本文描述了一种Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J（下文简称αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠报告基因品系的建立及其在心脏重编程评估中的应用。从小鼠品系中分离得到的新生小鼠心肌成纤维细胞（NCFs）可被转化为诱导性心肌细胞（iCMs），从而可通过钙离子（Ca2+）流信号，便捷且高效地评估iCMs的重编程效率及功能成熟度。
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方法文章
利用GCaMP3报告系统体外评估心脏重编程过程中的心肌特异性钙流
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
心脏重编程已成为修复受损心脏的一种潜在且富有前景的治疗方法。通过导入包括 Mef2c、Gata4、Tbx5（MGT）在内的多种转录因子，成纤维细胞可被重编程为诱导性心肌细胞（iCMs）。这些iCMs在生成时 原位 在梗死的心脏中，与周围心肌在电学和机械上整合，从而减少瘢痕面积并改善心脏功能。由于诱导心肌细胞（iCMs）的重编程效率、纯度和质量相对较低，对iCMs的表征仍然具有挑战性。目前该领域常用的方法，包括流式细胞术、免疫细胞化学和qPCR，主要关注心脏特异性基因和蛋白表达，而未充分评估iCMs的功能成熟度。心肌细胞在动作电位的触发下，电压门控钙通道开放，导致钙离子快速内流进入细胞。因此，量化钙离子内流速率是评估心肌细胞功能的一种有前景的方法。本文介绍了一种通过钙（Ca2+) 流。通过将 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J（下文简称 Myh6-Cre）与 Gt(ROSA)26Sor 小鼠杂交，建立了 αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠品系。tm38(CAG-GCaMP3)Hze/J（下文简称Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠。分离并培养出生0至2天（P0-P2）新生小鼠的新生心脏成纤维细胞（NCFs）。 体外，并将MGT的多顺反子结构导入NCFs，从而使其重编程为iCMs。由于只有成功重编程的iCMs才会表达GCaMP3报告基因，因此可通过Ca信号直观评估iCMs的功能成熟度2+ 使用荧光显微镜检测钙瞬变。与未重编程的NCFs相比，NCF-iCMs表现出显著的钙瞬变和自发性收缩，类似于心肌细胞（CMs）。本方案详细描述了小鼠品系的建立、新生小鼠心脏的分离与筛选、NCF的分离、用于心脏重编程的逆转录病毒制备、iCM诱导以及iCM钙瞬变的评估2+ 利用我们的报告基因细胞系进行通量检测，以及相关的统计分析和数据展示。预计本文所述方法将为评估心肌重编程研究中心肌样细胞（iCMs）的功能成熟度提供一个有价值的平台。
引言
心肌梗死（MI）是一种全球范围内的严重疾病。心血管疾病（CVDs）是全球最主要的死亡原因，2019年导致约1860万人死亡。1,2心血管疾病（CVDs）的总死亡率在过去半个世纪中有所下降。然而，这一趋势在一些发展中国家已放缓甚至出现逆转。1，这要求对心血管疾病采取更有效的治疗手段。作为心血管疾病的致命表现之一，心肌梗死（MI）约占美国所有心血管疾病相关死亡病例的一半2在缺血期间，由于冠状动脉阻塞导致营养物质和氧气供应受限，心肌会发生严重的代谢改变，损害心肌细胞（CMs）的收缩功能，并导致CM死亡3在心血管研究领域，已探索多种方法来修复心脏损伤并恢复受损心脏的功能4直接心脏重编程已成为修复受损心脏并恢复其功能的一种有前景的策略5,6通过引入 Mef2c、Gata4、Tbx5（MGT），成纤维细胞可被重编程为诱导性心肌样细胞（iCMs） 体外 和 体内，且这些iCMs可减小瘢痕面积并改善心脏功能7,
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方案
所有涉及动物的实验程序和操作均经机构动物护理 & 密歇根大学动物使用委员会。所有涉及细胞培养的实验操作均须在二级生物安全柜（BSL2 Biological Safety Cabinet）内无菌条件下进行。涉及病毒的操作须遵循经转染细胞、移液器吸头及试管的正确处置指南，以避免对环境和健康造成危害。
1. 建立 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J 小鼠品系（以下简称 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）（图1）
- 分别准备 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J 小鼠品系（Jackson 实验室货号 009074，简称 Myh6-Cre）和 Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J 小鼠品系（Jackson 实验室货号 014538，简称 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）。
- 分别将两个品系的小鼠培育至 8 周龄，以获得成年 Myh6-Cre 小鼠和成年 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠。
- 将成年 Myh6-Cre 小鼠与成年 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠进行杂交。
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结果
生成 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠品系的实验流程及转基因小鼠的基因结构如图所示 图1. 尽管小鼠品系已建立，仍需分离仔鼠心脏并在倒置荧光显微镜下观察以确认基因型。具有正确基因型的心脏会显示 Ca2+ 与搏动同步的荧光信号，以GCaMP3荧光显示，而在对照心脏中未观察到荧光图2, 视频 1， 和 视频 2）。分离的NCFs将在2小时内贴壁，并在接种后1天呈现椭圆形至圆形。图3）。通过 Ca 振荡和收缩功能评估 iCMs 的功能成熟度和重编程效率2+ MGT 引入后第 14 天的荧光变化。可通过荧光显微镜观察重编程细胞，以检测 Ca2+ 荧光。在IMAP组和MGT组中均可观察到GCaMP3+细胞，而IMAP组的GCaMP3+细胞数量显著更多，且其钙离子振荡模式更接近正常的CM细胞.......
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讨论
