并可视化经含银-钌抗菌化合物处理后不同大肠杆菌（Escherichia coli）菌株中的聚集态蛋白与可溶性蛋白。该化合物已知可产生活性氧，并引发广泛的蛋白质聚集。
该方法结合了基于离心的分离技术，从经处理与未经处理的细胞中分离蛋白质聚集体和可溶性蛋白质，随后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离并利用考马斯亮蓝染色进行可视化。该方法操作简便、快速，可实现对不同条件下蛋白质聚集体形成的定性比较 E. coli 菌株。该方法具有广泛的应用范围，包括研究其他蛋白毒性抗菌剂对 体内 在多种细菌中检测蛋白质聚集。此外，该方案可用于鉴定有助于增强对蛋白毒性物质抗性的基因。凝胶条带可用于后续鉴定特别易于发生聚集的蛋白质。
引言
细菌不可避免地会暴露于多种环境压力之下，包括低pH值（例如哺乳动物胃中的环境）1,2、活性氧和氯物种（ROS/RCS）（例如吞噬细胞发生氧化爆发时）3,4,5、升高的温度（例如在温泉中或热激条件下）6,7，以及多种强效抗菌剂（例如本实验方案中使用的AGXX）8。蛋白质对上述任何一种应激因子都特别敏感，暴露可导致蛋白质去折叠或错误折叠，进而引发聚集。所有生物体都具备保护系统，以应对蛋白质错误折叠9。然而，严重的应激可能超出蛋白质质量控制系统的负荷，破坏蛋白质的二级和/或三级结构，最终导致蛋白质失活。因此，蛋白质聚集体可能严重损害细菌生长与存活、应激抗性及毒力所依赖的关键细胞功能10。因此，针对细菌中蛋白质聚集及其后果的研究具有重要意义，因其可能对传染病防控产生重要影响。
热诱导的蛋白质去折叠和聚集通常是可逆的7。相比之下，其他蛋白毒性应激（如氧化应激）可通过特异性氨基酸侧链的氧化导致不可逆的蛋白质修饰，从而引起蛋白质的去折叠或错误折叠，并最终导致蛋白质聚集4。在分子伴侣及其于酵母和细菌中保护功能的研究背景下，应激诱导形成的不溶性蛋白质聚集体已被广泛研究11,12,13。已有多种实验方案发表，利用多种生物化学技术用于分离和分析不溶性蛋白质聚集体14,15,16,17。现有方案主要用于研究热休克后细菌中的蛋白质聚集现象和/或鉴定分子伴侣。尽管这些方案无疑推动了该领域的发展，但其实验流程中仍存在一些主要不便之处：包括需要 (i) 高达10 L的大体积细菌培养物14,17，(ii) 复杂的物理破碎过程，如使用细胞破碎仪、French压榨器和/或超声处理14,15,17，或 (iii) 耗时的重复洗涤与孵育步骤15,16,17。
本文介绍了一种改进的实验方案，旨在克服以往方法的局限性，可用于分析两种不同大肠杆菌（Escherichia coli）菌株在经蛋白毒性抗菌表面涂层处理后所形成的蛋白质聚集体的含量。该涂层由金属银（Ag）和钌（Ru）组成，并经抗坏血酸处理，其抗菌活性通过产生活性氧物种实现8,18。本文详细描述了细菌经抗菌化合物处理后的培养制备过程，并比较了两种具有不同抗菌敏感性特征的大肠杆菌（E. coli）菌株在暴露于递增浓度抗菌剂时蛋白质聚集状态的变化。所述方法成本低、速度快且可重复，可用于研究其他蛋白毒性化合物存在下的蛋白质聚集现象。此外，该方案还可进行修改，以分析特定基因缺失对多种不同细菌中蛋白质聚集的影响。
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方案
1. 应激处理 E. coli 菌株 MG1655 和 CFT073
- 接种一环共生菌单菌落至5 mL的溶菌肉汤（LB）培养基中 E. coli 菌株MG1655和尿路致病性 E. coli （UPEC）菌株 CFT073，并在 37 °C 下培养 14–16 小时（过夜） 37 °C 300 转/分钟。
注意： 大肠杆菌 CFT073 是一种人类病原体。处理 CFT073 必须在经认证的生物安全二级实验室中采取适当的生物安全措施进行。 - 将每种菌株稀释至含有70 mL 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）-葡萄糖（MOPS-g）（表1) 培养基在 600 nm 处的光密度（OD6000.1 的值。在 37 °C 以及300 rpm振荡培养至对数生长期中期（OD600 = 0.5-0.55).
