利用时间分辨的蛋白质诱导荧光增强技术逐个识别单个α-突触核蛋白单体的稳定局部构象

摘要

时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。

摘要

利用光谱尺追踪单个生物大分子的多种构象及其动态过程，已彻底改变了人们对结构动力学及其在生物学中作用的理解。虽然基于FRET的测量方法可报告3-10 nm范围内的染料间距离，但其他光谱技术（如蛋白诱导荧光增强效应，PIFE）则可报告染料与蛋白质表面在更短的0-3 nm范围内的接近程度。无论选择何种方法，当用于逐个测量自由扩散的生物大分子时，均可获得实验参数的直方图，呈现出多个独立的、中心分布的亚群，每个亚群代表一种在毫秒时间内保持不变的单一构象，或代表多种在远快于毫秒的时间尺度上相互转换的构象，因而表现为一个平均化的亚群。在单分子FRET实验中，直方图所报告的参数为染料间的FRET效率；先前研究发现，在缓冲液中的α-突触核蛋白单体这类本质上无序的蛋白质，表现出单一的平均化亚群，对应于快速相互转换的多种构象。尽管这些以往的发现依赖于FRET光谱尺3-10 nm的测量范围，我们在此尝试采用单分子PIFE技术对这种蛋白质进行检验，通过逐个追踪位点特异性sCy3标记的α-突触核蛋白的荧光寿命来实现。有趣的是，使用这种测量范围更短的光谱接近性传感器，sCy3标记的α-突触核蛋白表现出多个具有显著不同平均寿命的寿命亚群，且这些亚群在10-100 ms时间尺度上相互转换。这些结果表明，尽管α-突触核蛋白在整体上可能处于无序状态，但它仍能形成稳定的局部结构。总之，本研究强调了使用不同光谱接近性传感器的优势，这些传感器能够逐个生物分子地追踪局部或全局的结构变化。

引言

在过去的二十年中，基于单分子荧光的方法已成为测量生物大分子的有力工具^1,2，可用于研究不同生物分子参数的分布情况，以及这些参数在亚毫秒分辨率下不同亚群之间动态相互转换的过程^3,4,5。这些技术中涉及的参数包括FRET 测量中的能量转移效率⁶,⁷、荧光各向异性^8,9、荧光量子产率和荧光寿命^10,11，这些参数会因不同的荧光猝灭¹²或增强¹³机制而发生变化。其中一种机制被称为蛋白质诱导荧光增强（PIFE）¹⁴，其原理是当荧光团处于激发态时，其自由异构化过程受到邻近蛋白质表面造成空间位阻的影响，从而导致荧光量子产率和荧光寿命增强^{14,15,16,17,18,19}。FRET和PIFE均被视为光谱尺或接近度传感器，因为它们所测得的参数直接关联于被标记生物分子内部的空间距离。FRET效率与一对染料之间3–10 nm范围内的距离相关²⁰，而PIFE则监测染料与邻近蛋白质表面之间0–3 nm范围内距离变化所引起的荧光量子产率或荧光寿命的增加¹⁹。

单分子FRET已被广泛用于研究多种不同蛋白质体系的结构，包括内在无序蛋白（IDPs）²¹，例如α-突触核蛋白（α-Syn）²²。α-Syn在结合不同生物分子或处于不同条件时可形成有序结构^{23,24,25,26,27,28,29,30}。然而，在未结合状态下，α-Syn单体表现出高度的构象异质性，并具有快速相互转换的构象^31,32。

α-Syn 的构象此前已通过多种不同技术进行了研究，这些技术有助于识别此类高度异质且动态的蛋白质系统的构象动力学^{33,34,35,36,37,38,39}。有趣的是，在缓冲液中对 α-Syn 进行的单分子 FRET（smFRET）测量结果显示仅存在一个 FRET 群体^39,40 ，这是由于构象在远快于 α-Syn 通过共聚焦检测区域的典型扩散时间（快至数微秒，甚至更快，相对于典型的毫秒级扩散时间）下动态相互转换并发生时间平均化的结果^40,41。然而，使用具有 3–10 nm 距离灵敏度的 FRET 光谱标尺有时仅能报告像 α-Syn 这类小蛋白的整体结构变化。利用具有更短距离灵敏度的光谱邻近传感器进行单分子测量，则有可能揭示局部结构的动力学信息。本文中，我们对 α-Syn 进行了单分子 PIFE 测量，识别出具有不同荧光寿命的亚群，这些亚群对应于不同的局部结构，且它们之间的转换速度可慢至 100 ms。本研究总结了在缓冲液中以及当 α-Syn 结合于基于 SDS 的膜时，作为短程单分子光谱邻近传感器，对自由扩散的 α-Syn 分子逐个进行的时间分辨单分子 PIFE 测量结果。

