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体外重建人类视网膜母细胞瘤

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DOI：

10.3791/62629

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2022年10月11日

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

本文内容

摘要

我们描述了一种通过在人胚胎干细胞（hESC）中引入双等位基因RB1突变来生成人视网膜母细胞瘤（RB）的方法。此外，还可利用体外分离的RB成功培养RB细胞系。

摘要

视网膜母细胞瘤（RB）是一种儿童期癌症，若不进行治疗则具有致死性。由于RB起源于视锥细胞前体，而这类细胞在啮齿类动物模型中相对罕见，加之人类与啮齿类动物之间存在种间差异，因此来源于人类的疾病模型更有利于揭示人类RB的发病机制并寻找治疗靶点。本文所述方案介绍了两种基因编辑的人胚胎干细胞（hESC）系的构建方法，分别携带RB1基因的双等位点突变（RB1Mut/Mut）和RB1基因敲除突变（RB1-/-）。在视网膜发育过程中，可观察到RB的形成。此外，RB细胞系也通过从RB类器官中分离获得。综上，通过采用二维与三维联合分化方案，将基因编辑后的hESC系分化为视网膜类器官，我们成功在体外重建了人类RB，并确认其起源于视锥前体细胞。该模型将为观察视网膜母细胞瘤的发生、增殖与生长过程，以及进一步开发新型治疗药物提供有力的疾病研究平台。

引言

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）是一种罕见且致命的肿瘤，起源于视网膜视锥细胞前体1,2,3，是儿童时期最常见的眼内恶性肿瘤4。RB1基因的纯合性失活是RB发生的起始遗传病变5。然而，携带RB1突变的小鼠并不能形成视网膜肿瘤2。尽管通过结合Rb1突变与其他遗传修饰可在小鼠中诱导肿瘤发生，但这些肿瘤仍缺乏人类RB的典型特征6。得益于视网膜类器官分化技术的发展，现已可利用人胚胎干细胞（hESC）获得具有人类RB特征的视网膜母细胞瘤模型1。

过去十年中，已建立了多种视网膜类器官分化的实验方案，包括二维（2D）7、三维（3D）8以及2D与3D相结合的方法9。本研究中用于生成人视网膜母细胞瘤（RB）的方法结合了贴壁培养与悬浮培养技术9。通过将RB1基因突变的人胚胎干细胞（hESC）分化为视网膜类器官，可在约第45天检测到RB的形成，并在约第60天开始迅速增殖。至第90天，可实现RB的分离及RB细胞系的建立；此外，在第120天时，RB几乎包绕所有视网膜类器官。

由人胚胎干细胞衍生的视网膜母细胞瘤（RB）是一种用于研究RB起源、肿瘤发生及治疗方法的创新模型。本方案详细描述了基因编辑人胚胎干细胞的构建、视网膜母细胞瘤的分化过程以及对所获得肿瘤的表征分析。

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方案

本研究已获得首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 人胚胎干细胞购自 WiCell 研究所。

