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利用GCaMP3报告系统体外评估心脏重编程过程中的心肌特异性钙流

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DOI：

10.3791/62643

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2022年2月22日

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J（下文简称αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠报告基因品系的建立及其在心脏重编程评估中的应用。从小鼠品系中分离得到的新生小鼠心肌成纤维细胞（NCFs）可被转化为诱导性心肌细胞（iCMs），从而可通过钙离子（Ca2+）流信号，便捷且高效地评估iCMs的重编程效率及功能成熟度。

摘要

心脏重编程已成为修复受损心脏的一种潜在且富有前景的治疗方法。通过导入包括 Mef2c、Gata4、Tbx5（MGT）在内的多种转录因子，成纤维细胞可被重编程为诱导性心肌细胞（iCMs）。这些iCMs在生成时 原位 在梗死的心脏中，与周围心肌在电学和机械上整合，从而减少瘢痕面积并改善心脏功能。由于诱导心肌细胞（iCMs）的重编程效率、纯度和质量相对较低，对iCMs的表征仍然具有挑战性。目前该领域常用的方法，包括流式细胞术、免疫细胞化学和qPCR，主要关注心脏特异性基因和蛋白表达，而未充分评估iCMs的功能成熟度。心肌细胞在动作电位的触发下，电压门控钙通道开放，导致钙离子快速内流进入细胞。因此，量化钙离子内流速率是评估心肌细胞功能的一种有前景的方法。本文介绍了一种通过钙（Ca2+) 流。通过将 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J（下文简称 Myh6-Cre）与 Gt(ROSA)26Sor 小鼠杂交，建立了 αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠品系。tm38(CAG-GCaMP3)Hze/J（下文简称Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠。分离并培养出生0至2天（P0-P2）新生小鼠的新生心脏成纤维细胞（NCFs）。 体外，并将MGT的多顺反子结构导入NCFs，从而使其重编程为iCMs。由于只有成功重编程的iCMs才会表达GCaMP3报告基因，因此可通过Ca信号直观评估iCMs的功能成熟度2+ 使用荧光显微镜检测钙瞬变。与未重编程的NCFs相比，NCF-iCMs表现出显著的钙瞬变和自发性收缩，类似于心肌细胞（CMs）。本方案详细描述了小鼠品系的建立、新生小鼠心脏的分离与筛选、NCF的分离、用于心脏重编程的逆转录病毒制备、iCM诱导以及iCM钙瞬变的评估2+ 利用我们的报告基因细胞系进行通量检测，以及相关的统计分析和数据展示。预计本文所述方法将为评估心肌重编程研究中心肌样细胞（iCMs）的功能成熟度提供一个有价值的平台。

引言

心肌梗死（MI）是一种全球范围内的严重疾病。心血管疾病（CVDs）是全球最主要的死亡原因，2019年导致约1860万人死亡。1,2心血管疾病（CVDs）的总死亡率在过去半个世纪中有所下降。然而，这一趋势在一些发展中国家已放缓甚至出现逆转。1，这要求对心血管疾病采取更有效的治疗手段。作为心血管疾病的致命表现之一，心肌梗死（MI）约占美国所有心血管疾病相关死亡病例的一半2在缺血期间，由于冠状动脉阻塞导致营养物质和氧气供应受限，心肌会发生严重的代谢改变，损害心肌细胞（CMs）的收缩功能，并导致CM死亡3在心血管研究领域，已探索多种方法来修复心脏损伤并恢复受损心脏的功能4直接心脏重编程已成为修复受损心脏并恢复其功能的一种有前景的策略5,6通过引入 Mef2c、Gata4、Tbx5（MGT），成纤维细胞可被重编程为诱导性心肌样细胞（iCMs） 体外 和 体内，且这些iCMs可减小瘢痕面积并改善心脏功能7,8.