方案

1. 质粒转化

1. 制备 0.5 L SOC 培养基
   1. 称取 10 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、0.25 g 氯化钠（NaCl）、0.1 g 氯化钾（KCl）。
   2. 加入重蒸水（DDW）至总体积为 0.5 L。
   3. 加入氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7。
   4. 分装成每份 100 mL 的储存液，并进行高压灭菌。
   5. 使用前，在 100 mL SOC 培养基中加入 0.5 mL 无菌氯化镁（MgCl₂）和 1.8 mL 无菌葡萄糖。
2. 将 BL21 (DE3) 感受态 Escherichia coli 细胞置于冰上解冻。
3. 轻柔混匀感受态细胞。
4. 准备两个 15 mL 离心管。分别标记为转化反应管和对照管。
5. 将 100 µL 感受态细胞分装至各管中。
6. 向转化反应管中加入 1 µL 浓度为 0.1 ng/µL 的质粒。
7. 将 SOC 培养基置于 42 °C 水浴中预热，用于步骤 1.8。
8. 将两管样品在 42 °C 水浴中热激 45 秒。（关键步骤！）
9. 向每管中加入 900 µL 预热的 SOC 培养基。
10. 将各管在 37 °C 摇床中以 225 rpm 的速度振荡培养 45 分钟。
11. 用无菌涂布棒将 200 µL 含转化质粒的菌液涂布于一个含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB（Luria-Bertani）琼脂平板上。
12. 用无菌涂布棒将 200 µL 含转化质粒的菌液涂布于一个不含氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上 （阳性对照）。
13. 用无菌涂布棒将 200 µL 对照菌液（不含质粒）涂布于一个含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上 （阴性对照）。
14. 将平板在 37 °C 培养过夜。