评估诱导心肌细胞（iCMs）的功能对于心脏重编程领域至关重要。本论文描述了一种已建立的 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J 小鼠品系，介绍了如何利用从该品系新生小鼠中分离的成纤维细胞（NCFs）进行重编程以获得 iCMs，并通过钙离子（Ca2+）通量检测来评估 iCMs 的功能。这是一种用于评估 iCMs 功能成熟度的从头方法。
成功应用此方法进行重编程和评估有几个关键步骤。首先，分离后应使用新鲜且状态良好的NCFs。心脏的分离和切割过程必须迅速。最重要的是，必须严格遵循孵育时间，以避免过度消化导致细胞活力和状态下降。其次，在所有操作步骤中，病毒感染效率往往是导致结果差异较大的主要原因。病毒感染效率主要受两个因素影响。一方面，不同实验之间病毒滴度应保持一致，这就要求转染的质粒数量以及Plat-E细胞的状态和密度具有一致性。遵循本方案的研究人员应在正式实验前评估最佳的接种密度和时间。病毒应立即使用，以避免因冻融循环敏感而导致滴度降低。此外，感染时应保.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Leo Gnatovskiy在编辑本稿件英文文本方面所做的努力。图1使用BioRender.com制作。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）向王博士提供的资助（1R01HL109054）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 孔细胞培养板 | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| 一体化荧光显微镜 | Keyence | BZ-X800E | 倒置荧光显微镜 |
| B-27 添加剂（50倍浓度），无血清 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| 杀稻瘟菌素 S 盐酸盐（10 mg/mL） | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| 牛血清白蛋白（BSA）无DNase和无蛋白酶粉末 | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 微珠，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 微珠 |
| 胶原酶，II型 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| 计数室 | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | 血细胞计数板 |
| DMEM，高糖，无谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS，含钙、镁 | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| 乙醇，200 proof（100%） | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 乙二胺四乙酸（经ACS认证） | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| 胎牛血清 | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS，含钙、镁，无酚红 | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 倒置显微镜 | Olympus | IX73P2F | 倒置荧光显微镜 |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS 柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199，Earle's 盐 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS 分离器及起始试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV 注射器滤器，0.45 µm，PVDF，33 mm，γ射线灭菌 | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | 由密歇根大学Shaomeng Wang’s实验室提供 | ||
| Opti-MEM I 减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS，pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E（Plat-E）逆转录病毒包装细胞系 | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| 聚乙二醇 | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene 感染/转染试剂 | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| 重组人胰岛素样生长因子-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 离心机系列 | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| 无菌细胞筛 | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm 筛网 |
| 表面处理组织培养皿 | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE 缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| 台盼蓝溶液 | Millipore Sigma | T8154 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| 涡旋混合器 | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
参考文献
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al.
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