本文介绍了一种在纳米流体装置上对单个细胞进行监测以研究急性事件及有效的HIV-1感染的实验方案。成像数据可明确病毒与宿主受体之间的相互作用以及信号通路的动力学变化。这是首个用于高通量、纵向单细胞培养与成像的纳米流体技术方法，可用于研究信号动力学和分子相互作用。
本文内容
摘要
摘要
HIV-1 引起一种慢性感染，全球超过 3700 万人受到影响。尽管接受抗逆转录病毒治疗，人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者仍会出现与慢性炎症相关的共病。然而，这些炎症信号尚未被充分表征。早期病毒进入事件对细胞信号激活及下游基因表达的影响，尚未在单细胞水平上被全面捕捉。本文作者描述了一种方法，该方法将活细胞荧光显微镜技术原理应用于一种自动化的单细胞平台，可在用户自定义的时间范围内培养并成像细胞，从而实现对动态细胞过程的高通量分析。该检测方法可追踪 HIV-1 感染后立即发生的早期事件的单细胞活体荧光显微图像，特别是病毒感染引发的钙离子内流，以及利用荧光报告病毒检测 productive 感染的发展过程。MT-4 细胞加载钙离子敏感性染料后，培养在纳米流控装置的独立小室中。培养的细胞被 HIV-1 报告病毒（HIV-1 NLCI）感染。位于纳米流控装置上方的荧光显微镜在急性 HIV-1 暴露后的 8 分钟内连续测量钙离子内流。在同一细胞群体中，productive HIV-1 感染情况在随后的 4 天内进行检测。通过对这些时间序列的成像数据进行分析，可明确病毒与宿主受体相互作用及信号通路动态变化。作者提出了一种集成化、可扩展的传统成像方法替代方案，采用一种新型的光流控平台，具备单细胞分选、培养、成像和软件自动化功能。该检测方法可在不同条件下（包括细胞类型、激动剂或拮抗剂效应）测量多种参数，从而评估各类事件的动力学特征。这是首个建立的用于纳米流控高通量纵向单细胞培养与成像的方法：该技术可广泛适用于研究细胞信号动力学及动态分子相互作用。
引言
慢性炎症是导致艾滋病病毒（HIV）相关早期发病和死亡的主要原因1,2,3。HIV可通过多种机制激活炎症信号通路，近期证据表明P2X受体在HIV进入细胞过程中发挥作用，这类受体属于钙离子通道型腺苷三磷酸（ATP）受体3,4,5,6,7,8,9,10。嘌呤能受体P2X亚型（P2XR）可能是促进此类炎症的重要因素。然而，HIV与P2XR相互作用的分子机制在很大程度上尚不清楚，且可能影响HIV-1病毒生命周期的早期和晚期阶段。明确驱动HIV相关慢性炎症的通路及其动力学特征，对于推进HIV感染者治疗方案的发展至关重要。
为了评估HIV-1是否直接激活P2X受体，必须平行检测....
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方案
1. 成像用细胞的准备
- 制备新鲜的 Fluo-4 AM 加载溶液：向 1.5 mL 离心管中加入 25 µL 的 100 倍浓缩去垢剂溶剂，再加入 2.5 µL 的 1000 倍浓缩 Fluo-4 AM，涡旋混匀。
- 将 2.5 mL 培养基用移液器加入加载溶液中，轻轻颠倒混匀，避光保存。
- 将 2 × 106 个 MT-4 细胞在 500 × g 条件下离心 3 分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 新配制的 Fluo-4 AM 加载溶液中，避光保存。
- 将重悬的细胞用移液器转移至 35 mm 培养皿中，在 37 °C 下孵育 15–30 分钟，随后在室温下继续孵育 15–30 分钟。
- 将细胞悬液转移至离心管中，在 500 × g 条件下离心 3 分钟，吸除含加载溶液的上清液。
- 用移液器将细胞沉淀在 1 mL 培养基中重悬，于 500 × g 离心 3 分钟进行洗涤。
- 用培养基将细胞沉淀重悬，调整细胞浓度至 2 × 106 个细胞/mL（最少 50 µL），避光保存。
2. 光流控系统的准备、细胞加载和细胞捕获
- 使用润湿溶液制备芯片，以促进细胞捕获。
- ....
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结果
图1 展示了通过荧光显微镜获取的芯片格式及原始成像数据。图2 显示了通过mCherry信号对未感染细胞和感染细胞进行识别与聚类的结果。这些细胞聚类被用于分析钙离子内流动力学，结果如图3所示，表明HIV感染细胞中存在早期钙离子内流现象。图4 显示钙离子内流与mCherry荧光信号之间存在显著正相关关系20。
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讨论
所述用于研究单细胞中钙离子内流与 HIV-1 有效感染之间关系的方法，可被调整用于研究细胞内钙动力学对其他感兴趣激动剂或拮抗剂的响应。细胞成像前处理操作简便，耗时较少，所需试剂亦可通过多家常用厂商提供的便捷试剂盒获得。基于 Fluo-4 的钙离子检测方法在文献中已有充分描述，且该平台可轻松将 HIV-1 替换为其他病毒或感兴趣化合物进行研究。本方法适用于不同细胞类型和培养基质，支持使用其他或额外的荧光通道，并可同时或依次成像多种荧光染料。
此外，该方法可广泛适用于纵向时间过程中荧光标记事件的研究。标准的高通量方法（如流式细胞术）无法实现对随时间变化的离散事件进行配对研究。传统的单细胞荧光显微成像受限于通量、细胞在视野间的迁移以及耗时较长。通过将荧光成像与高通量、自动化的单细胞培养相结合，该方法能够在短期和长期时间间隔内揭示相关的分子动力学、后续效应及相互作用。需要注意的是，软件和图像分析的优化对每项应用都至关重要。
显微镜配备明场以及Cy5、Texas Red、FITC和DAPI荧光通道16.......
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披露
R.P.S. 是 Sema4 的员工。其他作者没有利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Benjamin Chen 博士在科学讨论方面提供的帮助。本工作由以下基金资助：K08AI120806（THS）、R01DA052255（THS 和 KB）以及 R21AI152833（THS 和 KB）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Beacon光流控系统 | Berkeley Lights | ||
| 胎牛血清 | Gibco | ||
| FIJI | 开源软件 | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4钙离子成像试剂盒 | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Benjamin Chen实验室 | PMID: 28148796 | |
| Hyclone青霉素-链霉素溶液 | GE Healthcare Life Sciences | SV30010 | |
| MT-4细胞 | NIH艾滋病试剂库 | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500芯片 | Berkeley Lights | ||
| 移液器吸头 | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640培养基 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| 血清移液管 | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| 组织培养罩 | 多种型号 | ||
| T75培养瓶 | Corning | 3073 |
参考文献
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- S....
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