2. 蛋白质制备

1. 重组α-突触核蛋白的表达与纯化
   1. 挑取单菌落，于100 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的灭菌LB（Luria-Bertani）液体培养基中，37 °C培养 （起始物）.
   2. 准备四个2 L的锥形瓶，每个锥形瓶中加入1 L已灭菌的LB培养基和100 µg/mL氨苄青霉素 （大量接种）.
   3. 测量细胞溶液的光密度（OD600 nm）。当起始培养物的细胞密度达到OD_{λ=600 nm} 当OD值为0.6–0.7时，向此前步骤中制备的每1 L LB培养基中加入10 mL的种子液。
   4. 在37 °C、转速为200 rpm的恒温摇床中培养细菌培养基。
   5. 当细胞密度达到 OD_{λ=600 nm} 当菌液密度达到 0.6–0.8 时，向每 1 L 培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 1 mM，以诱导蛋白表达。
      注意：将0.96 g IPTG溶于4 mL去离子水（DDW）中，每升细菌培养液加入1 mL配制的IPTG溶液。
   6. 将细胞培养4小时，然后在50 mL离心管中以5,170 × g离心8分钟收集细胞。
      注意：每一轮中，弃去上清液，保留沉淀，并再次向同一管中加入细菌培养物。
   7. 将细菌沉淀置于深冻保存（例如 -80 °C）中，留待次日使用。
   8. 次日，配制 200 mL 裂解缓冲液：含 40% (w/v) 蔗糖和缓冲液 A，缓冲液 A 包含 30 mM Tris-HCl、2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA)、2 mM 二硫苏糖醇 (DTT)，pH 8.0。
   9. 向每管细菌沉淀中加入 25 mL 裂解缓冲液。
   10. 用无菌塑料巴斯德吸管将沉淀重悬于裂解缓冲液中（见2.1.8）。
   11. 在冰上准备一个带有搅拌子的无菌250 mL锥形瓶。
   12. 加入5 mL裂解缓冲液，然后将重悬均匀的细胞转移至其中。
   13. 在室温下以200 rpm的速度搅拌细胞20分钟。
   14. 将溶液分装至50 mL离心管中，在4 °C、17,400 x g条件下离心30分钟。
   15. 弃去上清液。
   16. 在冰上准备一个带有搅拌子的无菌250 mL锥形瓶。
   17. 加入15 mL溶解缓冲液（90 mL冷却的缓冲液A和37 µL MgCl₂）₂ 将超过溶解度极限并经过滤的溶液加入各管中。使用无菌塑料巴斯德吸管溶解沉淀物。
   18. 当溶液部分变为均匀时，将其转移至冰上搅拌的锥形瓶中。
   19. 确定锥形瓶中的溶液体积。
   20. 每1 mL溶液中加入10 mg硫酸链霉素（加入前，将硫酸链霉素溶于2 mL缓冲液A中）。
       注意：此步骤旨在去除 DNA 和核糖体。
   21. 在室温下搅拌溶液10-20分钟。
   22. 将溶液分装至50 mL离心管中，在4 °C、20,700 x g条件下离心30分钟。
   23. 收集上清液，弃去沉淀。
   24. 在冰上准备一个带有搅拌器的无菌250 mL锥形瓶。
   25. 使用0.22 µm注射器滤器将上清液过滤至洁净的锥形瓶中。
   26. 确定溶液的体积，按每1 mL溶液称取0.3 g硫酸铵。
   27. 逐渐将硫酸铵加入搅拌的溶液中。
       注意：此步骤用于沉淀蛋白质。当硫酸铵与蛋白质结合时，溶液会变得浑浊不透明，呈现白色。
   28. 室温下搅拌30分钟。
   29. 将溶液分装至50 mL离心管中，在4 °C、20,700 g条件下离心30分钟。 
   30. 小心弃去上清液，保留沉淀。
   31. 用20 mL缓冲液A重悬沉淀。
   32. 将所有溶液合并至一个试管中，然后测定该溶液的紫外吸收光谱。
       注意：如果光谱显示出聚集的特征（在300 nm波长以上有吸收），则继续下一步。如果没有，则跳过下一步，直接进入步骤2.1.34。
       注意：由紫外光谱计算得到的聚集指数（A.I.）为 OD_{λ=350 nm}/（OD_λ=280nm - OD_{λ=350 nm}) ×100.⁴¹
   33. 使用截留分子量为100 kDa的超滤离心管，在4 °C、3,590 × g条件下离心15分钟。收集滤过液。
   34. 在4 °C下，使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋，用缓冲液A对溶液进行过夜透析。
   35. 再进行一轮透析，持续时间至少为4小时。
   36. 将透析后的样品上样至1 mL MonoQ阴离子交换柱。使用pH 7.5的30 mM Tris盐酸盐（Tris-HCl）缓冲液作为洗涤缓冲液，使用含500 mM NaCl的pH 7.5的30 mM Tris-HCl缓冲液作为洗脱缓冲液。
   37. 将样品注入色谱柱，然后依次用20个柱体积（CV）的0%洗脱缓冲液和100%洗涤缓冲液洗涤，以去除未结合的蛋白质。
   38. 用30%洗脱缓冲液洗涤7个柱体积。
   39. 以30%到100%的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为1.5 mL/min，持续30个柱体积。
       注意：α-突触核蛋白在电导率为20-24 mS/cm时于46-66个柱体积（CV）处洗脱，相当于洗脱缓冲液的38-50%。
   40. 收集主洗脱峰的组分。取样品进行15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），经考马斯亮蓝或Fast SeeBand染色液染色后，检测α-Syn的存在。预期可见一条15 kDa的条带。
   41. 合并相关组分，并在4 °C下使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋，用缓冲液A透析过夜。
   42. 制备蛋白样品的分装 aliquot，并于 -20 °C 保存。
2. Cy3标记的α-突触核蛋白
   1. 向α-Syn A56C突变体中加入DTT，使其终浓度为2 mM，在室温下孵育1小时，以还原半胱氨酸残基的巯基。
   2. 使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋进行两轮透析以去除DTT。第一轮用含30 mM Tris-HCl（pH 8.0）和2 mM EDTA的溶液透析；第二轮用含50 mM HEPES（pH 7.2）和2 mM EDTA的溶液透析。
   3. 通过向蛋白质样品中加入盐酸三(2-羧乙基)膦（TCEP），使终浓度达到50 µM，在室温下孵育30分钟，以还原半胱氨酸残基。
      注意：TCEP 是一种非巯基还原剂，因此可在不与染料发生反应的情况下保持巯基处于还原状态。我们从 1 M TCEP 储存液中添加了 0.5 µL。
   4. 计算最终反应体积为1 mL所需的蛋白量。
      注意：以下是我们所用计算方法的一个示例：
      20 µM _{最终蛋白浓度} × 1 mL _最终体积 = 56 µM _{初始蛋白质浓度} × V _{待添加的蛋白}
   5. 计算1 mL终反应体积所需的染料量。单个半胱氨酸的染料标记应使用过量染料，染料与蛋白质的摩尔比至少为3:1。
      注意：以下为我们所用计算方法的一个示例：
      60 µM _{最终染料浓度} × 1 mL _最终体积 = 370 µM _{初始染料浓度} × V _{染料需添加}
   6. 计算所需透析液缓冲液的量，以将总体反应体积调整至1 mL。
      注意：计算示例：1 mL - (V _{计算得出的 从步骤 2.2.4} + V _{计算得出的 来自步骤 2.2.5）}
   7. 在搅拌器上方放置带有磁子的反应小瓶。
   8. 首先，加入计算量的蛋白质和缓冲液。随后，加入计算量的染料（sulfo-Cy3 maleimide）。
   9. 将反应置于室温避光条件下持续3-5小时。
   10. 加入2 mM DTT终止反应，并继续孵育1小时。
   11. 使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋，用缓冲液A进行三轮透析，以去除溶液中过量的游离染料。
   12. 将样品上样至尺寸排阻柱，以进一步分离标记的α-Syn与游离染料。
   13. 通过测量染料的吸光度来确定纯标记α-Syn的浓度（磺化Cy3的吸收系数为162,000 M⁻¹cm⁻¹）^-1厘米^-1在 λ=548 nm 处。
   14. 如有需要，使用真空浓缩仪（例如 SpeedVac）浓缩纯化的标记α-Syn溶液。随后使用截留分子量为3.5 kDa的透析袋，对缓冲液A进行一轮透析，并重新测定标记蛋白的浓度。
   15. 制备标记蛋白样品的分装 aliquot，并于 -20 °C 保存。

