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方法文章

基于增强子的表达载体的AAV递送 在体 小鼠脑中

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DOI：

10.3791/62650

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2022年3月31日

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

本文内容

摘要

本方案描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的瞬时增强子报告基因检测方法。该检测可用于诱导由增强子驱动的基因表达 体内 在小鼠大脑中。

摘要

增强子是多种转录因子的结合平台，可驱动组织和细胞类型特异性基因的特异性表达模式。多种评估非编码DNA及不同染色质状态的方法已被证明在预测基因组中增强子序列的存在方面具有实用价值，但验证这些序列的活性及其发挥作用的器官和发育阶段仍是一个劳动密集型过程。腺相关病毒（AAV）载体的最新进展使得外源基因能够广泛递送至小鼠组织，从而实现了 体内 无需转基因动物即可进行增强子活性检测。本实验方案展示了如何利用报告基因载体，在最小启动子（其本身不足以驱动显著表达）控制下表达EGFP，以研究候选增强子序列在小鼠脑中的活性模式。将包装为AAV的报告基因载体递送至小鼠脑内，孵育1–4周后处死动物，制备脑切片并在显微镜下观察。在增强子足以启动基因表达的细胞中可检测到EGFP信号，从而精确定位该增强子在脑内活跃的区域及其发育阶段。结合标准克隆技术、低成本AAV包装方法，以及不断拓展的AAV血清型和递送手段 体内 递送与标准成像读出使得该方法可用于研究脑内基因表达的调控机制。

引言

增强子是一类基因组顺式调控元件，可作为转录因子的结合位点，并以时空特异性的方式驱动靶基因的表达1,2。它们在不同细胞类型、组织以及发育阶段中具有差异性活性，并且可能是与疾病风险相关的基因组变异的作用靶点3,4。因此，深入理解增强子功能的动态变化，对于基因组学领域中转化医学和基础科学研究的进展至关重要。in silico 对增强子活性的预测可为增强子功能能力的假设生成提供宝贵的资源5,6。然而，此类预测的增强子活性通常需要进一步的验证和深入分析，才能全面理解其功能活性。增强子报告基因检测已被证明在从细胞到动物的多种系统中均具有重要价值7,8,9。为了在灵活且经济高效的瞬时in vivo 条件下拓展此类研究，本实验方案描述了利用in vivo 腺相关病毒（AAV）介导的方法，检测候选增强子序列在新生小鼠脑中驱动异位报告基因表达的能力。该方法体系适用于单个候选序列的功能分析，也可用于并行文库筛选，对基础研究和转化研究均具有重要意义。

该方法将一个假定的增强子候选DNA序列与报告基因（此处为EGFP）组合于同一质粒中，二者由一个最小启动子调控，该启动子单独存在时不足以驱动显著表达。该质粒被包装为重组腺相关病毒（rAAV），并注射至动物模型体内。尽管此处应用针对脑组织，但利用不同血清型的rAAV可实现多种组织类型的感染，因此该策略可拓展至其他系统。 关键词：增强子候选序列，报告基因，EGFP，最小启动子，重组腺相关病毒，rAAV，动物模型，脑组织10一段时间后，可采集脑组织并检测报告基因的表达水平。与对照组相比，若表达显著增强，则表明所测试的候选序列具有调控能力 "增强" 基因的表达（图1）。这种简单设计为测试序列的增强子活性提供了一种简便且清晰的方法 体内 在大脑中。

除了检测某序列的增强子功能外，该方法还可与其他技术联用，以确定不同细胞类型中增强子的活性。在基于序列分析的差异性增强子活性研究中，可在进行DNA和RNA测序前，根据细胞类型特异性标记对细胞进行分选，从而帮助研究人员判断不同细胞类型是否表现出差异性的增强子活性，如Gisselbrecht等所述。11在基于成像的方法中，使用细胞类型特异性标记物进行共标记染色可实现对 表达增强子驱动荧光的细胞是否也表现出目标细胞类型的标记物12,13,14,15,16增强子报告基因检测能够直接验证与风险相关的等位基因变异对增强子功能的影响。全基因组关联研究（GWAS）所鉴定的绝大多数风险位点位于基因组的非编码区域。17功能注释研究表明，这些风险位点中有很大一部分可能作为增强子发挥作用18,19,20. MPRA 技术的应用 体内 可用于检测这些与风险相关的变异在大脑中的增强子活性12,21最后，在不同时间点进行递送和采集可以揭示增强子在发育过程中活跃的具体阶段。

