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利用人单核样THP-1白血病细胞系诱导巨噬细胞分化并极化为M2样表型

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DOI：

10.3791/62652

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2021年8月2日

 ,  ,  ,  , 
1Price Institute of Surgical Research, Department of Surgery, University of Louisville

本文内容

摘要

M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展及癌症患者的不良预后相关。本方案提供了一份详细指南，可在14天内可重复地将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞。该模型为研究肿瘤微环境中TAM的抗炎作用奠定了基础。

摘要

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可根据外部刺激改变其表达谱和细胞因子谱。这种显著的可塑性使TAM能够适应肿瘤微环境中的持续变化。巨噬细胞可表现出主要促炎（M1样）或抗炎（M2样）的特性，并可在这两种主要状态之间持续转换。在肿瘤微环境中，M2样巨噬细胞与多种癌症的疾病进展和不良预后相关。目前有多种不同的方法用于诱导THP-1细胞的分化与极化，以研究细胞内及细胞间机制，以及TAM在肿瘤微环境中的作用。然而，尚无公认的利用THP-1细胞系诱导M2样巨噬细胞极化的模型，且不同研究中特定体外刺激所导致的巨噬细胞表达谱和细胞因子谱结果存在差异。本实验方案提供了一套详细的操作流程，可在14天内将THP-1类单核细胞分化为M0巨噬细胞，并进一步极化为M2样表型。我们通过光学显微镜展示了THP-1类单核细胞、分化后的巨噬细胞以及极化后的M2样巨噬细胞的形态学变化。该模型为研究TAM的抗炎效应及其与肿瘤微环境中其他细胞群体相互作用的细胞系模型奠定了基础。

引言

肿瘤相关巨噬细胞（TAM）及其在慢性炎症、癌症发生和肿瘤发展中的作用是近年来研究的重要靶点1,2。被募集到发育中肿瘤组织微环境中的外周血单核细胞可分化为巨噬细胞，并可极化为两种主要亚型的巨噬细胞3。经典活化的巨噬细胞代表主要具有促炎特性的M1样表型，而替代性活化的M2样亚型则主要表现出抗炎特性4。巨噬细胞可根据其细胞代谢在上述两种主要表型之间动态转换，其中间亚型兼具促炎和抗炎特征5。TAM包含这两种表型的异质性群体。然而，在多种癌症中，M2样巨噬细胞尤其与促进肿瘤的功能及不良预后相关6,7,8。

巨噬细胞的功能特征及其在肿瘤微环境内与其他细胞的相互作用十分复杂，且在持续进展的肿瘤发展过程中难以准确捕捉。细胞系可提供具有稳定存活能力的均质细胞群体，有助于阐明特定的细胞内及细胞间作用机制。单核细胞样 THP-1 细胞系是原代人单核细胞的合理模型系统9。该细胞系源自一名一岁急性单核细胞白血病患儿的外周血，属自发永生化细胞系9,10。已有多个研究报道了 THP-1 细胞的分化与极化过程，并采用了多种不同的诱导方法11,12,13,14。巨噬细胞被激活并极化为 M1 样表型后，会触发一种代偿性抗炎反弹机制，通过炎症性巨噬细胞产生的细胞因子（如白细胞介素 6（IL-6）或衣康酸）促进向 M2 样表型转化15,16。该机制可能作为一种负反馈调节，以抑制细胞激活后过度的炎症反应17。然而，单核细胞及 THP-1 单核样细胞向抗炎性 M2 样表型分化与极化的过程本身也会伴随促炎性刺激，需加以克服。机械性应激（如更换培养基以补充营养）18可引发促炎性细胞因子反应，此外，添加化学诱导物（如佛波醇 12-十四烷酸十三酯乙酸酯（PMA））诱导 THP-1 细胞分化时，亦可诱导肿瘤坏死因子 α（TNFα）、白细胞介素 1β（IL-1β）或 IL-6 的产生19。PMA 所引发的细胞因子表达谱改变可能干扰甚至阻碍后续巨噬细胞的极化过程20。如先前报道，在 PMA 处理后设置适当的静息期，有助于降低此类炎症反应，从而促进细胞向明确的 M2 样表型极化21。

本方案展示了一种在14天内将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样表型巨噬细胞的方法。

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方案

注意：本方案所述步骤的概述见图1。购入人单核样白血病细胞系 THP-1，并通过短串联重复序列分析对 THP-1 细胞系进行鉴定。所有操作均需在无菌条件下进行。THP-1 单核细胞系以悬浮状态生长，不贴附于细胞培养表面。可通过将单核细胞诱导分化为类似巨噬细胞的细胞，使其获得贴壁能力，例如通过机械应力或使用佛波酯（PMA）进行特异性处理.

