基于增强子的表达构建体在小鼠 大脑中的 AAV部署

Summary

该协议描述了一种新型基于rAAV的瞬时增强子 - 报告基因测定。该测定可用于在小鼠 大脑中诱导 增强子驱动的体内表达。

Abstract

增强子是多种转录因子的结合平台，可驱动组织和细胞类型特异性基因的特定表达模式。评估非编码DNA和各种染色质状态的多种方法已被证明可用于预测基因组中增强子序列的存在，但验证这些序列的活性并找到它们活跃的器官和发育阶段是一个劳动密集型过程。腺相关病毒（AAV）载体的最新进展使转基因能够广泛递送到小鼠组织，从而能够在不需要转基因动物的情况下进行 体内 增强子测试。该协议显示了在最小启动子的控制下表达EGFP的报告构建体如何用于研究小鼠大脑中候选增强子序列的活动模式，该启动子本身不会驱动显着表达。将AAV包装的报告构建体输送到小鼠大脑并孵育1-4周，之后处死动物，并在显微镜下观察脑切片。EGFP出现在测试增强子足以启动基因表达的细胞中，确定增强子在大脑中活跃的位置和发育阶段。标准的克隆方法、低成本的AAV包装以及扩展的AAV血清型和 体内 递送和标准成像读数的方法使其成为研究大脑中基因表达如何调节的可访问方法。

Introduction

增强子是作为转录因子结合位点的基因组顺式调控元件，可以以时空特异性的方式驱动靶基因的表达^1，2。它们在不同的细胞类型、组织和发育阶段中具有差异活性，并且可以是疾病风险相关基因组变异的底物^3，4。因此，了解增强子功能动态的需求对于基因组学中转化和基础科学应用的进展至关重要。在计算机中，增强子活性的预测可以作为产生^{增强子能力}假设的极好资源5^，6。这种预测的增强子活性可能需要额外的验证和询问，以充分了解功能活性。增强子报告基因测定已被证明在从细胞到动物的各种系统中具有此目的的价值⁷，^8，9。为了在灵活且具有成本效益的瞬时体内环境中扩展这些研究，该协议描述了使用基于体内AAV的方法来测试推定的增强子序列，以了解它们在出生后小鼠大脑中驱动异位报告基因表达的能力。这一系列方法可用于询问单个候选序列或平行文库筛选，并且与基础和转化研究相关。

Protocol

该协议已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（协议#22339）和加州大学戴维斯分校机构生物安全委员会（BUA-R1903）的批准。该协议已在出生后第0-1天在两性的C57BL / 6J小鼠上进行了测试。

1.将增强子候选序列克隆到AAV载体质粒中。

注意:给出了代表性的方案，但克隆策略具有高度的灵活性。

1. 选择或设计报告器构造。在这里，增强子候选者入EGFP报告基因的3'非翻译区（UTR），其在Hsp68最小启动子的控制下表达。
   注意:许多适用于该测定的MPRA质粒构建体已沉积到Addgene⁴¹ 中，可用于研究用途。
2. 设计PCR引物以扩增目标序列。在引物的5'末端加入适当的同源臂以进行Gibson克隆（~35 bp对应于插入位置上游的序列5'，前向引物的上链和反向引物的底链）。
   注意:确保碱基引物序列长度为~18-24 bp，GC含量为~50%-60%，熔解温度约为57-59°C。
3. 使用设计的引物从DNA样品中进行PCR。
   1. 如 表1所述，将PCR反应混合物组装在0.2 mL PCR管中。
   2. 将PCR反应混合物放在热循环仪上，并根据 表1中提到的程序进行循环。....

Results

使用这些方法，测试了基因CACNA1C¹⁹，^49，50的精神风险相关第三内含子中的915 bp序列在出生后小鼠大脑中的增强子活性。该序列是在以精神和神经风险^{SNPs 12}为中心的345个候选增强子序列的MPRA中发现的，这里将表征实验描述为一般示例。在Hsp68最小启动子和单个候选增强子序列的控制下，在P0上注射AAV9构建体，包装为含有EGFP的自互补载体⁵¹的AAV9构建体（图3A）。向额外的小鼠注射含有阴性对照序列的构建体，该结构被预测为没有调节活性（图3B）。这些构建体的病毒滴度归一化为6.85 x 10¹⁰ vg/mL。所有注射的小鼠在组成型CAG启动子的控制下，与含有mRuby3的AAV9.......