增强子-报告基因质粒的设计具有多样性，可根据实验目的进行定制。在增强子研究中，已有多种最小启动子可供选择，例如人β-珠蛋白最小启动子22和小鼠Hsp68最小启动子23。这些启动子本身仅能驱动较低水平的表达，除非与增强子元件结合才能被激活。相比之下，组成型启动子元件可驱动转基因的强表达，适用于阳性对照，或用于在高表达背景下检测增强子功能。常用的组成型启动子包括CAG（一种源自鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒早期增强子的杂合启动子）24以及人EF1α启动子25。由于已知增强子可双向发挥作用26，因此增强子相对于最小启动子的方向和位置具有灵活性（图2A）。传统的增强子-报告基因检测通常将增强子置于启动子上游，在文库递送系统中，还在报告基因下游加入条形码序列，以便将测序读段与被测试的增强子相对应27。然而，增强子也可插入报告基因的开放阅读框内，并作为其自身的条形码序列，如STARR-seq方法中所采用的策略28。本文所述方案采用STARR-seq检测设计，将候选增强子序列插入报告基因的3'非翻译区（3' UTR）。尽管STARR-seq的构建方式在克隆操作上更为简便，但其机制相较于传统方法尚不明确，且可能在不同构建体之间引起RNA稳定性的差异。所描述的方法可通过克隆过程中的少量调整，轻松适配于STARR-seq或传统方向的构建方式，相关修改已在其他文献中有所描述27,29。

可采用不同的AAV递送方法，以进一步定制本技术，满足特定的实验目标（图2B）。本方案中进一步描述的直接颅内注射可将高浓度病毒直接递送至脑组织30。该方法在注射部位实现高转导效率，因此非常适合旨在最大化特定组织区域内转导细胞密度的实验。立体定位注射有助于在不同动物间标准化注射位点，从而实现可重复的局部转导。颅内注射在出生后早期动物中操作最为简便。作为替代方法，系统性注射可利用能够穿越血脑屏障的AAV血清型递送转基因31。尾静脉注射使病毒在全身循环，从而实现多个组织的广泛递送10。眶后注射是另一种系统性注射技术，将病毒注入眼后窦32。该方法为AAV从静脉系统进入脑组织提供了更直接的通路，相比注入更外周的血管，可在脑内实现更高浓度的转导细胞33。

该技术的另一个灵活之处在于其读出方法。总体而言，读出方法可分为基于报告基因和基于测序两类（图2C）。将荧光报告基因（如GFP）插入构建体的开放阅读框中，可在候选增强子驱动表达的任何转导细胞中表达荧光蛋白。免疫组织化学等标记与成像技术可实现信号放大。基于测序的读出方法则涉及从组织中收集的RNA中鉴定递送构建体的序列。通过定量最初递送的病毒DNA量，可比较表达的RNA与递送的DNA，从而确定待测增强子序列驱动转基因表达增强的能力，例如在大规模并行报告基因分析（MPRA）中的应用。MPRA显著拓展了这些技术的应用，可同时检测数千个候选增强子的活性，已在基因组学研究中被广泛描述12,27,34,35,36。通过批量而非单独进行候选增强子的克隆、包装、递送和测序步骤，可实现更高通量的筛选。

候选增强子的选择提供了另一种灵活性（图2D）。例如，该检测可用于鉴定特定基因的增强子，确定感兴趣非编码DNA区域的功能，或明确增强子在哪些特定细胞类型或发育阶段具有活性——这些目标在基础科学研究和疾病研究中均具有重要意义。通常，候选增强子的选择依赖于in silico对增强子活性的预测。常见的in silico预测包括针对提示可能为增强子的组蛋白修饰（如H3K27ac37）进行的ChIP-seq分析，以及染色质可及性图谱分析38。最后，一个日益增长的研究方向是对人工设计的增强子元件进行基于功能的筛选，从而推动对增强子序列如何决定其功能的研究39，并实现具有特定特性的增强子的设计40。

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方案

本方案已获得加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会（方案编号 #22339）以及加州大学戴维斯分校机构生物安全委员会（BUA-R1903）的批准。本方案已在出生后第0至1天的雄性和雌性C57BL/6J小鼠上进行过测试。

