本方案描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的瞬时增强子报告基因检测方法。该检测可用于诱导由增强子驱动的基因表达 体内 在小鼠大脑中。
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摘要
摘要
增强子是多种转录因子的结合平台，可驱动组织和细胞类型特异性基因的特异性表达模式。多种评估非编码DNA及不同染色质状态的方法已被证明在预测基因组中增强子序列的存在方面具有实用价值，但验证这些序列的活性及其发挥作用的器官和发育阶段仍是一个劳动密集型过程。腺相关病毒（AAV）载体的最新进展使得外源基因能够广泛递送至小鼠组织，从而实现了 体内 无需转基因动物即可进行增强子活性检测。本实验方案展示了如何利用报告基因载体，在最小启动子（其本身不足以驱动显著表达）控制下表达EGFP，以研究候选增强子序列在小鼠脑中的活性模式。将包装为AAV的报告基因载体递送至小鼠脑内，孵育1–4周后处死动物，制备脑切片并在显微镜下观察。在增强子足以启动基因表达的细胞中可检测到EGFP信号，从而精确定位该增强子在脑内活跃的区域及其发育阶段。结合标准克隆技术、低成本AAV包装方法，以及不断拓展的AAV血清型和递送手段 体内 递送与标准成像读出使得该方法可用于研究脑内基因表达的调控机制。
引言
增强子是一类基因组顺式调控元件，可作为转录因子的结合位点，并以时空特异性的方式驱动靶基因的表达1,2。它们在不同细胞类型、组织以及发育阶段中具有差异性活性，并且可能是与疾病风险相关的基因组变异的作用靶点3,4。因此，深入理解增强子功能的动态变化，对于基因组学领域中转化医学和基础科学研究的进展至关重要。in silico 对增强子活性的预测可为增强子功能能力的假设生成提供宝贵的资源5,6。然而，此类预测的增强子活性通常需要进一步的验证和深入分析，才能全面理解其功能活性。增强子报告基因检测已被证明在从细胞到动物的多种系统中均具有重要价值7,8,9。为了在灵活且经济高效的瞬时in vivo 条件下拓展此类研究，本实验方案描述了利用in vivo 腺相关病毒（AAV）介导的方法，检测候选增强子序列在新生小鼠脑中驱动异位报告基因表达的能力。该方法体系适用于....
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方案
本方案已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（方案编号 #22339）以及加州大学戴维斯分校机构生物安全委员会（BUA-R1903）的批准。本方案已在出生后第0至1天的雄性和雌性C57BL/6J小鼠上进行过测试。
1. 将增强子候选序列克隆至 AAV 载体质粒中。
注意：此处提供了代表性实验方案，但克隆策略具有高度灵活性。
- 选择或设计报告基因载体。此处，将增强子候选序列插入到EGFP报告基因的3'非翻译区（UTR），该报告基因由Hsp68最小启动子驱动表达。
注意：许多适用于本实验的MPRA质粒载体已提交至Addgene41，可供研究使用。 - 设计用于扩增目标序列的PCR引物。在引物的5'端添加适用于Gibson克隆的同源臂（约35 bp，对应于插入位点上游的序列，正向引物对应顶链，反向引物对应底链）。
注意：确保引物的基本序列长度约为18-24 bp，GC含量约为50%-60%，熔解温度约为57-59 °C。 - 使用设计好的引物对DNA样本进行PCR扩增。
- 按照表1中的说明，在0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系。
- 将PCR反应体系置于热循环仪中，按照
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结果
利用这些方法，可获得与精神疾病风险相关的基因第三内含子中的915 bp序列 CACNA1C19,49,50 在出生后小鼠脑组织中检测了该序列的增强子活性。该序列是在一项针对345个以精神疾病和神经系统疾病风险SNP为中心的候选增强子序列的MPRA研究中发现的。12 以及表征实验在此作为一般示例进行描述。在出生后第0天（P0），将包装为自互补载体的AAV9构建体注射至C57BL/6小鼠体内51 在Hsp68最小启动子调控下含有EGFP及单个候选增强子序列（图3A）。另外一些小鼠被注射了含有阴性对照序列的构建体，该序列预计不具有调控活性（图3B）。这些构建体的病毒滴度已标准化为 6.85 x 1010 v.......