- 将每种培养物各20 mL转移至三个预热的125 mL锥形瓶中，于指定条件下培养 37 °C 300 转/分钟，持续 2 分钟。
注意：由于样品需及时处理，每次处理的培养物不应超过6个。 - 在 MOPS-g 培养基中配制浓度为 2 mg/mL 的抗菌化合物溶液。将抗菌剂加入各培养物中，使其达到指定浓度。对于未处理对照组，加入相应体积的 MOPS-g 培养基。
注意：涡旋混匀2 mg/mL的抗菌溶液，以确保化合物颗粒均匀分布，避免沉淀。 - 将培养物在37°C下孵育45分钟 37 °C 和 300 rpm。
图1：Escherichia coli 应激处理。细菌培养物在MOPS-g培养基中生长，当达到对数中期时，用指定浓度的含银-钌抗菌剂进行处理。缩写：LB = 溶菌肉汤；Ag-Ru = 银-钌；MOPS-g = 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）-葡萄糖。请点击此处查看该图的高清版本。
2. 收集细菌细胞样品
- 经过45分钟的胁迫处理后，测定每种培养物的OD600。对于每个样品，将相当于4 mL、OD600 = 1的细胞在15 mL离心管中，于3,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，收集细胞。
- 彻底去除上清液，并将细胞沉淀重悬于50 µL预冷的裂解缓冲液中（表1）。将样品置于冰上孵育30分钟。
注意：此裂解步骤可降解肽聚糖层。务必使用新鲜配制的裂解缓冲液。 - 将样品转移至1.7 mL微量离心管中，于-80 °C冷冻保存，待后续使用。
图 2：细菌样品采集。 细胞样品通过离心收集，重悬于裂解缓冲液中，随后在 -80 °C 下保存。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 提取不溶性蛋白质聚集体
- 将样品置于冰上解冻。
注意：冻融循环有助于细胞裂解。 - 加入 360 µL 预冷的缓冲液 A（表 1），用移液器轻轻混匀。
注意：渗透压冲击也有助于细胞裂解。 - 将样品转移至含有约 200 µL 0.5 mm 玻璃珠的 2 mL 微量离心管中。在恒温混匀仪中于 8 °C、1,400 rpm 条件下孵育 30 分钟。
注意：此步骤可实现细胞的物理破碎。可使用蛋白酶抑制剂以减少蛋白质降解。破碎过程也可在 4 °C 下进行。需注意，已有报道指出玻璃珠的使用可能引起酵母中一小部分蛋白质发生聚集19。 - 将样品置于冰上静置 5 分钟，使玻璃珠沉降。将 200 µL 细胞裂解液转移至 1.7 mL 微量离心管中。
注意：避免转移玻璃珠。 - 在 16,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。收集含有可溶性蛋白的上清液，并进入第 4 节操作。
- 用移液器将沉淀重悬于 200 µL 预冷的缓冲液 A（表 1）中。在 16,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。小心彻底去除上清液。
- 加入 200 µL 预冷的缓冲液 B（见 表 1 和 材料表），用移液器小心地重悬沉淀。
注意：非离子型去垢剂可溶解膜蛋白。 - 再次在 16,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。小心去除上清液。
- 用移液器将沉淀重悬于 200 µL 冷缓冲液 A（表 1）中。在 16,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。彻底去除上清液。
- 将沉淀重悬于 100 µL 1x 还原型 SDS 样品缓冲液（表 1）中，在恒温混匀仪中 95 °C 煮沸 5 分钟。
- 将样品储存于 -20 °C 以备后续使用，或立即上样至 SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
图 3：不溶性蛋白质聚集体的提取。 蛋白质聚集体的提取包括一系列步骤，如细胞裂解、将蛋白质聚集体与可溶性蛋白质分离、膜蛋白的增溶以及洗涤。缩写：SDS = sodium dodecyl sulfate。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 可溶性蛋白样品制备
- 取1份体积的100%三氯乙酸（TCA）与4份体积来自步骤3.6的可溶性蛋白样品混合。
注意：操作TCA时需在通风橱中进行，并佩戴个人防护装备，且须遵循批准的废液处理程序。 - 在4 °C孵育10分钟，使蛋白质沉淀。
注意：白色沉淀将很快出现。 - 在21,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，使蛋白质沉淀，弃去上清液。用200 µL预冷的丙酮洗涤沉淀，以去除细胞碎片。再次在21,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤共三次。
- 将开盖的微量离心管置于37 °C的恒温混匀仪中，以去除沉淀中残留的丙酮。