1. 将增强子候选序列克隆至 AAV 载体质粒中。

注意：此处提供了代表性实验方案，但克隆策略具有高度灵活性。

  1. 选择或设计报告基因载体。此处，将增强子候选序列插入到EGFP报告基因的3'非翻译区（UTR），该报告基因由Hsp68最小启动子驱动表达。
    注意：许多适用于本实验的MPRA质粒载体已提交至Addgene41，可供研究使用。
  2. 设计用于扩增目标序列的PCR引物。在引物的5'端添加适用于Gibson克隆的同源臂（约35 bp，对应于插入位点上游的序列，正向引物对应顶链，反向引物对应底链）。
    注意：确保引物的基本序列长度约为18-24 bp，GC含量约为50%-60%，熔解温度约为57-59 °C。
  3. 使用设计好的引物对DNA样本进行PCR扩增。
    1. 按照表1中的说明，在0.2 mL PCR管中配制PCR反应体系。
    2. 将PCR反应体系置于热循环仪中，按照表1中所述程序进行扩增。
    3. 取5 µL PCR产物，在0.7%-1%琼脂糖凝胶中以100 V电泳30-60分钟，验证PCR扩增结果，检查是否出现预期大小的条带。
    4. 使用商业化的酶反应纯化柱试剂盒对PCR产物进行纯化。最终洗脱液即为克隆插入片段。
  4. 进行限制性酶切，以在唯一克隆位点处线性化AAV载体，从而将增强子插入载体。
    1. 本实验所用增强子报告基因载体的3' UTR中的克隆位点由独特的PacI和AscI限制性酶切位点界定。根据以下参数（步骤1.4.2-1.4.4）对该位点进行酶切以线性化质粒。
    2. 根据所需克隆反应的数量，使用PacI和AscI酶切1-10 µg的载体DNA。按照制造商说明书，使用提供的缓冲液配制反应体系。
    3. 在37 °C孵育1-2小时，以完成载体DNA的酶切。（若在50 µL反应体系中酶切超过5 µg DNA，可能需要更长的孵育时间。）
    4. 孵育1-2小时后，于65 °C孵育20分钟以灭活酶活性。
    5. 使用0.7%-1%琼脂糖凝胶，以100 V电泳30-60分钟，分离限制性酶切片段。
    6. 切下线性化载体对应的条带，并使用商业化的凝胶回收试剂盒进行纯化。
  5. 进行Gibson克隆反应并转化
    1. 使用分光光度计测定纯化后的载体和克隆插入片段的浓度。
      注意：DNA在260 nm处有吸收峰，而污染物在230 nm和280 nm处有吸收峰。260/230和260/280比值较高（>1.8）表明DNA纯度较高。
    2. 在0.2 mL PCR管中配制Gibson克隆反应体系：5 µL 2x Gibson主混合液，0.02-0.5 pmol DNA片段（插入片段与载体的摩尔比为3:1，最佳DNA浓度需通过实验确定），并用无核酸酶水补足至10 µL总体积。
    3. 将Gibson反应体系置于热循环仪中，在50 °C孵育20分钟。
  6. 将重组缺陷型（recA-）感受态Escherichia coli (E. coli)进行转化。
    1. 将水浴锅预热至42 °C，并将市售的感受态细胞置于冰上融化。
      注意：此步骤可在步骤1.4之前进行，在准备和孵育Gibson反应的同时使细胞融化。
    2. 将30-50 µL细胞分装至2.0 mL微量离心管中。向一份样品中加入2 µL Gibson反应产物，并在管上标记对应的Gibson反应编号。将细胞置于冰上孵育30分钟。
      注意：使用5-10 ng未酶切的空载体作为阳性对照，用水作为阴性对照。
    3. 将细胞在42 °C水浴中热激30-45秒，立即放回冰上，恢复5分钟。
    4. 在冰上时，加入400-950 µL市售的复苏培养基。
      注意：本实验所用复苏培养基含有2%植物蛋白胨、0.5%酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4和20 mM葡萄糖。
    5. 冰上复苏后，将细胞在37 °C、250 RPM轻柔振荡条件下孵育30-60分钟，使其完全恢复。
    6. 在5,000 x g离心5分钟，收集菌体，弃去上清液400 µL，保留约50 µL菌液用于涂板。
    7. 涂布于选择性培养基上，37 °C过夜培养。
      注意：本实验所用选择性培养基含有1.0%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0%氯化钠、1-2%琼脂、96-97%水，以及浓度为100 µg/mL的羧苄青霉素。克隆病毒质粒时务必使用重组缺陷型细菌菌株，因为病毒的反向末端重复序列（ITRs）具有匹配序列，可能发生同源重组。然而，recA-菌株仍可能发生低水平的重组。本实验所用报告质粒为自互补AAV，其中一个ITR序列已被修改，不再与另一个ITR完全匹配。建议在30 °C培养细菌，以进一步减缓同源重组的发生速率。
  7. 验证克隆并回收质粒。
    1. 使用与载体结合并在插入位点两侧的正向和反向引物（材料表）配制PCR主混合液。将10 µL分装至0.2 mL PCR条形管中。
    2. 在14 mL圆底管中，每管加入5 mL含抗生素的选择性LB液体培养基，每管对应一个待检测的菌落及阴性对照。
    3. 使用无菌牙签或移液器吸头挑取单个菌落，并将其大致刮入一个PCR管底部。
    4. 当菌落已分散至PCR主混合液中后，将牙签或吸头投入其中一个LB分装管中，并在14 mL管上标记对应的Gibson反应编号和PCR管编号。
    5. 将菌落PCR反应置于热循环仪中，按照表2中所述程序进行扩增。
    6. 将用牙签或吸头接种的5 mL液体培养物置于设定为37 °C、180 RPM的摇床中孵育。
    7. 将菌落PCR产物在0.7%-1%琼脂糖凝胶中以100 V电泳30-60分钟，并在凝胶成像系统中观察条带。
    8. 丢弃未显示预期PCR条带的5 mL培养物。
    9. 对于每个成功整合的克隆，让5 mL培养物过夜生长，然后使用商业化试剂盒从4.5 mL培养物中提取质粒。保留0.5 mL液体培养物，加入甘油后保存于-80 °C作为甘油菌种。
    10. 使用Sanger测序42确认质粒中的转基因序列无不良突变。
    11. 在确认报告基因载体成功克隆后，使用保存的甘油菌种接种5 mL起始培养物，在30 °C、180 RPM摇床中培养8-16小时。
    12. 当培养液变浑浊后，将起始培养物按1,000倍稀释至250-300 mL新鲜选择性LB液体培养基中，在30 °C、180 RPM摇床中至少过夜培养。随后使用商业化的大提质粒试剂盒纯化质粒。
      注意：细菌在30 °C下的生长速度比37 °C慢，但这是在大规模培养时减缓自发重组速率的最佳温度。
    13. 使用步骤1.4.2-1.4.5进行XmaI酶切，以检测ITRs是否发生重组，仅将XmaI替换为PacI和AscI。在凝胶成像系统中观察条带。
      ​注意：含有两个ITRs的rAAV质粒经此酶切后在凝胶上应出现两条带：一条为rAAV基因组长度，另一条为质粒骨架其余部分的长度。若仅出现一条带，则表明ITRs已发生同源重组，该rAAV质粒将无法包装病毒颗粒。此处描述的rAAV质粒骨架设计为XmaI位点仅存在于ITRs中。若增强子候选插入片段中也含有XmaI位点，则需相应调整预期条带结果及分析方法。