1. 生成 RB1 突变的人胚胎干细胞

  1. 用于敲除（KO）RB1 的 CRISPR/Cas9 靶向载体。
    1. 设计一对 sgRNA。为实现RB1的完全敲除，靶向该基因的第一个外显子。正向引物序列为 CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG，反向引物序列为 AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC。
      注：针对特定的RB1突变，还需提供修复模板。本方案中以RB1-KO 细胞系为例进行说明。
    2. 按照生产商说明书，使用 BbsI 限制性内切酶（参见材料表）在 37 °C 条件下对 1 µg 的 pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro 质粒进行 30 分钟的酶切反应。
    3. 根据生产商说明书，使用纯化试剂盒对酶切后的质粒进行纯化。
      注：可直接使用纯化试剂盒对酶反应产物进行纯化，无需琼脂糖凝胶电泳分离（参见材料表）。
    4. 使用 T4 多聚核苷酸激酶（PNK）（材料表）对每对寡核苷酸进行磷酸化和退火处理，反应体系包含：1 µL 寡核苷酸1（100 µM）、1 µL 寡核苷酸2（100 µM）、1 µL 10x T4 连接缓冲液、6.5 µL ddH2O 和 0.5 µL T4 PNK。
      注：步骤 1.1.1 中的正向和反向引物为一对寡核苷酸。在 PCR 仪中进行磷酸化和退火反应，程序如下：37 °C 30 分钟；95 °C 5 分钟；以每分钟降低 5 °C 的速率降温至 25 °C。
    5. 将磷酸化并退火后的寡核苷酸在室温（RT）下用无核酸酶水稀释 200 倍，即取 1 µL 寡核苷酸混合物加入 199 µL 无核酸酶水中。
    6. 构建连接反应体系：加入步骤 1.1.3 中获得的 BbsI 酶切质粒 50 ng、步骤 1.1.5 中的寡核苷酸双链 1 µL、2x 连接缓冲液 5 µL、连接酶 1 µL，并用无核酸酶水补足至 10 µL，混匀后在室温下孵育 10 分钟。
    7. 将连接产物转化至感受态细胞，并对阳性克隆进行测序以用于后续实验。
      注：测序时使用 U6 正向或反向引物。
      1. 将感受态细胞置于冰上解冻。
      2. 取 50 µL 感受态细胞转移至 1.5 mL 微离心管中。
      3. 向感受态细胞中加入 1 µL 步骤 1.1.6 的连接混合物。
      4. 轻轻吹打管壁 3 次以混匀。
        注：切勿涡旋震荡。
      5. 将混合物置于冰上静置 30 分钟。
      6. 在 42 °C 条件下热激 90 秒。
      7. 向管中加入 950 µL 未加抗生素的室温 Luria-Bertani（LB）液体培养基。
      8. 将离心管置于摇床中，在 37 °C、300 rpm 条件下振荡培养 60 分钟。
      9. 提前将含胰蛋白胨、酪蛋白胨、氯化钠、琼脂粉和氨苄青霉素的 LB 平板预热至 37 °C。
      10. 在室温下，取 50–100 µL 菌液与连接产物混合物均匀涂布于平板上。
      11. 将平板在 37 °C 条件下过夜培养。
      12. 从平板上挑取 12 个单克隆，转移至含氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，并在 300 rpm 摇床中培养 60 分钟。
      13. 以步骤 1.1.7.12 中的菌液 1 µL 作为模板进行 PCR 扩增，筛选阳性克隆。
      14. 使用 U6 引物对阳性克隆进行测序，选择含有设计序列的 sgRNA 克隆用于下一步实验。
    8. 使用中量质粒提取试剂盒（参见材料表）提取质粒。