3. 测量

1. smPIFE 实验装置
   注意：使用以下基于共聚焦的装置或类似装置。
   1. 使用脉冲激光源（在本例中为 λ = 532 nm 的皮秒脉冲激光器，脉宽约为 100 ps FWHM），以适当的重复频率运行（本例中为 20 MHz），并将激光信号接入时间相关单光子计数（TCSPC）卡的 SYNC 端口，作为 sulfo-Cy3（sCy3）的激发光源。
   2. 使用在 532 nm 处具有高反射率的二向色镜，以分离激发光和散射光与荧光。
   3. 在准直发射光束经透镜聚焦后、再由另一透镜重新准直前，在发射光路的焦点处放置一个直径为 100 µm 的针孔。
   4. 使用带通滤光片（本例中为 585/40 nm）进一步滤除其他光源对 sCy3 荧光的干扰。
   5. 使用探测器（本例中为单光子雪崩二极管或混合型光电倍增管）检测荧光信号，并通过一个 4 路复用器（本例中）将信号接入 TCSPC 模块（本例中为 Becker & Hickl SPC-150）。
      注意：在本例中，数据采集通过 VistaVision 软件（ISS^TM）以时间标记时间分辨（TTTR）文件格式进行。
2. smPIFE 样品制备
   1. 在低蛋白吸附管中，用测量缓冲液配制 25 pM 的 sCy3 标记 α-突触核蛋白（α-Syn）溶液：10 mM 醋酸钠、10 mM 磷酸二氢钠、10 mM 甘氨酸（pH 8.0）、20 mM NaCl、10 mM 半胱胺和 1 mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（TROLOX）。
      ​注意：若在 SDS 囊泡存在下测量 α-Syn，还需加入相应量的 SDS。
   2. 用 100 µL 浓度为 1 mg/mL 的牛血清白蛋白（BSA）溶液冲洗 18 孔显微镜盖玻片载片，持续 1 分钟，然后移除 BSA 溶液。
   3. 向盖玻片载片的一个孔中加入 100 µL 的 25 pM sCy3 标记 α-Syn 样品。
   4. 使用上述装置对样品进行 smPIFE 测量，具体步骤如下。
3. smPIFE 数据采集
   1. 使用高数值孔径的水浸物镜（本例中为 Olympus UPLSAPO 60x，N.A. 1.2），并在物镜顶部滴加一滴超纯水。
   2. 将盖玻片载片固定在载物台腔室中，并安装到显微镜载物台上。
   3. 向上移动物镜，直至物镜顶部的水滴与盖玻片底部接触并铺展。
   4. 打开激光快门，同时向上移动物镜，并通过 CMOS 相机观察样品散射光形成的图案。观察艾里环图案：第一个环对应水-玻璃界面的焦点，第二个环对应玻璃与样品溶液界面的焦点。
   5. 再将物镜升高 75 µm，使激光焦点深入溶液内部，以最小化盖玻片玻璃表面产生的自荧光。
   6. 调节物镜处的激光功率至约 100 µW。
   7. 开始对探测到的光子进行预设时间的数据采集（在本实验中为 2 小时）。
      ​注意：大部分采集信号的计数率（单位为每秒计数，cps）应与仅测量缓冲液时相近；以毫秒为时间窗口的数据应显示极少的光子爆发事件，大多数时间窗口的平均计数率应接近典型探测器背景水平（本例中 <1,000 cps）。

