M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAM）与肿瘤进展及癌症患者的不良预后相关。本方案提供了一份详细指南，可在14天内可重复地将THP-1类单核细胞分化并极化为M2样巨噬细胞。该模型为研究肿瘤微环境中TAM的抗炎作用奠定了基础。
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本文内容
摘要
摘要
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可根据外部刺激改变其表达谱和细胞因子谱。这种显著的可塑性使TAM能够适应肿瘤微环境中的持续变化。巨噬细胞可表现出主要促炎（M1样）或抗炎（M2样）的特性，并可在这两种主要状态之间持续转换。在肿瘤微环境中，M2样巨噬细胞与多种癌症的疾病进展和不良预后相关。目前有多种不同的方法用于诱导THP-1细胞的分化与极化，以研究细胞内及细胞间机制，以及TAM在肿瘤微环境中的作用。然而，尚无公认的利用THP-1细胞系诱导M2样巨噬细胞极化的模型，且不同研究中特定体外刺激所导致的巨噬细胞表达谱和细胞因子谱结果存在差异。本实验方案提供了一套详细的操作流程，可在14天内将THP-1类单核细胞分化为M0巨噬细胞，并进一步极化为M2样表型。我们通过光学显微镜展示了THP-1类单核细胞、分化后的巨噬细胞以及极化后的M2样巨噬细胞的形态学变化。该模型为研究TAM的抗炎效应及其与肿瘤微环境中其他细胞群体相互作用的细胞系模型奠定了基础。
引言
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）及其在慢性炎症、癌症发生和肿瘤发展中的作用是近年来研究的重要靶点1,2。被募集到发育中肿瘤组织微环境中的外周血单核细胞可分化为巨噬细胞，并可极化为两种主要亚型的巨噬细胞3。经典活化的巨噬细胞代表主要具有促炎特性的M1样表型，而替代性活化的M2样亚型则主要表现出抗炎特性4。巨噬细胞可根据其细胞代谢在上述两种主要表型之间动态转换，其中间亚型兼具促炎和抗炎特征5。TAM包含这两种表型的异质性群体。然而，在多种癌症中，M2样巨噬细胞尤其与促进肿瘤的功能及不良预后相关6,7,8。
巨噬细胞的功能特征及其在肿瘤微环境内与其他细胞的相互作用十分复杂，且在持续进展的肿瘤发展过程中难以准确捕捉。细胞系可提供具有稳定存活能力的均质细胞群体，有助于阐明特定的细胞内及细胞间作用机制。单核细胞样 THP-1 细胞系是原代人单核细胞的合理模型系统9。该细胞系源自一名一岁急性单核细胞白血病患....
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方案
注意：本方案所述步骤的概述见图1。购入人单核样白血病细胞系 THP-1，并通过短串联重复序列分析对 THP-1 细胞系进行鉴定。所有操作均需在无菌条件下进行。THP-1 单核细胞系以悬浮状态生长，不贴附于细胞培养表面。可通过将单核细胞诱导分化为类似巨噬细胞的细胞，使其获得贴壁能力，例如通过机械应力或使用佛波酯（PMA）进行特异性处理.
1. THP-1 类单核细胞的培养与维持
- 设置计时器为 150 秒。从液氮中取出含有 THP-1 细胞系的冻存管（材料表），立即放入洁净的水浴（37 °C）中解冻。将冻存管放入水浴的同时启动计时器。在解冻过程中轻轻拧松管盖以释放内部积聚的压力，但确保管口不接触水，以避免污染。最佳解冻时间为 120–150 秒。持续解冻细胞悬液，直至管内仅剩约 4 mm 大小的冰晶，随后立即进入下一步操作。
- 将细胞悬液的液相部分转移至含有 9 mL 预热（37 °C）培养基的 15 mL 离心管中（材料表）。然后，取 1 mL 预热的培养基-细胞悬液加入原 THP-1 冻存管中，再重新转移回 15 mL 离心管，以溶解残留的冰晶并冲洗冻存管，确保无细胞残留。
- 使用 1000 µL 移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。在离心过程中，取少量样品（约 10 µL）进行细....
