方法文章

体外重建人类视网膜母细胞瘤

DOI：

10.3791/62629

⸱

2022年10月11日

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

本文内容

摘要

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我们描述了一种通过在人胚胎干细胞（hESC）中引入双等位基因RB1突变来生成人视网膜母细胞瘤（RB）的方法。此外，还可利用体外分离的RB成功培养RB细胞系。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

视网膜母细胞瘤（RB）是一种儿童期癌症，若不进行治疗则具有致死性。由于RB起源于视锥细胞前体，而这类细胞在啮齿类动物模型中相对罕见，加之人类与啮齿类动物之间存在种间差异，因此来源于人类的疾病模型更有利于揭示人类RB的发病机制并寻找治疗靶点。本文所述方案介绍了两种基因编辑的人胚胎干细胞（hESC）系的构建方法，分别携带RB1基因的双等位点突变（RB1Mut/Mut）和RB1基因敲除突变（RB1-/-）。在视网膜发育过程中，可观察到RB的形成。此外，RB细胞系也通过从RB类器官中分离获得。综上，通过采用二维与三维联合分化方案，将基因编辑后的hESC系分化为视网膜类器官，我们成功在体外重建了人类RB，并确认其起源于视锥前体细胞。该模型将为观察视网膜母细胞瘤的发生、增殖与生长过程，以及进一步开发新型治疗药物提供有力的疾病研究平台。

引言

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视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, RB）是一种罕见且致命的肿瘤，起源于视网膜视锥细胞前体1,2,3，是儿童时期最常见的眼内恶性肿瘤4。RB1基因的纯合性失活是RB发生的起始遗传病变5。然而，携带RB1突变的小鼠并不能形成视网膜肿瘤2。尽管通过结合Rb1突变与其他遗传修饰可在小鼠中诱导肿瘤发生，但这些肿瘤仍缺乏人类RB的典型特征6。得益于视网膜类器官分化技术的发展，现已可利用人胚胎干细胞（hESC）获得具有人类RB特征的视网膜母细胞瘤模型1。

过去十年中，已建立了多种视网膜类器官分化的实验方案，包括二维（2D）7、三维（3D）8以及2D与3D相结合的方法9。本研究中用于生成人视网膜母细胞瘤（RB）的方法结合了贴壁培养与悬浮培养技术

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方案

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本研究已获得首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 人胚胎干细胞购自 WiCell 研究所。

1. 生成 RB1 突变的人胚胎干细胞

  1. 用于敲除（KO）RB1 的 CRISPR/Cas9 靶向载体。
    1. 设计一对 sgRNA。为实现RB1的完全敲除，靶向该基因的第一个外显子。正向引物序列为 CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG，反向引物序列为 AAACCCGAAAAACGGCCGCCACCGC。
      注：针对特定的RB1突变，还需提供修复模板。本方案中以RB1-KO 细胞系为例进行说明。
    2. 按照生产商说明书，使用 BbsI 限制性内切酶（参见材料表）在 37 °C 条件下对 1 µg 的 pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro 质粒进行 30 分钟的酶切反应。
    3. 根据生产商说明书，使用纯化试剂盒对酶切后的质粒进行纯化。
      注：可直接使用纯化试剂盒对酶反应产物进行纯化，无需琼脂糖凝胶电泳分离（参见材料表）。
    4. 使用 T4 多聚核苷酸激酶（PNK）（材料表）对每对寡核苷酸进行磷酸化和退火处理，反应....

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结果

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RB 生成的过程如图1所示，该过程结合了贴壁培养和悬浮培养。可以从RB1-KO hESC中收获人RB，并通过分离RB类器官获得RB细胞系。

此处，该方案详细介绍了不同阶段的分化过程（图2）。中空的球体在最初3天内形成，随后附着于培养表面并逐渐扩展（图2A-E）。从第15天开始，细胞被抬高并在悬浮条件下培养（图 2F）。脱离后的第二天，视网膜类器官形成，可见明亮的边缘（图 2G，黑色箭头）。此外，类器官外部的这些细胞在接下来的一周内可能死亡（图2G，橙色箭头）。第27天，视泡结构已明显可见，约90%的类器官呈现出该结构（图 2H

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讨论

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人类视网膜母细胞瘤（RB）由RB1基因失活及Rb蛋白功能障碍引起。在本方案中，RB1基因敲除的人胚胎干细胞（hESC）是体外生成视网膜母细胞瘤模型的关键步骤。然而，即使使用RB1-/- hESC，由于视网膜类器官分化方法的不同，也可能无法形成RB10。在本方案中，从贴壁培养转为悬浮培养是分化过程中的关键环节。囊状结构的密度、多能干细胞的类型以及增殖速率均为影响脱离时机的变量9。理想的细胞脱离时机应为细胞已充分扩展但尚未与邻近克隆发生相互接触。若克隆之间已相互连接，则会导致视网膜类器官连续融合，从而降低分化效率。

通过严谨地执行各个步骤，可以顺利地获得视网膜母细胞瘤（RB）。然而，该方法仅能模拟具有RB1双等位基因失活的RB。对于携带RB1杂合突变的遗传性RB患者而言，该模型无法模拟携带RB1杂合突变的肿瘤发生过程11

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披露

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作者们未意识到存在任何可能影响本研究客观性的附属关系、会员资格、资金支持或财务持有情况。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢502团队提供的所有帮助。本工作部分得到了北京市自然科学基金（Z200014）和国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2017YFA0105300）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基乙醇Life Technologies21985-023
Anti-ARR3SigmaHPA063129抗体
Anti-CRX (M02)AbnoveABN-H00001406-M02抗体
Anti-Ki67Abcam ab15580抗体
Anti-Syk (D3Z1E)Cell Signaling Technology13198抗体
BbsINEBR3539S限制性内切酶
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies7923
DMEM 基础培养基Gibco10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
胎牛血清 (FBS)，适用于人胚胎干细胞Biological Industry04-002-1A
谷氨酰胺Gibco35050-061
Ham's F-12 营养混合物 (Hams F12)Gibco11765-054
MEM 非必需氨基酸溶液 (100X)SigmaM7145
Neurobasal 培养基Gibco21103-049
P3 原代细胞 4D-核转染试剂盒 X Kit SLonzaV4XP-3032核转染试剂盒
青霉素-链霉素Gibco15140-122
嘌呤霉素Gene OperationISY1130- 0025MG
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
ncEpic-hiPSC/hESC 培养基NuwacellRP010011.2.1 节中的 ncEpic-hiPSC/hESC 培养基
生长因子减少型基底膜基质BD3562311.2.1 节中的 Matrigel
细胞解离酶Gibco12563-0111.2.8 节中的 TrypLE Express
RNeasy Midi 试剂盒QIAGEN75144
RNeasy Mini 试剂盒QIAGEN74104
补充剂 ALife Technologies17502-048N-2 补充剂 (100X)，液体，培养基 I 中的补充剂
补充剂 BLife Technologies17105-041B-27 补充剂 (50X)，液体，培养基 I、II、III 中的补充剂
T4 多核苷酸激酶Life TechnologiesEK0032
牛磺酸SigmaT-8691-25G
Y-27632 2HClSelleckS1049
pX330-U6-嵌合型 BB-CBh-hSpCas9-2A-PuroAddgene42230
Nucleofector 4DLonza
RPMISigmaR0883-500ML

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
  2. Singh, H. P., et al.

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RB1 Ki67

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