2. 获取包装好的 rAAV。

  1. 使用包装好的 rAAV（专业制备或实验室自制）进行本研究中的实验。
    注意：rAAV 的包装有多种选择。rAAV 可由公司或大学核心设施进行专业包装，也可在实验室内部通过不同技术自行包装，这些技术在复杂程度和对专用设备的需求方面各不相同。43,44. 的 首要关注的是获得高质量的载体，并且其感染性滴度已得到高度准确的测定。本研究中所描述的不同实验采用了专业包装和实验室自制包装的重组腺相关病毒（rAAV）。

3. 向新生小鼠颅内注射rAAV包装的质粒。

  1. 制备用于递送的rAAV混合物。
    1. 如果目的是比较不同增强子报告病毒之间的表达模式，则通过稀释使所有待比较病毒的滴度相等，调整至与浓度最低的病毒一致。
    2. 将增强子报告病毒与组成型表达对照报告病毒按2:1或3:1的比例混合，并加入少量（终浓度0.06%）快绿染料。
      注意：快绿是一种广泛用于实验动物注射的染料，包括与 AAV 一起使用，以在操作过程中及操作后立即显示注射部位45,46,47,48. 尽管这是重要的质量控制步骤，但染料的添加可能会影响转导效果。在某些情况下，重新考虑是否使用注射染料可能对方案优化具有重要意义。组成型表达的对照病毒对于不同注射之间的比较至关重要。病毒注射在不同动物间的转导位置和范围可能存在差异。使用组成型对照可帮助排除转导失败的注射样本，并为病毒递送的变异提供标准化的参照依据。
    3. 用无菌的拉制玻璃移液管尖端轻轻刺破 μL 刻度毛细管制成的无菌拉制玻璃移液管的尖端 a 用70%乙醇浸泡消毒后彻底干燥的精细擦拭物进行擦拭。然后将拉制的玻璃移液管插入吸液装置组件中，该组件由一个压力施加装置连接一段15英寸长的橡胶管组成，橡胶管末端带有用于固定微毛细移液管的橡胶垫圈。
      注意： 该 "施加压力的装置" 可以使用注射器或吹管。如果使用注射器，则需要第二人通过注射器施加压力，而实验者一手操作移液管，另一手固定动物。如果使用吹管，实验者可更精确地控制动物和移液管的位置以及对注射器施加的压力，但需格外注意避免病毒污染。
    4. 通过吸液装置施加负压，将少量矿物油（约0.2–0.5 µL）吸入玻璃移液管中。
      注意：此步骤至关重要，可形成屏障，防止气溶胶化的病毒颗粒污染吸引器组件。
    5. 将制备好的吸液装置放置一旁，病毒置于冰上保存，直至准备注射。
  2. 将新生小鼠置于部分浸入冰中的干燥塑料培养皿内进行冷冻麻醉，直至足底回缩反射消失（约5分钟）。确保小鼠不与冰直接接触。
  3. 使用移液器组件的负压将病毒混合液吸入拉制的玻璃移液管中，直至弯月面超过2 µL刻度线。
  4. 将小鼠从低温舱中取出，放置于实验台面上。找到双侧注射位点，位于人字缝与前囟中点处，以及矢状缝与双眼之间中点处。用酒精棉片对两个区域进行消毒。
  5. 使用拉制的玻璃移液管刺穿新生小鼠颅骨，当针头进入脑部时，通过吸液装置轻轻施加正压。观察病毒混合液的液面弯月面，当移液管尖端到达侧脑室时，所施加压力的阻力会减小。注入1 µL病毒液，退出移液管，随后对另一侧侧脑室重复此操作。
  6. 将小鼠置于加热垫或加热舱中使其恢复。待小鼠清醒并恢复活动后，将其放回原饲养笼中。