尽管心脏重编程是治疗心肌梗死的一种有前景的策略，但仍存在诸多挑战。首先，重编程的效率、纯度和质量往往未达到预期水平。MGT诱导仅能使总成纤维细胞中8.4%（cTnT阳性）或24.7%（αMHC-GFP阳性）转化为诱导性心肌样细胞（iCMs） 体外7，或高达35% 体内8，这限制了其应用。即使在系统中引入更多因子，如 Hand29 或 Akt1/PKB10，重编程效率仍然难以令人满意，尚不足以应用于临床环境。因此，该领域仍需开展更多专注于提高重编程效率的研究。其次，iCMs 的电生理完整性和收缩特性对于心脏功能的有效改善至关重要，但这些功能特性评估具有挑战性。目前该领域广泛使用的一些评估方法，包括流式细胞术、免疫细胞化学以及若干关键心肌细胞基因表达的 qPCR，均主要关注 iCMs 与心肌细胞（CMs）的相似性，而非直接反映 iCMs 的功能特性。此外，这些方法操作相对复杂且耗时。而重编程研究通常涉及对可能促进 iCMs 成熟的潜在重编程因子的筛选11，心脏重编程需要一种基于iCMs功能的快速且便捷的方法。

在每次收缩周期中，心肌细胞（CMs）会打开细胞膜上的电压门控钙离子通道，导致钙离子（Ca2+）从细胞外液短暂流入细胞质，进而参与肌丝收缩。这种Ca2+的流入与流出循环是心肌收缩的基本特征，构成了CMs的正常功能12。因此，检测Ca2+内流的方法可能成为评估CMs及类CM细胞（包括iCMs）功能的潜在手段。此外，对于iCMs而言，该方法还提供了一种评估重编程效率的新途径。

基因编码的钙离子指示剂（GECIs）已被开发并广泛用于指示细胞活动，尤其是动作电位。通常，GECIs 由一个钙离子（Ca2+）结合结构域（如钙调蛋白）和一个荧光结构域（如 GFP）组成，其中 GCaMP3 具有高亲和力和强荧光强度。当局部钙离子浓度发生变化时，GCaMP3 的荧光结构域将被激活13。本文描述了一种在 Myh6+ 细胞中特异性表达 GCaMP3 报告基因的小鼠品系。通过将 MGT 引入该品系新生小鼠分离得到的 NCFs，可利用荧光信号监测重编程过程，成功重编程为 iCMs 的细胞将表现出荧光。此类小鼠品系及方法将为研究心脏重编程提供一个有价值的平台。

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方案

所有涉及动物的实验程序和操作均经机构动物护理 & 密歇根大学动物使用委员会。所有涉及细胞培养的实验操作均须在二级生物安全柜（BSL2 Biological Safety Cabinet）内无菌条件下进行。涉及病毒的操作须遵循经转染细胞、移液器吸头及试管的正确处置指南，以避免对环境和健康造成危害。

1. 建立 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J 小鼠品系（以下简称 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）（图1）

  1. 分别准备 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J 小鼠品系（Jackson 实验室货号 009074，简称 Myh6-Cre）和 Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J 小鼠品系（Jackson 实验室货号 014538，简称 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）。
  2. 分别将两个品系的小鼠培育至 8 周龄，以获得成年 Myh6-Cre 小鼠和成年 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠。
  3. 将成年 Myh6-Cre 小鼠与成年 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠进行杂交。
    ​注意：可设置 Myh6-Cre 雄鼠与 Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 雌鼠交配，或反向配对。两种交配方式的后代无显著差异。通常，雌鼠在杂交后 19–21 天产下 8–10 只仔鼠。

2. 新生小鼠 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 心脏的分离与筛选。

  1. 获取 P0-P2 代幼鼠。确保有 8–10 只幼鼠，以通过本方案分离出 1000 万只 NCFs。
  2. 通过低温使幼崽深度麻醉。将幼崽放置 戴上乳胶手套并浸入 直至颈部浸入碎冰与水的混合物中（2°C - 3°C）。
  3. 用75%乙醇对幼崽进行短暂消毒。
  4. 使用无菌剪刀通过断头法处死幼崽。
  5. 在心脏附近做一横向切口，挤压心脏，然后用剪刀在主动脉根部分离以分离心脏。
  6. 在荧光显微镜下观察心脏跳动。确保 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 基因型的心脏显示出 Ca2+ GCaMP3 指示的荧光信号伴随心跳。其他基因型未显示荧光（图2, 视频 1，以及 视频 2).