Discussion

该协议描述了一种基于rAAV的方法，用于在出生后小鼠大脑中部署增强子驱动的转基因。在这个通用的方案中，将候选增强子、最小启动子、报告基因和可选的条形码序列克隆到 AAV 质粒骨架中。这些实验可以用单个候选增强子序列或多个序列并行完成。质粒被包装成rAAV并输送到出生后的小鼠大脑。在一段时间允许病毒转导后，收集大脑并进行成像以进行报告基因表达。包括一种组成型表达的报告病毒（CAG-mRuby3）作为注射对照。使用该测定，增强子元件被证明可以驱动小鼠大脑中EGFP的转录，从而证明增强子在 体内的活性。

该测定故障排除和优化的主要目标包括病毒滴度、注射技术和转导时间框架。不同的病毒滴度对转导细胞的密度有很强的影响。虽然对于大多数研究来说，更高的转导效率可能更可取，但最佳转导水平高度依赖于实验目标。颅内注射提供高密度的转导细胞，但在注射部位可能更集中，尽管感染的传播可能取决于病毒血清型和动物的年龄⁵²。眶后注射可能显示转导细胞在整个大脑中的分布更均匀，但不太可能产生任何高度感染的区域。尾静脉注射可以更有效地转导大脑以外的其他.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x 柠檬酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated	DNA Technologies	N/A：定制设计的	正向引物，用于在转化后验证克隆。这些引物对所使用的载体具有特异性，并且是针对我们实验中使用的特定载体设计的。
5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated	DNA Technologies	N/A：定制设计的	反向引物，用于在转化后验证克隆。这些引物对所使用的载体具有特异性，并且是针对我们实验中使用的特定载体设计的。
琼脂糖	VWR	VWRVN605-500G
吸气管组件	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	，用于 rAAV
细菌培养皿	Thermo Fisher Scientific	08-757-100D
羧苄青霉素	Sigma-Aldrich	C1389-5G
鸡 IgY 抗 GFP	Thermo Fisher Scientific	A10262
共聚焦显微镜	蔡司	LSM900	图像是在 LSM800 型号上拍摄的，但蔡司近年来推出了 LSM900 型号以取代 LSM800。
锥形离心管 15 mL	Thermo Fisher Scientific	12-565-269
Cryomolds	Thermo Fisher Scientific	NC9806558	这些模具适用于 P28 小鼠大脑。其他尺寸可能更适合更大或更小的组织。
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
解剖剪刀，4.5 英寸	VWR	82027-578
驴抗鸡 AlexaFlour-488	Jackson ImmunoResearch	703-545-155
Dulbecco's PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	MT21031CV
Eppendorf 微量离心管 2.0 mL	Thermo Fisher Scientific
Falcon 圆底管 14 mL	Thermo Fisher Scientific	352059
Fast Green 染料	Grainger	F0099-1G
精细细节油漆刷套装	Artbrush Tower	B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611S
玻璃毛细管	Drummond Scientific Company	5-000-2005
HiSpeed 质粒 Maxi 试剂盒	QIAGEN	12663	商业质粒 Maxi 制备试剂盒
HyClone HyPure 分子生物学级水	VWR	SH30538.03
IV 蝶形输液套件，带 12 英寸管路和 25G 针头	Fisher Scientific	26708
Kimwipes	Kimberly Clark	34155	无绒湿巾
LB 琼脂	Thermo Fisher Scientific	BP1425-500	LB 琼脂预混液，用于选择性培养基
McPherson Vannas 鸢尾花剪刀	Integra LifeSciences	360-215
矿物油	Sigma Life Science	69794-500ML
NEB 稳定感受态大肠杆菌	NEB	C3040I
NucleoSpin 凝胶和 PCR 纯化试剂盒	Takara	740609.5	酶促反应试剂盒净化和凝胶萃取
OCT 培养基	VWR	25608-930
轨道摇床	Cole Parmer	60-100
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127-500G
PCR 试管 0.2 mL	VWR	490003-692
蠕动泵	Gilson	F155005
盐缓冲盐水 （PBS） 10x	Thermo Fisher Scientific	70011044
Phusion 热启动 II 高保真 DNA 聚合酶	Thermo Fisher Scientific	F549L
奶粉	Sunny Select
ProLong Gold 抗淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36934
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28106
rCutSmart缓冲液	NEB	B6004S	PacI、AscI 和 XmaI 限制性内切酶的限制性消化缓冲液
：AscI	NEB	R0558L
限制性内切酶：PacI	NEB	R0547L
限制性内切酶：XmaI	NEB	R0180L
SOC 生长培养基	NEB	B0920S	转化后回收培养基
蔗糖 （无RNase/DNase）	Millipore Sigma	033522.5KG
TAE缓冲液	Apex	20-194
转移管	Gilson	F1179941	用于蠕动泵
Triton X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Wizard Plus SV 小量制备DNA 纯化系统	Thermo Fisher Scientific	A1460	质粒小量制备试剂盒