1. THP-1 类单核细胞的培养与维持

  1. 设置计时器为 150 秒。从液氮中取出含有 THP-1 细胞系的冻存管（材料表），立即放入洁净的水浴（37 °C）中解冻。将冻存管放入水浴的同时启动计时器。在解冻过程中轻轻拧松管盖以释放内部积聚的压力，但确保管口不接触水，以避免污染。最佳解冻时间为 120–150 秒。持续解冻细胞悬液，直至管内仅剩约 4 mm 大小的冰晶，随后立即进入下一步操作。
  2. 将细胞悬液的液相部分转移至含有 9 mL 预热（37 °C）培养基的 15 mL 离心管中（材料表）。然后，取 1 mL 预热的培养基-细胞悬液加入原 THP-1 冻存管中，再重新转移回 15 mL 离心管，以溶解残留的冰晶并冲洗冻存管，确保无细胞残留。
  3. 使用 1000 µL 移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。在离心过程中，取少量样品（约 10 µL）进行细胞活率计数（使用台盼蓝排除法）。将温热的细胞悬液在 37 °C 下以 200 × g 离心 7 分钟。
  4. 完全去除上清液，用一定体积的预热培养基重悬细胞，使细胞密度达到 5 × 105/mL。轻轻混匀细胞悬液后，将 22 mL 体积转移至 T-75 细胞培养瓶（材料表）。将培养瓶直立放置于 37 °C、5% 二氧化碳（CO2）浓度的培养箱中培养。每 3–4 天更换一次培养基。

2. THP-1 细胞的接种及向 M0 巨噬细胞的分化

  1. 准备含有相应细胞密度的生长培养基，以每平方厘米 3 x 10⁵ 个细胞的密度接种细胞5/mL/孔加入24孔细胞培养板（材料表）。轻轻混匀培养基，分装成每份26 mL，分别置于50 mL离心管中。每份26 mL培养基用于将细胞接种至相应的培养板中。
  2. 将1 mL含细胞的培养基转移至24孔板的每个孔中。每次转移之间，通过上下轻柔吹打混合培养基。
  3. 配制PMA储备液（将1 mg PMA溶解于100 µL二甲基亚砜（DMSO）中，得到约16 mM的PMA DMSO溶液），并在细胞处理前用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释至终工作浓度为10 ng/µL（材料表）。将溶液置于冰上，并立即使用，切勿再次冷冻。每孔加入 100 ng PMA。将每块细胞培养板放入培养箱中，不进行任何其他处理，孵育 72 h。
  4. 72小时后，移除生长培养基，并更换为1 mL新鲜生长培养基。移液时避免枪头接触孔底。将细胞在培养箱中继续培养96小时。
  5. 96小时后，重复步骤2.4（更换培养基），并让细胞再静置24小时。
    ​注意：M0 巨噬细胞现已准备好用于实验图2). 在将细胞用于后续实验处理之前，立即更换为仅含RPMI的培养基（材料表因为培养基添加剂可能会干扰后续添加的细胞处理试剂。如果需要获得M2样巨噬细胞，请继续进行第3节操作。

3. 将M0型巨噬细胞极化为M2样巨噬细胞

  1. 配制IL-4和IL-13的储存液（将20 µg的IL-4或IL-13溶解于200 µL无核酸酶水中），并在细胞处理前立即用PBS稀释至终工作浓度为2 ng/µL。将溶液置于冰上，并立即使用。切勿再次冷冻。
  2. 吸除培养基，更换为1 mL新鲜培养基。每孔加入20 ng白细胞介素4（IL-4）和20 ng白细胞介素13（IL-13）。将细胞在培养箱中孵育48小时。
  3. 48小时后，重复步骤3.2。将细胞继续在培养箱中孵育另外48小时。
  4. 吸除培养基，更换为1 mL新鲜培养基。将细胞在培养箱中孵育48小时。
    注意：此时M2样巨噬细胞已可用于实验（图2）。在将细胞用于后续实验处理前，建议仅使用RPMI培养基进行换液（材料表），因为培养基中的添加剂可能产生干扰。