4. 收集组织并进行免疫组织化学染色。

  1. 病毒转导后经过足够时间，对小鼠进行麻醉，并通过心脏灌注处死。
    注意：许多实验（包括此处展示的代表性结果）允许病毒转导时间为4周或更长。然而，自互补腺相关病毒（AAVs）可在转导后7天内即表现出强表达12。所需孵育时间可能需根据具体实验技术与目标进行优化。
    1. 准备一台带有静脉输液管路和25 G针头的蠕动泵。
    2. 配制1× PBS和4%多聚甲醛（PFA），并置于冰上。
    3. 将管路进液端放入冰浴的1× PBS中，设定流速（P7小鼠为2.5 mL/min，P28小鼠为3.5 mL/min），启动泵，使缓冲液完全流经管路并排除气泡。将针头暂放一旁，待灌注时使用。
    4. 在通风橱内，将少量异氟烷滴加至落珠罐底部的纸巾上。将先前注射过的小鼠置于纸巾上方的网格上，确保其不直接接触异氟烷。密封罐体以麻醉小鼠。等待约5分钟，打开罐体检查足底回缩反射。待动物失去意识后继续操作。
      注意：在整个灌注过程中，应通过鼻罩持续给予异氟烷，以防止动物恢复 意识。
    5. 使用手术剪打开小鼠腹腔和胸腔，移除肋骨，暴露心脏。
    6. 使用虹膜显微剪在小鼠右心房做一小切口，将静脉针插入左心室，并启动蠕动泵。
    7. 用冰浴的1× PBS灌注动物，直至右心房切口流出的血液变得清澈。清除组织中的血液非常重要，因为红细胞具有自发荧光，且血管可能干扰报告基因表达细胞的成像。
    8. 暂停蠕动泵，将进液管从PBS切换至4% PFA。重新启动泵，按1 mL/g体重进行灌注，成年小鼠约为25 mL。
      注意：应可观察到固定引起的震颤，小鼠身体应变得僵硬。
  2. 解剖并进行脑组织后固定。
    1. 使用手术剪将小鼠头部剪下。
    2. 使用小型手术剪从颅底开始，沿头部中线剪开皮肤及皮下组织，并向两侧剥离，暴露颅骨。
    3. 使用虹膜剪小心剪开颅骨后部，从枕骨大孔开始，沿矢状缝向上剪至嗅球区域。
    4. 将剪刀置于嗅球上方的颅骨处，做两个水平切口；在枕骨上也做类似的一对水平切口。水平切口与中线切口共同在颅骨顶部形成一对门板状骨瓣。
    5. 掀开骨瓣以完全暴露脑组织。使用镊子切断嗅球与颅骨的连接，并剪断颅神经，使脑组织完全脱离颅骨。
    6. 将脑组织放入含3–5 mL PBS配制的4% PFA的15 mL锥形管中，后固定6小时至过夜。切勿过度固定。
  3. 为冷冻切片准备脑组织。
    1. 将固定后的脑组织转移至新的15 mL锥形管中，加入12–14 mL PBS配制的30%蔗糖溶液进行脱水。4 °C孵育至脑组织沉入管底（2–3天）。
    2. 将固定并脱水后的脑组织浸入OCT包埋剂中，置于15 mm × 15 mm × 5 mm的冷冻模具内。加入OCT直至完全覆盖脑组织。
    3. 将冷冻模具置于干冰块上，使样本在OCT中冻结成固体块（约5分钟）。
      注意：OCT包埋块可在-80 °C保存数月甚至数年。
    4. 在冷冻模具上用标签注明样本名称及脑组织方向。
  4. 使用冷冻切片机获取冠状切面。
    1. 用铅笔在OCT包埋块上标记脑组织方向，并在冷冻切片机内将包埋块从模具中取出。
    2. 将OCT包埋块放置于切片台上，使脑组织的嗅球朝向切片刀，并用新鲜OCT将包埋块粘附于切片机样品台。
    3. 待包埋块冻结固定后，开始以50 µm厚度连续切片，后续操作参照步骤4.4.4–4.4.6。
    4. 不要使用防卷板。切片时会自然卷曲成紧密卷状，可能堆积在包埋块表面或落入收集盘中。
    5. 观察最初几次切片时包埋块的形状。进行垂直切割，使切面平整后再开始正式切片。如有需要，使用样品调节臂调整角度。
    6. 当嗅球可见时，密切注意切片形态。若两侧嗅球大小不一，说明切面与脑组织存在角度偏差，需使用样品调节臂校正脑组织相对于刀片的方向。