      注：使用小量提取试剂盒所获得的质粒在质量和数量上均不足以满足后续的核转染实验。中量或大量提取试剂盒比小量提取试剂盒更适用。
  2. 人胚胎干细胞（hESC）培养与核转染。
    注：所有试剂需提前恢复至室温。
    1. 将 1 × 106 个 H9 细胞复苏至预先包被的 6 孔板中，加入含 10 µM Y-27632（ROCK 抑制剂）的 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基。
      注：使用 1% 生长因子减少型基底膜基质在 37 °C 条件下包被 6 孔板，至少孵育 30 分钟。
    2. 次日，吸除上清液，用 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗细胞一次，然后加入 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基。
    3. 在接下来的 3–5 天内，每天更换一次培养基（每次加入 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基），直至细胞融合度达到约 80%。
    4. 传代 1–2 次以调整 hESC 的状态。
      注：判断 hESC 状态最简便的方法是观察其形态学特征。
    5. 在 6 孔板中培养未分化的 H9 细胞，直至其融合度达到 80%。
    6. 在核转染前 2 小时更换培养基：加入含 10 µM Y-27632 的 2 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基，并使用 1% 生长因子减少型基底膜基质预先包被 12 孔板中的一个孔。
    7. 吸除培养基，并用 1 mL 预热的 DPBS 清洗细胞一次。
    8. 去除 DPBS，加入 1 mL 细胞解离酶（参见材料表），在 37 °C 条件下孵育 3.5 分钟。
    9. 向细胞中加入 1 mL 新鲜 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基，轻轻吹打两次，使 H9 细胞形成单细胞悬液。
    10. 取 100 µL 混合液用于细胞计数，将剩余细胞转移至含 2 mL ncEpic-hiPSC/hESC 培养基的 15 mL 离心管中。
    11. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，将约 2 × 106 个细胞重悬于 100 µL 反应体系中。根据生产商说明书优化细胞数量、质粒用量、核转染仪参数及反应条件。核转染系统详见材料表。
      注：通常情况下，核转染过程中不允许产生气泡。
    12. 转染完成后，将细胞转移至预先包被的 12 孔板中，补充 1.5 mL ncEpic-hiPSC/hESC 培养基和 10 µM Y-27632，并置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
    13. 每日更换培养基。转染 48 小时后，加入 2 µg/mL 嘌呤霉素进行约一周的筛选。
      注：前 3 天会有大量细胞死亡。嘌呤霉素筛选后的一周内，存活细胞可能开始增殖并形成克隆。在筛选期间，确保培养基中始终含有 2 µg/mL 嘌呤霉素。
    14. 在显微镜下手动挑取单克隆。
      注：克隆形态应与 hESC 克隆一致。使用 10 µL 白色/普通枪头在液体中将克隆切割为 2–6 小块，将每个克隆转移至 12 孔板中一个预先包被的孔内。
    15. 首先鉴定RB1基因突变情况及脱靶效应（表 1），然后检测多能性以表征RB1基因敲除的 H9 细胞系。
      ​注：通过 PCR 和 Sanger 测序检测RB1突变及脱靶情况；通过 RT-PCR 和免疫荧光法鉴定多能性标志物。