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讨论
本方案 描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的方法，用于在出生后小鼠脑中实现由增强子驱动的转基因表达。在此通用方案中，将候选增强子、最小启动子、报告基因以及可选的条形码序列克隆至AAV质粒骨架中。这些实验可针对单个候选增强子序列进行，也可并行分析多个序列。将质粒包装为rAAV后递送至出生后小鼠脑内。在允许病毒转导的一段时间后，收集小鼠脑组织并检测报告基因的表达情况。实验中同时包含一种组成型表达的报告病毒（CAG-mRuby3）作为注射对照。通过该检测方法，可证明增强子元件能够在小鼠脑内驱动EGFP的转录，从而展示其在体内的增强子活性 in vivo。
该实验的故障排除与优化主要涉及病毒滴度、注射技术以及转导时间窗口。不同的病毒滴度会对转导细胞的密度产生显著影响。尽管大多数研究可能更倾向于较高的转导效率，但最佳转导水平在很大程度上取决于实验目的。颅内注射可在局部产生较高密度的转导细胞，但转导区域通常较为局限，尽管感染扩散范围可能受病毒血清型和动物年龄的影响52。眶后静脉注射可能使转导细胞在全脑范围内的分布.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
测序工作由加州大学戴维斯分校DNA技术核心实验室完成。我们感谢加州大学戴维斯分校Lin Tian实验室在rAAV包装方面的培训，以及慷慨赠送AAV辅助病毒和rep/cap质粒。本研究得到美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所R35GM119831项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x 柠檬酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
| 5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: 定制设计 | 用于转化后验证克隆的正向引物。这些引物针对实验中所用载体特异性设计。 |
| 5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: 定制设计 | 用于转化后验证克隆的反向引物。这些引物针对实验中所用载体特异性设计。 |
| 琼脂糖 | VWR | VWRVN605-500G | |
| 吸液管组件 | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | 用于口控递送重组腺相关病毒（rAAV） |
| 细菌培养用培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| 羧苄青霉素 | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
| 鸡IgY抗GFP抗体 | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM900 | 图像采集使用的是LSM800型号，但Zeiss近年来已推出LSM900型号以取代LSM800。 |
| 15 mL锥形离心管 | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 冷冻模具 | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | 该模具适用于P28小鼠脑组织。其他尺寸可能更适合更大或更小的组织样本。 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| 解剖剪刀，4.5" | VWR | 82027-578 | |
| 驴抗鸡AlexaFluor-488抗体 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
| 2.0 mL Eppendorf微量离心管 | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
| 14 mL Falcon圆底管 | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
| 快绿染料 | Grainger | F0099-1G | |
| 精细细节画笔套装 | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| 玻璃毛细管 | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
| HiSpeed 质粒大提试剂盒 | QIAGEN | 12663 | 商业化质粒大提纯试剂盒 |
| HyClone HyPure分子生物学级水 | VWR | SH30538.03 | |
| 带12"软管和25G针头的静脉输液蝶形套件 | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | 无尘擦拭纸 |
| LB琼脂 | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | 用于选择性培养基的LB琼脂预混粉 |
| McPherson Vannas虹膜剪 | Integra LifeSciences | 360-215 | |
| 矿物油 | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
| NEB Stable 感受态大肠杆菌 | NEB | C3040I | |
| NucleoSpin凝胶与PCR产物纯化试剂盒 | Takara | 740609.5 | 用于酶促反应纯化和凝胶回收的试剂盒 |
| OCT包埋介质 | VWR | 25608-930 | |
| 轨道摇床 | Cole Parmer | 60-100 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| 0.2 mL PCR排管 | VWR | 490003-692 | |
| 蠕动泵 | Gilson | F155005 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Phusion Hot Start II 高保真DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
| 脱脂奶粉 | Sunny Select | ||
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| rCutSmart缓冲液 | NEB | B6004S | PacI、AscI和XmaI限制性酶切缓冲液 |
| 限制性内切酶：AscI | NEB | R0558L | |
| 限制性内切酶：PacI | NEB | R0547L | |
| 限制性内切酶：XmaI | NEB | R0180L | |
| SOC扩增培养基 | NEB | B0920S | 转化后的恢复培养基 |
| 蔗糖（RNase/DNase-free） | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
| TAE缓冲液 | Apex | 20-194 | |
| 转移软管 | Gilson | F1179941 | 用于蠕动泵 |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Wizard Plus SV质粒小提DNA纯化系统 | Thermo Fisher Scientific | A1460 | 质粒小提试剂盒 |
参考文献
- Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
- Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell.
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重印与许可