      注意：若切面正确，两侧嗅球上方的皮层应同时出现。
    7. 当嗅球区域已被切完且前端脑组织可见时，将切片厚度减至30–35 µm，并开始收集漂浮切片。后续脑组织切片操作请参照步骤4.4.8–4.4.13。
    8. 用刷子将之前切下的所有切片从包埋块和样品台刷入收集盘中，集中推至一侧并保持分离。若堆积过多，应及时清空收集盘。
    9. 向24孔板每孔加入1 mL PBS。每只脑组织对应标记一行。
    10. 连续切下6个冠状切片，用冷镊子取出并排列在冷冻切片机载物台上。重复此步骤2–3次，保持每组6片切片相互分离。
    11. 将000号画笔用PBS润湿，并在无绒纸巾或纸巾上轻蘸以去除多余液体。用画笔逐片轻柔拾取切片，放入24孔板对应孔中。
    12. 将每组6片切片中的1片分别放入24孔板一行中的6个孔内。此操作可确保每个孔中的切片代表脑组织切片区段的不同位置。
    13. 以每6片为一组继续切片，直至大脑皮层尾端被完全切完。
    14. 储存时，用封口膜密封24孔板，并于4 °C保存。
      注意：切片在4 °C下可稳定保存1–2个月。可使用含0.1%叠氮化钠的PBS溶液抑制细菌生长，延长切片保存期限。若需保存超过2个月，建议将切片置于冷冻保护液中，并于-20 °C冷冻保存以获得最佳效果。
  5. 进行免疫组织化学染色以放大报告基因信号。
    注意：除抗原修复步骤外，所有操作均应在旋转摇床上以轻柔至中等振荡（约100 RPM）进行。为保护对照报告基因（mRuby3）的天然荧光，所有步骤应尽可能避光操作。
    1. 按表3所述配制所需缓冲液。
    2. 准备新的24孔板，每只待染色脑组织对应一行。在第一列各孔中加入1 mL PBS。
    3. 使用000号画笔，将原始收集孔中的一孔切片轻柔转移至新24孔板的PBS中，快速漂洗以去除残留OCT包埋剂。
    4. 向下一孔加入1 mL ARB缓冲液，并将切片转移至该孔。在60 °C烘箱中孵育1小时。
    5. 让孔板在室温（RT）下冷却20分钟。
    6. 向下一孔加入1 mL PB缓冲液，并将切片转移至该孔。室温孵育20分钟。
    7. 向下一孔加入500 µL BB缓冲液，并将切片转移至该孔。室温孵育1小时。
    8. 向BB中加入2 mL WB，然后用移液器吸出约2 mL溶液弃去，留下稀释后的BB溶液。重复此操作，直至切片清晰可见。
    9. 用BB缓冲液稀释一抗（鸡IgY抗GFP，1:1000）。向下一孔加入350–500 µL一抗溶液，并将切片转移至该孔。用封口膜密封孔板，4 °C孵育过夜。
    10. 如前所述，用WB稀释BB缓冲液，直至切片清晰可见。
    11. 向下一孔加入1 mL WB，并将切片转移至该孔。室温孵育20分钟。
    12. 吸除约800–900 µL缓冲液并弃去。加入1 mL新鲜WB，孵育20分钟。重复更换1 mL WB共4次，总计5次洗涤，每次20分钟。
    13. 用BB缓冲液稀释二抗（驴抗鸡Alexa Fluor 488偶联抗体，1:500）。向新孔中加入350–500 µL二抗溶液。室温孵育45分钟至1小时。
      注意：此为第七孔，若同时处理超过2只脑组织的切片，此时需使用新的孔板。
    14. 如前所述稀释BB缓冲液，并将切片转移至含1 mL WB的新孔中。按前述方法洗涤3次，每次20分钟。
    15. 在PBS中配制DAPI工作液（终浓度0.04–0.8 µg/mL）。溶液需避光保存。
    16. 向下一孔加入1 mL DAPI溶液，并将切片转移至该孔。室温孵育约5分钟。
    17. 将切片转移回WB中，使用000号画笔轻柔地将其贴附于显微镜载玻片上。让载玻片自然风干。
    18. 使用适当的封片介质加盖盖玻片。在室温避光条件下静置过夜，使封片固化。