注意：孵育时间超过5分钟可能会降低蛋白沉淀的溶解度。 - 加入100 µL 1x还原性SDS缓冲液（表1），彻底溶解沉淀。将样品在95 °C煮沸5分钟。
- 将样品储存于-20 °C以备后续使用，或立即上样至SDS聚丙烯酰胺凝胶进行分离。
图 4：可溶性蛋白质的制备。可溶性蛋白质的制备包括使用三氯乙酸进行沉淀，以及用预冷丙酮反复洗涤的步骤。缩写：TCA = 三氯乙酸；SDS = 十二烷基硫酸钠。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 使用 SDS-PAGE 分离和可视化提取的蛋白质聚集体
- 制备12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
- 配制两块分离胶时，将5.1 mL双蒸水（ddH2O）、3.75 mL Tris-HCl（pH 8.8）、7.5 mL 20%（w/v）SDS、6 mL 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、75 mL 10%（w/v）过硫酸铵和10 mL四甲基乙二胺（TEMED）加入15 mL离心管中，轻轻混匀，避免产生气泡。使用1 mL移液器将混合液注入玻璃板之间，顶部预留约2 cm空间。在分离胶上层覆盖70%乙醇，以形成平整的液-胶界面。
- 待分离胶聚合完成后，配制浓缩胶：将1.535 mL双蒸水（ddH2O）、625 mL Tris-HCl（pH 6.8）、12.5 mL 20%（w/v）SDS、335 mL 30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液、12.5 mL 10%（w/v）过硫酸铵和2.5 mL TEMED加入离心管中混匀。吸除分离胶上方的乙醇，立即加入浓缩胶溶液，并插入所需齿数的梳子，避免产生气泡。室温下聚合20–30分钟。
- 将每个样品及蛋白ladder各取4 µL分别加入不同加样孔中，在Tris-甘氨酸电泳缓冲液（表1）中以144 V恒压电泳45分钟，室温进行。
注意：当溴酚蓝条带即将迁移出凝胶时，停止电泳。 - 将凝胶置于预热的Fairbanks溶液A（表1）中，在摇床上染色30分钟。
- 将凝胶转移至预热的Fairbanks溶液D（表1）中，在摇床上脱色至背景清晰（例如过夜）。
图 5：蛋白质分离与可视化。 样品通过 SDS-PAGE 分离，并通过考马斯亮蓝染色进行可视化。缩写：SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
图6：共生菌中抗菌剂诱导的蛋白质聚集的代表性结果 大肠杆菌 菌株 MG1655 和尿路致病性大肠杆菌菌株 CFT073 E. coli 菌株MG1655和CFT073在指定条件下培养 37 °C 和 300 rpm 至 OD600在MOPS-g培养基中培养至OD600 = 0.5–0.55后，用指定浓度的抗菌剂处理45分钟（–，0 mg/mL；+，175 mg/mL；++，200 mg/mL）。可溶性和不溶性蛋白样品按本方案所述方法制备。
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讨论
本方案描述了一种优化的方法，用于分析不同大肠杆菌（E. coli）菌株经蛋白毒性抗菌剂处理后蛋白质聚集体的形成情况。该方案可同时从经处理和未处理的大肠杆菌（E. coli）细胞中提取不溶性和可溶性蛋白组分。与现有从细胞中分离蛋白质聚集体的方案14,15,16,20相比，本方法具有多项优势：(i) 仅需少量培养液体积（4–8 mL）；(ii) 细胞破碎过程无需依赖特殊设备，如法式压榨器、细胞破碎仪或超声波破碎仪；(iii) 即使是该领域中科研生涯初期的科研人员，也能轻松操作本方案。
细菌在其自然环境中会遭遇多种应激因素，其中许多因素尤其对蛋白质构成威胁，而蛋白质是细胞中最丰富的生物大分子21。本...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了伊利诺伊州立大学生物科学学院启动资金、伊利诺伊州立大学新教员启动计划资助以及美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助项目R15AI164585（资助对象：J.-U. D.）的支持。G.M.A. 受到伊利诺伊州立大学本科生研究支持计划（资助对象：G.M.A.）的资助。K. P. H. 受到德国学术交流中心（DAAD）提供的RISE奖学金的支持。作者感谢Largentech Vertriebs GmbH公司的Uwe Landau博士和Carsten Meyer博士提供AGXX粉末。图1、图2、图3、图4和图5使用BioRender软件生成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | |||