2. 人视网膜母细胞瘤的构建

  1. RB1-KO hESC 的维持。
    1. 将基因编辑的 H9 细胞培养于经生长因子减少型基底膜基质包被的 6 孔板中，每孔加入 2 mL ncEpic-hiPSC/hESC 培养基，每日更换培养基。
    2. 使用 EDTA 缓冲液在 37 °C 下消化 3.5 分钟，或在室温下消化 5 分钟。
      ​注意：EDTA 缓冲液由 1× DPBS、5 mM EDTA 和 0.9 mg/mL NaCl 混合而成。
  2. 视网膜细胞分化。
    注意：分化前需预先配制培养基 I。配制方法为：将 24.5 mL DMEM/F12-谷氨酰胺（1×）、24.5 mL 神经元基础培养基、250 µL 100× 补充剂 A、500 µL 50× 补充剂 B、0.1 mM β-巯基乙醇和 250 µL 100× L-谷氨酰胺混合。使用前将所有组分预热至室温。
    1. 将 RB1-KO hESC 在 6 孔板的一个孔中培养至约 80% 汇合度。
    2. 吸除培养基，并用 1 mL 1× DPBS 轻柔清洗细胞一次。
    3. 加入 1 mL dispase 缓冲液（参见材料表），在 37 °C 下孵育 5 分钟以抬升细胞集落。
      注意：在显微镜下观察细胞集落，通常约 5 分钟后集落边缘开始卷起。
    4. 吸除 dispase 缓冲液，并用 1 mL 1× DPBS 轻柔冲洗细胞一次。
    5. 向孔中加入 1 mL 培养基 I。
    6. 在液体中用 10 µL 白色/普通移液枪头将集落切割成小块（每个集落切割为 6–9 块）。
      注意：通常约 60%–70% 的细胞会从孔底脱落。使用细胞刮刀将剩余细胞在液体中轻轻刮下。
    7. 将所有细胞转移至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。
    8. 保留约 50 µL 上清液用于重悬细胞，随后通过轻柔振荡将细胞与 250 µL 生长因子减少型基底膜基质混合。
      注意：使用前应将生长因子减少型基底膜基质保持在 4 °C 或冰上。若其已分装并储存于 -20 °C，使用前需置于 4 °C 过夜或至少 1 小时。
    9. 将含有悬浮细胞的 15 mL 离心管置于 37 °C 培养箱中孵育 20 分钟。
      注意：确保细胞与生长因子减少型基底膜基质形成凝固的凝胶。
    10. 向 15 mL 离心管中加入 1 mL 培养基 I，然后用 1 mL 移液枪轻柔吹打凝固的凝胶 2–3 次，使其分散成小团块。
    11. 加入 9 mL 培养基 I，将细胞悬液转移至一个 10 cm 细胞培养皿中。
    12. 将培养皿置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中，并将该日记为第 0 天。
    13. 在第 1 天使用显微镜观察细胞。
      注意：培养皿中可观察到数千个中空囊泡。平均每块凝胶中可见 3–4 个囊泡。
    14. 在第 5 天更换培养基。将上清液收集至 15 mL 离心管中，待囊泡沉降至管底后吸除旧培养基，并更换为新鲜的培养基 I。
      注意：若第 4 天培养基已变黄，则应在第 4 天换液，否则在第 5 天进行。向原培养皿中加入 10 mL 新鲜培养基 I。已有数百个囊泡附着于培养表面，应保留在原皿中。
    15. 将离心管中的囊泡分散至两个 10 cm 培养皿中。
      注意：确保每个培养皿中至少含有 300 个囊泡。若囊泡未达到汇合状态，不应将其分至其他培养皿，而应将其返回原 10 cm 培养皿中。
    16. 至第 7 天，大多数囊泡（超过 95%）已附着于培养皿表面，铺展开并形成贴壁集落。
      注意：最早在第 3 天即可观察到贴壁集落。
    17. 在第 10 天更换为新鲜的培养基 I。确保所有囊泡均已贴壁。
    18. 下一步操作前配制培养基 II：将以下组分混合——36 mL DMEM、12 mL F12、2% 补充剂 B（v/v）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（NEAA）。
    19. 确保在第 13–17 天细胞充分铺展。当细胞铺展开但尚未与邻近集落接触时，在第 15 天进行下一步操作。
    20. 用 1 mL DPBS 轻柔清洗细胞一次，随后加入 1 mL dispase 溶液，在 37 °C 下孵育 5 分钟。
      注意：5 分钟内可见细胞边缘抬升。
    21. 吸除 dispase 缓冲液，并用 1 mL 1× DPBS 轻柔冲洗培养物一次。
    22. 向每个 10 cm 培养皿中加入 10 mL 培养基 II，并置于 37 °C、5% CO2 培养箱中继续培养。
    23. 贴壁培养物在 24 小时后会自发脱落，并自组装形成视网膜类器官。
      注意：在随后的两天内，大量未能形成类器官的细胞将发生死亡。
    24. 脱落 3 天后，从细胞培养皿中收集细胞，并将类器官在 15 mL 离心管中静置沉降。
    25. 吸除上清液，将类器官转移至新的非粘附性培养皿（培养皿）中，加入 10 mL 培养基 II，继续培养 4 天。
    26. 配制培养基 III：将 DMEM 与 F12 按 3:1 体积比混合，加入 2% 补充剂 B（v/v）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（NEAA）、8% 胎牛血清（FBS，v/v）、100 µM 牛磺酸和 2 mM 谷氨酰胺。
    27. 在脱落一周后，将培养基更换为培养基 III。
    28. 自此日起，使用培养基 III 培养类器官，并每周更换两次培养基。
  3. RB 细胞系的建立。
    注意：所有试剂均已在室温预热。
    1. 在第 90 天，RB（80%–90%）已包裹整个视网膜类器官。因此，选择 90 天龄的 RB 类器官用于建立 RB 细胞系。
    2. 通过将 Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 培养基与 10% FBS 混合，配制 1640 培养基。
    3. 在显微镜下，使用显微手术刀在 RPMI-1640 培养基中将 RB 切割成小块（每个 RB 切割为 20–25 块）。
    4. 吸除 RPMI-1640 培养基，并用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 在 37 °C 下处理 10 分钟。
    5. 加入 RPMI-1640 培养基终止反应，并在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
    6. 吸除上清液，将细胞重悬于 1640 培养基中，并接种于非粘附性培养皿中。
    7. RB 细胞系为悬浮培养。每周更换两次培养基，并在两周内进行传代。
      注意：原代 RB 细胞的增殖速率较慢。