4. 用于流式细胞术的巨噬细胞解离与收获

注意：采用结合冷冲击和细胞刮擦的机械方法，从培养板上分离并收集极化巨噬细胞，用于流式细胞术。

  1. 移除温热的细胞培养基，每孔加入1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙和镁）与5%胎牛血清（FBS）的混合液。操作后立即将细胞培养板置于冰上孵育45分钟。注意：必须在移除温热培养基后才可将细胞板放至冰上，否则会显著降低细胞活力。仅在使用预冷的PBS/5% FBS混合液诱导冷休克后，才可将细胞保持在冰上。
  2. 冰浴45分钟后，使用小型细胞刮刀（材料表）刮下细胞。将脱离的巨噬细胞轻轻转移至15 mL离心管中，并始终将离心管置于冰上，直至进行细胞染色。
    注意：合并八孔的细胞以获得足够的细胞数量用于染色。

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结果

M2样巨噬细胞的特征进行了表征，并通过流式细胞术检测分化簇（CD）标记物CD14、CD11b、CD80（M1样标记物）和CD206（M2样标记物）来验证M2极化。流式细胞术染色操作按照试剂制造商的说明书进行。巨噬细胞用含5% FBS的PBS洗涤，并与Fcγ受体阻断剂孵育，以避免非特异性结合。随后，细胞在4 °C条件下与以下抗体共同孵育30分钟：FITC标记的小鼠抗人CD14和CD80抗体、PE标记的小鼠抗人CD11b抗体、PE串联标记的小鼠抗人CD206抗体以及同型匹配的IgG对照（材料表）。随后进行四色流式细胞分析及荧光定量。根据前向散射和侧向散射信号对细胞设门，排除细胞碎片。

单核细胞和巨噬细胞标志物 CD14 和 CD11b 分别在 70.9% 和 74.7% 的细胞中表达（图 3）。细胞对 M1 样标志物 CD80 几乎无阳性表达（0.2%），而 62.6% 的细胞表面高表达 M2 样标志物 CD206（图 4）。

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讨论

本方案在14天内对THP-1类单核细胞进行分化和极化，通过在各步骤间设置充足的静置期并进行长时间处理，可获得具有明显M2样表型的巨噬细胞。

本实验方案中有若干步骤至关重要。THP-1 单核细胞的倍增时间约为 26 小时。细胞传代时的密度可为 9 × 105/mL，每次传代应以 3 × 105/mL 的密度接种。传代时无需完全更换已使用的（旧的）培养基——仅补充 50% 的新鲜培养基实际上可促进细胞更快生长，因为条件培养基中的生长因子有助于增强细胞增殖。然而，不完全更换培养基会增加污染风险，因此该操作仅应在新培养细胞的前几次传代中进行。准确计数细胞对于维持适当的培养密度以及评估细胞复苏后的活力至关重要。正确复苏后的细胞中，死细胞比例不应超过 15%。

将细胞接种到培养板中时，需要对细胞悬液进行轻柔但充分的混匀，以确保每个孔中的细胞密度一致。在将细胞接种到培养板之前，应先准备好分装样品，以保证含细胞的培养基体积得到充分混匀。由于培养基中的THP-1单核细胞容易沉降到离心管底部，因此在转移...

