唾液腺已被提议作为基因治疗的组织靶向部位，尤其是在基因转移疫苗接种领域。我们利用逆行腮腺输注在非人灵长类动物模型中展示了基因递送。
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本文内容
摘要
摘要
唾液腺是基因治疗的一个理想组织靶点，已有颇具前景的研究成果推动其进入人体试验阶段。唾液腺本身具有将蛋白质分泌到血液中的能力，且易于接近，因此可能是通过基因转移实现替代性激素生成或疫苗接种的优越组织位点。建议的基因递送方法包括经皮注射和通过唾液腺导管逆行灌注。本文展示了如何在非人灵长类动物中实施逆行性唾液腺灌注（RSGI）。我们描述了关键的解剖学标志，包括腮腺乳头的识别，利用基本牙科工具、聚乙烯导管和氰基丙烯酸酯对腮腺管进行无创性插管与封闭的方法，以及适当的灌注速率。尽管这是创伤最小的递送方法，但该方法仍受限于可递送体积（<0.5 mL）以及对导管和腺体造成损伤的潜在风险。我们通过荧光透视成像证明灌注液可完全递送至腺体内，并进一步通过免疫组织化学染色展示典型载体的转导及目的基因的表达情况。
引言
尽管唾液腺以其外分泌唾液的功能而广为人知，但研究人员早已认识到它们能够将蛋白质直接分泌到血液中1，这使其成为系统性基因治疗（如激素替代或抗体生产）的潜在靶器官。事实上，与其他组织靶点相比，唾液腺具有多项优势：具备天然的蛋白质分泌能力（这是肌肉组织所不具备的特性）、具有较厚的包膜可限制载体扩散、组织分化良好，有利于非整合型载体的稳定表达。此外，若发生严重不良事件，唾液腺并非生命维持所必需，可通过手术切除。虽然这一点并不直观，但腮腺可通过其主要排泄管——腮腺管（Stensen's Duct）从口腔内便捷地进入2。
鉴于唾液腺组织在基因治疗中的优势，越来越多的研究开始关注这一组织靶点。目前，已在啮齿类动物、犬类和非人灵长类动物模型中开展了大量研究，至少一项针对人类的临床试验正在进行中3,4,5。为了进一步探索并开发该组织靶点在基因治疗中的应用潜力，还需开展更多非人灵长类动物研究。本文介绍了一种通过腮腺管（Stensen's Duct）进入腮腺，以在非人灵长类动物模型中递送载体基因进行转导的方法。为了直观显示灌注液的递送过程以及导管进入腺体时的解剖结构，采用了放射性造影剂进行透视成像。为了验证载体成功转导，使用了腺病毒血清型5（Ad5）携带的egfp基因。Ad5是一种已被充分研究的载体，能够有效转导唾液腺组织。尽管其免疫原性过高，不适合最终的临床应用，但本示范性研究仍选择Ad5载体，以确保高效的基因转导。检测增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达是一种已被广泛描述的方法，可用于验证载体基因在转导后是否成功完成转录与翻译，本研究亦采用此方法进行验证。
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方案
所有实验操作均在维克森林医学院克拉克森动物实验校区进行。实验的伦理考量及具体操作细节已咨询机构动物护理与使用委员会（IACUC），并提交审查。维克森林大学IACUC已批准本研究方案，所有操作均在IACUC批准的方案编号A17-147下进行。
1. 准备注射装置
- 使用剪刀将10号聚乙烯管（PET10）剪成25 cm长的段。
- 用黑色记号笔在PET10一端的1 cm和2 cm处做标记。
- 用1 mL（结核菌素）注射器预先吸取0.5 mL的Ad5-EGFP溶液（109 病毒颗粒/mL）。
- 将PET10管未标记的一端套在连接注射器的29–31 G针头上。通常在放大条件下操作更为方便。
- 将溶液注入PET10管中，直至管内完全充满（自由端可见液滴）。
- 穿戴全套标准个人防护装备（PPE），包括 手术刷手服、长袖防护 gown、不透性手套、外科口罩、面部防护罩、头帽和鞋套。
2. 动物准备
注意：视频演示中使用了食蟹猴。其他非人灵长类动物及人类的解剖结构与此非常相似，因此该方案应可适用于其他物种。
- 在操作前15分钟，皮下注射0.05 mg/kg的阿托品，以减少唾液分泌，并优化灌注液的分布和保留。
- 使用5 mL注射器进行肌内注射氯胺酮/咪达唑仑（氯胺酮10-15 mg/kg，咪达唑仑0.01-0.05 mg/kg）实施麻醉。当动物失去意识且对刺激无反应时，表明麻醉效果适当。
3. 实施操作步骤
- 使用口腔拉钩撑开口腔。
- 将牵开器一端的橡胶垫置于上齿后方对侧口腔的硬腭上，另一端的橡胶垫置于与上颌牵开器同侧的下颌犬齿处。轻柔地利用牵开器的弹簧作用扩张并张开口腔。
- 识别位于上第二磨牙附近后侧颊部的腮腺乳头，即腮腺管（Stensen管）开口处nd 摩尔。使用牙科放大镜进行放大观察效果最佳。
- 用锥形扩张器的尖端轻柔地扩张腮腺乳头。最好将扩张器尖端插入乳头的中心或开口处，然后轻轻前后旋转。通过约20至30秒的轻柔旋转，使尖端缓慢进入乳头并逐步扩张。
- 将PET10导管插入扩张的腮腺乳头。最佳操作方法是用镊子夹住PET10导管有标记的一端，位置距导管远端约0.5 cm，然后轻柔地将导管尖端插入扩张的乳头。
- 轻轻推进导管，通常可借助轻微的旋转动作以帮助导管滑入，随后将镊子重新调整至较前一次夹持位置近端0.5 cm处。重复此操作，直至导管上的2 cm标记到达腮腺乳头。
- 在乳头周围及插入的导管周围的面颊处涂抹氰基丙烯酸酯，并等待其干燥（未记录具体用量，以封住腮腺管乳头开口为宜）。通常干燥时间不到一分钟，有助于封闭腮腺乳头，减少灌注液反流入口腔。
- 在5分钟内以100 µL/min的速度缓慢推注注射器内容物。此缓慢输注速率可最大限度降低因管腔内压力突然升高导致的导管损伤风险。
- 输注完成后，至少保留PET10导管5分钟。保持导管密封，使灌注液在腮腺内停留。
- 用轻柔的牵引力移除PET10。氰基丙烯酸酯将随导管一同被拉出。
- 在另一侧重复步骤 3.2 至 3.8。