4. smPIFE 爆发分析

1. 原始数据转换
   注意：数据通常以二进制文件形式存储，其格式由制造 TCSPC 卡的公司预先定义（在本例中为 .spc 文件）。
   1. 使用软件套件 phconvert（https://github.com/Photon-HDF5/phconvert）将原始数据文件转换为光子-HDF5 通用文件格式⁴²。将原始数据文件作为输入，使用 phconvert 套件中的适当代码将其转换为原始数据 .hdf5 文件（在本例中为 Convert ns-ALEX Becker-Hickl files to Photon-HDF5.ipynb Jupyter 笔记本）。
      注意：转换为 .hdf5 文件包括：(1) 确定原始数据中相关的光子流（即具有相关探测器 ID 的已记录光子的光子流）；(2) 相关的光子纳秒时间（相对于激发 SYNC 时间的光子探测时间）；以及 (3) 添加的元数据。
2. 使用 FRETbursts⁴³ 进行爆发搜索与筛选
   注意：所有 smPIFE 测量的光子-HDF5 原始数据文件，以及总结原始数据分析的代码，均存储于 Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698）。以下所有步骤均在 Jupyter 笔记本中详细说明并展示，这些笔记本也可在 Zenodo 存储库链接中获取。
   1. 打开 Jupyter 笔记本（在本例中使用 Anaconda 框架）。
   2. 打开笔记本 smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Final notebook).ipynb（可在 Zenodo 链接中找到）。
   3. 加载 FRETbursts。
   4. 加载光子 HDF5 数据文件。
   5. 背景速率评估：利用光子间时间的直方图，计算光子 HDF5 数据文件中每 30 秒数据采集期间的背景（BG）速率。
      注意：以下步骤描述了使用滑动窗口算法^44,45,46 进行爆发搜索的过程。
   6. 以一次一个光子的方式，移动包含 m=20 个连续光子的时间窗口。
   7. 仅当瞬时光子速率（）至少为该数据采集时段背景速率的 F=11 倍时，才收集光子数据。
      注意：爆发由通过逐个滑动窗口（步骤 4.2.6）并满足光子速率标准（步骤 4.2.7）所收集的所有连续光子构成。
   8. 计算以下爆发特征：
      爆发大小：爆发中包含的光子数量。
      爆发持续时间：爆发中最后一个与第一个光子探测时间之间的时间差。
      爆发亮度：爆发中瞬时光子速率的最大值。
      爆发间隔：连续爆发之间的时间间隔。
      注意：以下几点描述了进一步的爆发筛选流程。
   9. 绘制爆发亮度值（爆发中最高的瞬时光子速率）的直方图，事件轴采用对数刻度。
   10. 将爆发亮度阈值定义为直方图开始呈现衰减趋势时的最小爆发亮度值。
   11. 选择亮度值大于爆发亮度阈值的爆发。
       注意：接下来的步骤描述爆发的平均荧光寿命。
   12. 绘制所有选定爆发中所有光子的光子纳秒时间直方图，光子计数轴采用对数刻度。
   13. 将纳秒时间阈值定义为光子纳秒时间直方图开始呈现衰减趋势时的最小纳秒时间值。
   14. 仅选择纳秒时间大于纳秒时间阈值的光子。
   15. 计算所有选定光子纳秒时间的代数平均值。
   16. 从光子纳秒时间的代数平均值中减去纳秒时间阈值。结果即为爆发的平均光子纳秒时间，其与平均荧光寿命成正比。
   17. 绘制所有爆发平均荧光寿命的直方图。可能出现中心分布的荧光寿命亚群。平均值较低的亚群代表 sCy3 未受空间位阻的分子种类，而平均值较高的亚群代表 sCy3 受到更强空间位阻的分子种类。
       注意：接下来的步骤描述基于爆发重现分析⁴⁷ 的缓慢爆发间动态过程。
   18. 绘制爆发间隔时间的直方图，间隔时间轴采用对数刻度。
       注意：将出现两个爆发间隔时间的亚群：
       一个主要亚群，其间隔时间为数秒，代表来自不同连续测量分子的连续爆发。
       一个次要亚群，其间隔时间 ~<100 ms，代表来自同一分子并再次通过共焦体积的连续爆发。
   19. 选择保存所有间隔时间小于定义同一分子亚群的最大间隔时间的连续爆发对（在本例中为 <100 ms）。
   20. 绘制所有在特定间隔时间阈值以下重现的爆发对中，第一和第二个爆发的平均荧光寿命的直方图或散点图。