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披露

作者声明不存在潜在的利益冲突。

致谢

路易斯维尔大学Price外科研究所由John W. Price和Barbara Thruston Atwood Price信托基金提供资金支持。资助方在研究设计与实施，以及数据的收集、管理、分析和解释过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% 台盼蓝VWR, Radnor, USA152-5061
1.5 mL 微量离心管USA Scientific, Ocala, USA1615-5510
10 mL 血清移液管VWR, Radnor, USA 89130-898
1000 μL TipOne 移液器吸头USA Scientific, Ocala, USA1111-2821
15 mL  离心管VWR, Radnor, USA89039-664
20 μL TipOne 移液器吸头USA Scientific, Ocala, USA1120-1810
200 μL TipOne 移液器吸头USA Scientific, Ocala, USA1120-8810
25 mL 血清移液管VWR, Radnor, USA 89130-900
5 mL 血清移液管VWR, Radnor, USA 89130-896
50 mL 离心管VWR, Radnor, USA89039-662
Accutase 溶液 500 mLSigma, St. Louis, USAA6964
抗生素-抗真菌素溶液（100 倍浓度），稳定型Sigma, St. Louis, USAA5955-100 mL每毫升含 10,000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 μg 两性霉素 B，经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养
Binder CO2 培养箱VWR, Radnor, USAC170-ULE3
CytoOne T-75 cm 带滤膜盖培养瓶USA Scientific, Ocala, USACC7682-4875
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma, St. Louis, USAD8537-500 mL应使用不含氯化钙和氯化镁的 PBS，因为两者均可改变巨噬细胞极化状态
Eppendorf Centrifuge 5804 R（制冷型）Eppendorf, Enfield, USA-
乙醇（70%）--
FACSCalibur 流式细胞仪BD Biosciences, San Diego, USA-流式细胞仪使用 CellQuest 软件（BD Biosciences）操作
Falcon 24 孔板VWR, Radnor, USA353504
胎牛血清（FBS）ATCC, Manassas, USA30-2020
FITC 小鼠抗人 CD14 抗体BD Biosciences, San Diego, USA555397流式细胞术，髓系细胞标志物（100 次检测）
FITC 小鼠抗人 CD80 抗体BD Pharmingen, San Diego, USA557226流式细胞术，M1 标志物（100 次检测）
FITC 小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体BD Pharmingen, San Diego, USA555748流式细胞术，CD80 同型对照（100 次检测）
FITC 小鼠 IgG2a, κ 同型对照抗体BD Biosciences, San Diego, USA553456流式细胞术，CD14 同型对照（100 次检测）
人源 BD Fc 封闭抗体BD Biosciences, San Diego, USA564220流式细胞术，Fc 封闭（0.25 mg）
人白细胞介素 13（IL-13）R&D, Minneapolis, USAIL-771-10 μg
人白细胞介素 4（IL-4）R&D, Minneapolis, USASRP3093-20 μg
Labconco 生物安全柜（Delta 系列 36212/36213）Labconco, Kansas City, USA-
L-谷氨酰胺溶液，200 mMATCC, Manassas, USA30-2214
来自大肠杆菌 O111:B4 的脂多糖（LPS）Sigma, St. Louis, USAL2630-100 mg
小型细胞刮刀Biotium, Fremont, USA22003
Neubauer 血细胞计数板Fisher Scientific, Waltham, USA02-671-5
Nikon Eclipse TS100 倒置显微镜Nikon, Melville, USA-
无核酸酶水Invitrogen, Carlsbad, USAAM9937
Olympus RH-2 光学显微镜Microscope Central, Feasterville, USA40888
P10 可调移液器 - GilsonVWR, Radnor, USA76180-014
P1000 可调移液器 - GilsonVWR, Radnor, USA76177-990
P200 可调移液器 - GilsonVWR, Radnor, USA76177-988
PE 小鼠抗人 CD11b 抗体BD Biosciences, San Diego, USA555388流式细胞术，髓系细胞标志物（100 次检测）
PE 小鼠 IgG1, κ 同型对照抗体BD Biosciences, San Diego, USA555749流式细胞术，CD11b 同型对照（100 次检测）
PE-Cy 5 小鼠抗人 CD206 抗体BD Pharmingen, San Diego, USA551136流式细胞术，M2 标志物（100 次检测）
PE-Cy 5 小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体BD Pharmingen, San Diego, USA555750流式细胞术，CD206 同型对照（100 次检测）
佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA）Sigma, St. Louis, USAP8139
Powerpette Plus 移液器VWR, Radnor, USA75856-448
Precision 水浴锅（型号 183）Precision Scientific, Chicago, USA66551
RPMI-1640 培养基ATCC, Manassas, USA30-2001
THP-1 细胞系，美国模式培养物集存库（ATCC）ATCC, Manassas, USATIB-202

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M2 THP 1 CD14 CD206 4

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