- 双侧腮腺灌注完成且取出双侧 PET10 管后，缓慢松开口腔拉钩。
注意：双侧操作的整个过程应少于30分钟。
4. 术后护理
- 输注完成后拔除腮腺管导管，观察动物直至麻醉作用消退（通常在术后20-30分钟内）。
- 待动物完全清醒后给予饮水，随后喂食，并恢复常规护理。
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结果
成功操作、转导与转录
图1 显示位于第2颗牙齿附近的腮腺乳头nd 上颌后部颊侧的磨牙。图像还显示了口腔支具的正确放置位置，一端橡胶头位于硬腭，另一端橡胶头位于同侧犬齿。 图2 显示在PET10导管2 cm标记处成功插管腮腺乳头后的图像。 图3 显示在注入造影剂时的透视图像，可见造影剂经由腮腺管（Stensen's Duct）分支进入腮腺。该透视图仅用于展示灌注液的解剖路径与分布情况。在进行载体递送操作时，无需使用透视成像。 图4 组织病理学显示EGFP免疫染色呈红色。导管细胞和腺泡细胞均呈红色染色，表明两种细胞类型均成功实现了转导与转录。综上所述，这四幅图展示了合适的RSGI结果，可清晰观察到解剖结构以及Ad5载体介导的EGFP转导情况。
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讨论
本文介绍了一种通过腮腺管（Stensen's Duct）逆行灌注至腮腺的实验方案。所述方法可为研究人员探索唾液腺组织作为基因治疗及其他应用靶位点的可行性提供参考。
确保该操作成功的关键步骤有多个。首先，所有操作步骤均应轻柔进行。用力牵拉口腔可能导致下颌关节半脱位。用力插管腮腺乳头或将溶液快速注入腮腺管可能引起导管急性撕裂或慢性导管狭窄。
其次，确保已给予麻醉且麻醉效果已生效。若未进行充分麻醉，后续所有操作均难以顺利实施，且动物和操作人员受伤的风险将显著增加。我们选择采用氯胺酮和咪达唑仑进行肌内注射麻醉，这是非人灵长类动物研究中的标准麻醉方案6。我们认为，使用阿托品对于减少手术过程中的唾液分泌至关重要，有助于提高解剖结构的可视性，并在转导前减少灌注液的流失7,8。
一个常具挑战性的步骤是将PET10导管初始插入...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Cagney Gentry先生在拍摄该操作过程中的音视频技术支持。我们还要感谢Hefner退伍军人事务医疗中心在本项目研究过程中提供的学术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 500 µL U100 注射器，配 30 号针头 | Becton Dickinson | 328466 | 固定针头设计，减少浪费 |
| 粘合剂（例如 Ethicon Dermabond） | Various | 氰基丙烯酸酯粘合剂，用于在灌注期间封闭导管并固定管路 | |
| 阿托品注射液 | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | 阿托品注射液 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine 胰岛素注射器 30G | Walmart | N/A | 有 0.5 mL 和 1.0 mL 两种规格 |
| 氰基丙烯酸酯（医用胶） | Ethicon | DNX12 | Dermabond 外用皮肤粘合剂 |
| 带光源的牙科放大镜 | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | 用于增强对腮腺管乳头的可视化观察 |
| 婴儿泪道扩张器 | Surgipro | SPOI-137 | |
| 氯胺酮注射液 | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset 注射液 100 mg/mL |
| 泪道扩张器 | Surgipro | SPOI-132 | 用于扩张腮腺管 |
| 咪达唑仑注射液 | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | 咪达唑仑注射液 5 mg/mL |
| 剪刀 | Amazon (DDP) | N/A | 用于剪切 PET10 管 |
| 聚乙烯管（PE-10） | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | 连接 30G 注射器并插入导管的管路 |
| 棉签 | Walmart | N/A | 用于在脸颊上涂抹氰基丙烯酸酯 |
| 10 号聚乙烯管（PET 10） | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | 低密度聚乙烯管 |
| 小型动物口腔撑开器 | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | 用于保持动物口腔张开 |
| 镊子 | Amazon (DDP) | N/A | 用于将 PET10 管插入腮腺管 |
| 氯化锌 | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | 包含在质粒 DNA 灌注液中 |
参考文献
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
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- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
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重印与许可