5. 对脑组织切片进行成像并分析增强子活性。

  1. 使用低倍率（5x）物镜拍摄跨越脑切片的荧光图像。
  2. 定位注射位点，并根据红色荧光细胞的密度和强度评估病毒转导范围。注意比较转导程度相似的动物个体。
  3. 如需，可使用更高倍率的物镜（≥25倍）记录详细的荧光图像。
    注意：在比较样本时，务必确保采集参数（如激发光强度、滤光片和曝光时间）的设置完全相同。
  4. 使用图像分析软件处理图像。
    注意：图像分析可在任意图像分析软件包中进行。以下步骤建议使用开源的 ImageJ 的 FIJI 发行版，以判断某序列在报告基因构建体背景下是否具有增强子活性（即回答“是”或“否”的问题）。当需要比较不同增强子变异体之间的活性程度时，可能需要更深入的光度测量分析。为确保可比性，来自不同样本的图像必须始终采用一致的处理方式。
    1. 应用滤镜以减少噪声。在 Fiji 中，选择“去斑点”（Despeckle）选项 过程 > 噪声 菜单
      注：这是一个 3 × 3 中值滤波器。
    2. 按照步骤 5.4.3–5.4.6 扣除背景荧光
    3. 分离多通道图像的通道。在 Fiji 中选择该选项 拆分通道 在……之下 图像 > 颜色 菜单
    4. 使用矩形或圆形选择工具在图像中无荧光细胞的区域绘制一个小形状，并利用该区域测量背景的平均像素强度 分析 > 测量重复操作以取样多个区域。
      注意：确保 平均灰度值 被选中在 分析 > 设置测量参数 菜单
    5. 取5-8个背景区域的平均灰度值，并舍去小数点。使用该数值从图像中每个像素的灰度值中减去 过程 > 数学 > 减去.
      注意：四舍五入至最接近的整数可能会高估需扣除的背景值。更稳妥的做法是直接舍去小数部分。例如，6.4 应向下取整为 6，而 6.5 也应向下取整为 6，以避免从每个像素中减去 0.5 单位的真实信号的风险。
    6. 如有需要，可将各通道重新合并为多通道图像。在 Fiji 中使用 图像 > 颜色 > 合并通道.
    7. 将任何重叠的图像拼接在一起。在 Fiji 中使用 插件 > 拼接 > 网格/集合拼接.
    8. 调整亮度和对比度。在 Fiji 中使用 图像 > 调节 > 亮度/对比度.
      注意：比较每张图像时，必须始终使用相同的最小值和最大值。
    9. 按照步骤 5.4.10–5.4.12 计数绿色荧光细胞的数量。这些细胞即为候选增强子序列能够驱动报告基因表达的细胞。
    10. 首先隐藏绿色通道，然后使用自由选择工具在表达红色荧光的脑区周围绘制一个区域。使用 测量 在 Fiji 中使用功能测量该区域红色通道的面积、积分密度和平均灰度值。
    11. 使用多点选择工具，统计该区域中绿色细胞的数量。
    12. 通过红色通道的积分密度对绿色细胞数量进行归一化。局部红色通道亮度可作为病毒暴露程度的代理指标，从而实现不同转导动物之间增强子活性的比较。

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结果

利用这些方法，可获得与精神疾病风险相关的基因第三内含子中的915 bp序列 CACNA1C19,49,50 在出生后小鼠脑组织中检测了该序列的增强子活性。该序列是在一项针对345个以精神疾病和神经系统疾病风险SNP为中心的候选增强子序列的MPRA研究中发现的。12 以及表征实验在此作为一般示例进行描述。在出生后第0天（P0），将包装为自互补载体的AAV9构建体注射至C57BL/6小鼠体内51 在Hsp68最小启动子调控下含有EGFP及单个候选增强子序列（图3A）。另外一些小鼠被注射了含有阴性对照序列的构建体，该序列预计不具有调控活性（图3B）。这些构建体的病毒滴度已标准化为 6.85 x 1010 v...