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结果
通过流式细胞术检测分化簇（CD）标志物 CD14、CD11b、CD80（M1样标志物）和 CD206（M2样标志物），对M2样巨噬细胞进行表征，并验证M2极化状态。流式细胞术染色操作按照试剂生产商说明书进行。巨噬细胞用含5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS/5% FBS）洗涤，随后与Fcγ受体阻断剂孵育，以避免非特异性结合。细胞在4 °C条件下，分别与FITC标记的鼠抗人CD14和CD80抗体、PE标记的鼠抗人CD11b抗体、PE串联染料标记的鼠抗人CD206抗体以及同型对照IgG（材料表）孵育30分钟。随后进行四色流式细胞分析及荧光定量检测。根据前向散射光和侧向散射光排除细胞碎片，对细胞进行设门分析。
单核细胞和巨噬细胞标志物 CD14 和 CD11b 分别在 70.9% 和 74.7% 的细胞中表达（图 3）。细胞对 M1 样标志物 CD80 几乎无阳性表达（0.2%），而 62.6% 的细胞表面高表达 M2 样标志物 CD206（图 4
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讨论
本方案在14天内对THP-1类单核细胞进行分化和极化，通过在各步骤间设置充足的静置期并进行长时间处理，可获得具有明显M2样表型的巨噬细胞。
本实验方案中有若干步骤至关重要。THP-1 单核细胞的倍增时间约为 26 小时。细胞传代时的密度可为 9 × 105/mL，每次传代应以 3 × 105/mL 的密度接种。传代时无需完全更换已使用的（旧的）培养基——仅补充 50% 的新鲜培养基实际上可促进细胞更快生长，因为条件培养基中的生长因子有助于增强细胞增殖。然而，不完全更换培养基会增加污染风险，因此该操作仅应在新培养细胞的前几次传代中进行。准确计数细胞对于维持适当的培养密度以及评估细胞复苏后的活力至关重要。正确复苏后的细胞中，死细胞比例不应超过 15%。
将细胞接种到培养板中时，需要对细胞悬液进行轻柔但充分的混匀，以确保每个孔中的细胞密度一致。在将细胞接种到培养板之前，应先准备好分装样品，以保证含细胞的培养基体积得到充分混匀。由于培养基中的THP-1单核细胞容易沉降到离心管底部，因此在转移.......
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披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
路易斯维尔大学Price外科研究所由John W. Price和Barbara Thruston Atwood Price信托基金提供资金支持。资助方在研究设计与实施，以及数据的收集、管理、分析和解释过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% 台盼蓝 | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL 血清移液管 | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne 移液器吸头 | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL 离心管 | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne 移液器吸头 | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne 移液器吸头 | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL 血清移液管 | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL 血清移液管 | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL 离心管 | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase 溶液 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| 抗生素-抗真菌素溶液（100 倍浓度），稳定型 | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | 每毫升含 10,000 单位青霉素、10 mg 链霉素和 25 μg 两性霉素 B，经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养 |
| Binder CO2 培养箱 | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75 cm 带滤膜盖培养瓶 | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | 应使用不含氯化钙和氯化镁的 PBS，因为两者均可改变巨噬细胞极化状态 |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R（制冷型） | Eppendorf, Enfield, USA | - | |
| 乙醇（70%） | - | - | |
| FACSCalibur 流式细胞仪 | BD Biosciences, San Diego, USA | - | 流式细胞仪使用 CellQuest 软件（BD Biosciences）操作 |
| Falcon 24 孔板 | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| 胎牛血清（FBS） | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC 小鼠抗人 CD14 抗体 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | 流式细胞术，髓系细胞标志物（100 次检测） |
| FITC 小鼠抗人 CD80 抗体 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | 流式细胞术，M1 标志物（100 次检测） |
| FITC 小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | 流式细胞术，CD80 同型对照（100 次检测） |
| FITC 小鼠 IgG2a, κ 同型对照抗体 | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | 流式细胞术，CD14 同型对照（100 次检测） |
| 人源 BD Fc 封闭抗体 | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | 流式细胞术，Fc 封闭（0.25 mg） |
| 人白细胞介素 13（IL-13） | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| 人白细胞介素 4（IL-4） | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco 生物安全柜（Delta 系列 36212/36213） | Labconco, Kansas City, USA | - | |
| L-谷氨酰胺溶液，200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| 来自大肠杆菌 O111:B4 的脂多糖（LPS） | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| 小型细胞刮刀 | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer 血细胞计数板 | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse TS100 倒置显微镜 | Nikon, Melville, USA | - | |
| 无核酸酶水 | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus RH-2 光学显微镜 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 可调移液器 - Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 可调移液器 - Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 可调移液器 - Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE 小鼠抗人 CD11b 抗体 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | 流式细胞术，髓系细胞标志物（100 次检测） |
| PE 小鼠 IgG1, κ 同型对照抗体 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | 流式细胞术，CD11b 同型对照（100 次检测） |
| PE-Cy 5 小鼠抗人 CD206 抗体 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | 流式细胞术，M2 标志物（100 次检测） |
| PE-Cy 5 小鼠 IgG1 κ 同型对照抗体 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | 流式细胞术，CD206 同型对照（100 次检测） |
| 佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯（PMA） | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus 移液器 | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision 水浴锅（型号 183） | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 培养基 | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 细胞系，美国模式培养物集存库（ATCC） | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
参考文献
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B.
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