| 丙酮 | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| 过硫酸铵 | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| 苯甲酸核酸酶 | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 蛋白质分子量标准（5-245 kDa） | GoldBio | P008-500 | |
| β-巯基乙醇 | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| 溴酚蓝 | GoldBio | B-092-25 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-蔗糖 | Acros Organics | 57-50-1 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| 冰乙酸 | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| 甘油，99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| 甘氨酸 | GoldBio | G-630-1 | |
| 盐酸，ACS 级试剂 | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| 异丙醇（2-丙醇） | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB 培养基（Miller 配方） | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| 含琼脂的 LB 培养基（Miller 配方） | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| 溶菌酶 | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS 缓冲液 | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| 磷酸二氢钾 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| 四甲基乙二胺（TEMED） | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| 硫胺素 | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% 三氯乙酸 | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris 碱 | GoldBio | T-400-1 | |
| 材料/设备 | |||
| 离心管（15 mL） | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| 锥形瓶（125 mL） | Carolina | 726686 | |
| 锥形瓶（500 mL） | Carolina | 726694 | |
| 冷冻机：-80 °C | Fisher Scientific | ||
| 玻璃珠（0.5 mm） | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| 微量离心机 | Hermle | Z216MK | |
| 微量离心管（1.7 mL） | VWR International | 87003-294 | |
| 微量离心管（2.0 mL） | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| 塑料比色皿 | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| 电源装置 | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| 摇床 | Alkali Scientific | RS7235 | |
| 振荡培养箱（37 °C） | Benchmark Scientific | ||
| 小型玻璃板 | Bio-Rad | 1653311 | |
| 间隔板（1 mm） | Bio-Rad | 1653308 | |
| 分光光度计 | Thermoscientific | 3339053 | |
| 适用于 15 mL 离心管的台式离心机 | Beckman-Coulter | ||
| 垂直凝胶电泳槽 | Bio-Rad | 1658004 | |
| 涡旋振荡器 | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| 恒温混匀仪 | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 孔梳 | Bio-Rad | 1653359 |
参考文献
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