3. 新生儿心肌成纤维细胞（NCFs）的分离

注意：本部分采用李倩博士实验室的实验方案14，并根据本研究的具体情况进行了少量优化。

  1. 分离 αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 心脏后，将其切成四个松散连接的部分。在 6 cm 培养皿中用预冷的 DPBS 彻底清洗数次，以尽量减少分离细胞中的血细胞污染。
  2. 将心脏转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  3. 加入 8 mL 预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，在 37 °C 下消化 10 分钟。
  4. 弃去胰蛋白酶上清液，加入 5 mL 预热的 II 型胶原酶（0.5 mg/mL）HBSS 溶液。
  5. 充分涡旋混匀，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  6. 孵育结束后，充分涡旋混匀，静置使未消化的组织依靠重力自然沉降。
  7. 收集上清液至 15 mL 圆锥形离心管中，加入 5 mL 冷的成纤维细胞（FB）培养基（IMDM 加 20% FBS 和 1% 青霉素/链霉素）。
  8. 对未消化的组织重复步骤 3.4–3.7 共 4–5 次。
  9. 合并所有上清液，并用 40 µm 滤网过滤。
  10. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  11. 用 10 mL 磁珠激活细胞分选缓冲液（MACS 缓冲液；含 2 mM EDTA 和 0.5% BSA 的 1× PBS）重悬细胞。
  12. 通过台盼蓝染色法测定活细胞数量。
    1. 从步骤 3.11 中的 10 mL 细胞悬液中取出 10 µL 细胞。
    2. 与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液混合，在室温下孵育 5 分钟。
    3. 将混合液加入血细胞计数板，测定活细胞数量。死细胞呈蓝色，活细胞不着色。
  13. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  14. 对于少于 1000 万活细胞的样本，用 90 µL 冰冷的 MACS 缓冲液重悬细胞，并加入 10 µL Thy1.2 磁珠；若活细胞数量超过 1000 万，则按比例增加磁珠用量。充分吹打混匀后，在 4 °C 下孵育 30–60 分钟。
  15. 加入 10 mL MACS 缓冲液，充分混匀。
  16. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  17. 重复步骤 3.15–3.16 一次。
  18. 用 2 mL MACS 缓冲液重悬细胞与磁珠混合物。
  19. 在超净台中安装 MACS 分离装置，插入 LS 柱，并用 3 mL MACS 缓冲液平衡柱子。
  20. 当 LS 柱平衡完成后，将细胞悬液通过柱子。
  21. 用 2 mL MACS 缓冲液洗涤 LS 柱三次。
  22. 将柱子从分离装置上取下，用 2 mL MACS 缓冲液洗脱三次，收集洗脱液至 50 mL 离心管中。
  23. 在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  24. 用 5 mL FB 培养基重悬细胞。
  25. 使用血细胞计数板测定细胞数量。
  26. 用 FB 培养基稀释细胞，并按需接种至培养皿或培养板中。确保接种密度约为 2–2.5 × 104 个细胞/cm2（根据具体实验优化密度）。接种后第二天，贴壁的成纤维细胞应呈椭圆形至圆形（图 3）。

4. 用于心脏重编程的编码多顺反子 MGT 载体的逆转录病毒的制备

  1. 在含有 5% CO2 的条件下，于 37 °C 使用 Plat-E 培养基（DMEM 添加 10% 胎牛血清、1 µg/mL 嘌呤霉素和 10 µg/mL 杀稻瘟菌素）培养 Plat-E 细胞。
  2. 第 1 天，将 Plat-E 细胞以约 4–5 × 105 个细胞/孔的密度接种至 6 孔板中。
  3. 第 2 天，Plat-E 细胞通常达到 80% 汇合度。按以下步骤进行转染。根据 6 孔板中每孔的情况调整各组分的体积和用量。
    1. 用 TE 缓冲液将 2 µg pMX-puro-MGT 多顺反子逆转录病毒表达质粒载体（Addgene 111809）稀释至 500 ng/µL。
    2. 将 10 µL Lipofectamine 与 150 µL 低血清培养基混合，配制转染混合液。轻轻吹打混匀，在室温下孵育 5 分钟。移液时注意避免产生气泡。
    3. 同时，将质粒与 150 µL 低血清培养基混合，配制质粒混合液。轻轻吹打混匀，在室温下孵育 5 分钟。移液时注意避免产生气泡。
    4. 将上述两种混合液小心混合，室温孵育 5 分钟。溶液可能呈现浑浊状态。
    5. 将混合液逐滴加入待转染的细胞中。
    6. 将细胞在 37 °C 孵育过夜。
  4. 第 3 天，更换为不含嘌呤霉素和杀稻瘟菌素的新鲜完全细胞培养基。
  5. 第 4 天，即转染后 48 小时，收集含有逆转录病毒的上清液，并于 4 °C 保存。
  6. 第 5 天，即转染后 72 小时，再次收集含有逆转录病毒的上清液。
  7. 将 48 小时和 72 小时收集的上清液均用 0.45 µm 滤器过滤，然后加入 1/5 体积的 40% 聚乙二醇（PEG）溶液，使终浓度为 8% PEG，在 4 °C 沉淀过夜。
  8. 在 4,000 ×g 条件下离心 30 分钟以沉淀病毒。
    注：PEG8000-病毒会形成微小的白色沉淀。
  9. 根据需要，用含 8 µg/mL 聚凝胺（polybrene）的 iCM 培养基重悬病毒。逆转录病毒应立即使用。