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讨论

本方案 描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的方法，用于在出生后小鼠脑中实现由增强子驱动的转基因表达。在此通用方案中，将候选增强子、最小启动子、报告基因以及可选的条形码序列克隆至AAV质粒骨架中。这些实验可针对单个候选增强子序列进行，也可并行分析多个序列。将质粒包装为rAAV后递送至出生后小鼠脑内。在允许病毒转导的一段时间后，收集小鼠脑组织并检测报告基因的表达情况。实验中同时包含一种组成型表达的报告病毒（CAG-mRuby3）作为注射对照。通过该检测方法，可证明增强子元件能够在小鼠脑内驱动EGFP的转录，从而展示其在体内的增强子活性 in vivo。

该实验的故障排除与优化主要涉及病毒滴度、注射技术以及转导时间窗口。不同的病毒滴度会对转导细胞的密度产生显著影响。尽管大多数研究可能更倾向于较高的转导效率，但最佳转导水平在很大程度上取决于实验目的。颅内注射可在局部产生较高密度的转导细胞，但转导区域通常较为局限，尽管感染扩散范围可能受病毒血清型和动物年龄的影响52。眶后静脉注射可能使转导细胞在全脑范围内的分布...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

测序工作由加州大学戴维斯分校DNA技术核心实验室完成。我们感谢加州大学戴维斯分校Lin Tian实验室在rAAV包装方面的培训，以及慷慨赠送AAV辅助病毒和rep/cap质粒。本研究得到美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所R35GM119831项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x 柠檬酸盐缓冲液Sigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'Integrated DNA TechnologiesN/A: 定制设计用于转化后验证克隆的正向引物。这些引物针对实验中所用载体特异性设计。
5'-gatggctggcaactagaagg-3'Integrated DNA TechnologiesN/A: 定制设计用于转化后验证克隆的反向引物。这些引物针对实验中所用载体特异性设计。
琼脂糖VWRVWRVN605-500G
吸液管组件Sigma-AldrichA5177-5EA用于口控递送重组腺相关病毒（rAAV）
细菌培养用培养皿Thermo Fisher Scientific08-757-100D
羧苄青霉素Sigma-AldrichC1389-5G
鸡IgY抗GFP抗体Thermo Fisher ScientificA10262
共聚焦显微镜ZeissLSM900图像采集使用的是LSM800型号，但Zeiss近年来已推出LSM900型号以取代LSM800。
15 mL锥形离心管Thermo Fisher Scientific12-565-269
冷冻模具Thermo Fisher ScientificNC9806558该模具适用于P28小鼠脑组织。其他尺寸可能更适合更大或更小的组织样本。
DAPISigma-AldrichD9542-10MG
解剖剪刀，4.5"VWR82027-578
驴抗鸡AlexaFluor-488抗体Jackson ImmunoResearch703-545-155
Dulbecco's PBS 1xThermo Fisher ScientificMT21031CV
2.0 mL Eppendorf微量离心管Thermo Fisher Scientific22431048
14 mL Falcon圆底管Thermo Fisher Scientific352059
快绿染料GraingerF0099-1G
精细细节画笔套装Artbrush TowerB014GWCLFO
Gibson Assembly Master MixNEBE2611S
玻璃毛细管Drummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed 质粒大提试剂盒QIAGEN12663商业化质粒大提纯试剂盒
HyClone HyPure分子生物学级水VWRSH30538.03
带12"软管和25G针头的静脉输液蝶形套件Thermo Fisher Scientific26708
KimwipesKimberly Clark34155无尘擦拭纸
LB琼脂Thermo Fisher ScientificBP1425-500用于选择性培养基的LB琼脂预混粉
McPherson Vannas虹膜剪Integra LifeSciences360-215
矿物油Sigma Life Science69794-500ML
NEB Stable 感受态大肠杆菌NEBC3040I
NucleoSpin凝胶与PCR产物纯化试剂盒Takara740609.5用于酶促反应纯化和凝胶回收的试剂盒
OCT包埋介质VWR25608-930
轨道摇床Cole Parmer60-100
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127-500G
0.2 mL PCR排管VWR490003-692
蠕动泵GilsonF155005
磷酸盐缓冲液（PBS）10xThermo Fisher Scientific70011044
Phusion Hot Start II 高保真DNA聚合酶Thermo Fisher ScientificF549L
脱脂奶粉Sunny Select
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36934
QIAquick PCR纯化试剂盒QIAGEN28106
rCutSmart缓冲液NEBB6004SPacI、AscI和XmaI限制性酶切缓冲液
限制性内切酶：AscINEBR0558L
限制性内切酶：PacINEBR0547L
限制性内切酶：XmaINEBR0180L
SOC扩增培养基NEBB0920S转化后的恢复培养基
蔗糖（RNase/DNase-free）Millipore Sigma033522.5KG
TAE缓冲液Apex20-194
转移软管GilsonF1179941用于蠕动泵
吐温X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV质粒小提DNA纯化系统Thermo Fisher ScientificA1460质粒小提试剂盒

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基于增强子的表达载体的AAV递送 在体 小鼠脑中
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