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结果

RB 生成的过程如图1所示，该过程结合了贴壁培养和悬浮培养。可以从RB1-KO hESC中收获人RB，并通过分离RB类器官获得RB细胞系。

此处，该方案详细介绍了不同阶段的分化过程（图2）。中空的球体在最初3天内形成，随后附着于培养表面并逐渐扩展（图2A-E）。从第15天开始，细胞被抬高并在悬浮条件下培养（图 2F）。脱离后的第二天，视网膜类器官形成，可见明亮的边缘（图 2G，黑色箭头）。此外，类器官外部的这些细胞在接下来的一周内可能死亡（图2G，橙色箭头）。第27天，视泡结构已明显可见，约90%的类器官呈现出该结构（图 2H

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讨论

人类视网膜母细胞瘤（RB）由RB1基因失活及Rb蛋白功能障碍引起。在本方案中，RB1基因敲除的人胚胎干细胞（hESC）是体外生成视网膜母细胞瘤模型的关键步骤。然而，即使使用RB1-/- hESC，由于视网膜类器官分化方法的不同，也可能无法形成RB10。在本方案中，从贴壁培养转为悬浮培养是分化过程中的关键环节。囊状结构的密度、多能干细胞的类型以及增殖速率均为影响脱离时机的变量9。理想的细胞脱离时机应为细胞已充分扩展但尚未与邻近克隆发生相互接触。若克隆之间已相互连接，则会导致视网膜类器官连续融合，从而降低分化效率。

通过严谨地执行各个步骤，可以顺利地获得视网膜母细胞瘤（RB）。然而，该方法仅能模拟具有RB1双等位基因失活的RB。对于携带RB1杂合突变的遗传性RB患者而言，该模型无法模拟携带RB1杂合突变的肿瘤发生过程11

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披露

作者们未意识到存在任何可能影响本研究客观性的附属关系、会员资格、资金支持或财务持有情况。

致谢

我们感谢502团队提供的所有帮助。本工作部分得到了北京市自然科学基金（Z200014）和国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2017YFA0105300）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Life Technologies21985-023
Anti-ARR3SigmaHPA063129抗体
Anti-CRX (M02)AbnoveABN-H00001406-M02抗体
Anti-Ki67Abcam ab15580抗体
Anti-Syk (D3Z1E)Cell Signaling Technology13198抗体
BbsINEBR3539S限制性内切酶
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies7923
DMEM 基础培养基Gibco10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
胎牛血清 (FBS)，适用于人胚胎干细胞Biological Industry04-002-1A
谷氨酰胺Gibco35050-061
Ham's F-12 营养混合物 (Hams F12)Gibco11765-054
MEM 非必需氨基酸溶液 (100X)SigmaM7145
Neurobasal 培养基Gibco21103-049
P3 原代细胞 4D-核转染试剂盒 X Kit SLonzaV4XP-3032核转染试剂盒
青霉素-链霉素Gibco15140-122
嘌呤霉素Gene OperationISY1130- 0025MG
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
ncEpic-hiPSC/hESC 培养基NuwacellRP010011.2.1 节中的 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基
生长因子减少型基底膜基质BD3562311.2.1 节中的 Matrigel
细胞解离酶Gibco12563-0111.2.8 节中的 TrypLE Express
RNeasy Midi 试剂盒QIAGEN75144
RNeasy Mini 试剂盒QIAGEN74104
补充剂 ALife Technologies17502-048N-2 补充剂 (100X)，液体，培养基 I 中的补充剂
补充剂 BLife Technologies17105-041B-27 补充剂 (50X)，液体，培养基 I、II、III 中的补充剂
T4 多核苷酸激酶Life TechnologiesEK0032
牛磺酸SigmaT-8691-25G
Y-27632 2HClSelleckS1049
pX330-U6-嵌合型 BB-CBh-hSpCas9-2A-PuroAddgene42230
Nucleofector 4DLonza
RPMISigmaR0883-500ML

参考文献

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