5. 利用编码MGT的逆转录病毒感染将NCF重编程为iCM

  1. 在病毒感染前培养或传代NCFs。
    注意：通常NCF可传代两次。
  2. 第0天，在FB培养基中以约1-2 × 104 个细胞/cm2 的密度接种NCF。
  3. 第1天，根据需要将各孔的培养基更换为含病毒的培养基。使用6孔板中一个Plat-E孔的病毒来感染24孔板中的两个孔。滴定病毒以确定最佳病毒浓度。
    注意：可与MGT逆转录病毒同时引入其他感兴趣的重编程因子所对应的病毒。
  4. 在37 °C下孵育过夜。
  5. 第2天，即病毒感染24小时后，将含病毒的培养基更换为常规iCM培养基。
  6. 为监测GCaMP3表达，将细胞置于倒置荧光显微镜下观察。在10倍GFP通道下，最早可在第5天观察到部分细胞出现微弱的基础GCaMP3荧光。
  7. 重编程期间每2-3天更换一次培养基。如有必要，可通过在培养基中加入2 µg/mL嘌呤霉素处理3天，并维持在1 µg/mL，对感染MGT逆转录病毒的细胞进行阳性筛选。
    注意：在换液时可同时加入感兴趣的化合物（例如IGF-1、MM589、A83-01和PTC-209，如我们先前报道15中所称的IMAP组合）。
  8. 感染后14天，将培养基更换为B27培养基，以进一步诱导iCM成熟。

6. 通过 Ca2+ 流评估 iCM 功能成熟度和重编程效率

注意：如有必要，在评估前向细胞中加入1 µM异丙肾上腺素。

  1. 在室温下使用倒置荧光显微镜评估 Ca2+ 流。
  2. 在 GFP 通道中，使用 10 倍物镜观察 GCaMP3+ 细胞。确保明场通道中可见细胞的自发搏动。
  3. 在 20 倍物镜下随机选择三个视野，对每个视野中的 iCMs 的 Ca2+ 流记录 3 分钟。
    注意：此处 Ca2+ 流与细胞的自发搏动同步（图 4、图 5 以及 视频 3、视频 4、视频 5、视频 6、视频 7、视频 8）。
  4. 手动定量具有 Ca2+ 流的细胞。

7. 统计分析与数据展示

  1. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析组间差异，并进行 Student-Newman-Keuls 多重比较检验。
    注：结果以均值 ± 标准误（S.E.）表示，以 p < 0.05 为具有统计学显著性。每项实验至少重复三次。

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结果

生成 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 小鼠品系的实验流程及转基因小鼠的基因结构如图所示 图1. 尽管小鼠品系已建立，仍需分离仔鼠心脏并在倒置荧光显微镜下观察以确认基因型。具有正确基因型的心脏会显示 Ca2+ 与搏动同步的钙流，以GCaMP3荧光显示，而在对照组心脏中未观察到荧光图2, 视频 1， 和 视频 2）。分离的NCFs在2小时内会贴壁，并在接种后1天呈现椭圆形至圆形。图3). 通过Ca对iCMs的功能成熟度和重编程效率进行评估2+ 在引入MGT后14天检测通量。可通过荧光显微镜观察重编程细胞，以测量Ca2+ 荧光。GCaMP3+ 细胞在 IMAP 组和 MGT 组中均可观察到，但 IMAP 组中的 GCaMP3+ 细胞数量显著更多，且其钙离子振荡模式更接近于正常的 CMs

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讨论

评估诱导心肌细胞（iCMs）的功能对于心脏重编程领域至关重要。本论文描述了一种已建立的 Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J 小鼠品系，介绍了如何利用从该品系新生小鼠中分离的成纤维细胞（NCFs）进行重编程以获得 iCMs，并通过钙离子（Ca2+）通量检测来评估 iCMs 的功能。这是一种用于评估 iCMs 功能成熟度的从头方法。

成功应用此方法进行重编程和评估有几个关键步骤。首先，分离后应使用新鲜且状态良好的NCFs。心脏的分离和切割过程必须迅速。最重要的是，必须严格遵循孵育时间，以避免过度消化导致细胞活力和状态下降。其次，在所有操作步骤中，病毒感染效率往往是导致结果差异较大的主要原因。病毒感染效率主要受两个因素影响。一方面，不同实验之间病毒滴度应保持一致，这就要求转染的质粒数量以及Plat-E细胞的状态和密度具有一致性。遵循本方案的研究人员应在正式实验前评估最佳的接种密度和时间。病毒应立即使用，以避免因冻融循环敏感而导致滴度降低。此外，感染时应保...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Leo Gnatovskiy在编辑本稿件英文文本方面所做的努力。图1使用BioRender.com制作。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）向王博士提供的资助（1R01HL109054）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 圆锥形离心管Thermo Fisher Scientific14-959-70C
50 mL 圆锥形离心管Thermo Fisher Scientific14-959-49A
6 孔细胞培养板Alkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04–0014
一体化荧光显微镜KeyenceBZ-X800E倒置荧光显微镜
B-27 添加剂（50倍浓度），无血清Thermo Fisher Scientific17504044
杀稻瘟菌素 S 盐酸盐（10 mg/mL）Thermo Fisher ScientificA1113903
牛血清白蛋白（BSA）无DNase和无蛋白酶粉末Thermo Fisher ScientificBP9706100
CD90.2 微珠，小鼠Miltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 微珠
胶原酶，II型Thermo Fisher ScientificNC9693955
计数室Thermo Fisher Scientific02-671-51B血细胞计数板
DMEM，高糖，无谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific11960069
DPBS，含钙、镁Thermo Fisher Scientific14-040-133
乙醇，200 proof（100%）Thermo Fisher Scientific04-355-451
乙二胺四乙酸（经ACS认证）Thermo Fisher ScientificE478-500
胎牛血清Corning35-010-CV
HBSS，含钙、镁，无酚红Thermo Fisher Scientific14025092
IMDM 培养基Thermo Fisher Scientific12440053
IX73 倒置显微镜OlympusIX73P2F倒置荧光显微镜
Lipofectamine 2000 转染试剂Thermo Fisher Scientific11-668-019
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
Medium 199，Earle's 盐Thermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS 分离器及起始试剂盒Miltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV 注射器滤器，0.45 µm，PVDF，33 mm，γ射线灭菌Millipore SigmaSLHV033RB
MM589由密歇根大学Shaomeng Wang’s实验室提供
Opti-MEM I 减血清培养基Thermo Fisher Scientific31-985-070
PBS，pH 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E（Plat-E）逆转录病毒包装细胞系Cell BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
聚乙二醇Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Polybrene 感染/转染试剂Millipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143–5MG
嘌呤霉素二盐酸盐Thermo Fisher ScientificA1113803
重组人胰岛素样生长因子-IPeprotech100-11
RPMI 1640 培养基Thermo Fisher Scientific11875093
ST 16 离心机系列Thermo Fisher Scientific75-004-381
无菌细胞筛Thermo Fisher Scientific22-363-54740 µm 筛网
表面处理组织培养皿Thermo Fisher ScientificFB012921
TE 缓冲液Thermo Fisher Scientific12090015
台盼蓝溶液Millipore SigmaT8154
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Thermo Fisher Scientific25300054
涡旋混合器Thermo Fisher Scientific02215365

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