结果

作为一种内在无序蛋白（IDP），当α-Syn未与其他生物大分子结合时，其在多种构象之间表现出结构动力学，构象转变时间尺度可达数微秒⁴⁰，甚至达到数百纳秒⁴¹。当α-Syn穿过共聚焦检测区域时，可能经历数千次构象转变。事实上，当使用单分子FRET（smFRET）技术时，确实观察到了这种情况^39,40。本文中，我们进行单分子光诱导荧光增强（smPIFE）测量，以探究α-Syn的局部构象动力学。

该测量记录了连接至α-突触核蛋白A56C突变体中半胱氨酸巯基上的磺化Cy3（sCy3）染料所发射的荧光光子。sCy3荧光团在激发态时可发生异构化。然而，sCy3仅在其反式异构体退激发时才会发射光子。因此，若sCy3的激发态异构化未受到任何空间位阻，则其平均发射的光子数较少，表现为较低的荧光量子产率和较短的荧光寿命。然而，若sCy3的激发态异构化受到阻碍（例如，邻近蛋白...

讨论

已开展大量生物化学与生物物理研究，以探讨α-Syn的结构特征及其无序性质^{33,34,35,36,37,38}。已有多个研究利用自由扩散的单分子FRET（smFRET）技术，探究无结合状态下α-Syn单体的分子内动力学。这些研究报道了α-Syn具有高度动态异质性，导致在典型扩散时间内通过共聚焦焦点区域时，多种不同结构态被平均化，从而呈现出单一的FRET群体^39,40。然而，必须注意的是，smFRET测量反映的是3–10 nm范围内染料间距离的变化，这一尺度表征的是α-Syn这类小蛋白的整体结构变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amicon Ultra-15 离心过滤装置	Merc	C7715	截留分子量：100 kDa
硫酸铵	Sigma-Aldrich	A4418
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A9647
半胱胺	Sigma-Aldrich	30070
透析袋 - MEGA GeBaFlex-tube	Gene Bio-Application	MEGA320
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma-Aldrich	43815
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich	E5134
Fast SeeBand 染色液	Gene Bio-Application	SB050
甘氨酸	Sigma-Aldrich	50046
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	54457
HiTrap 脱盐柱 5 mL	Sigma-Aldrich	GE17-1408
6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（TROLOX）	Sigma-Aldrich	238813
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	Sigma-Aldrich	I5502
LB 培养基	Sigma-Aldrich	L3152
氯化镁	Sigma-Aldrich	63068
MonoQ 柱	Sigma-Aldrich	54807
蛋白质 LoBind 管	Sigma-Aldrich	EP0030108094	0.5 mL
冲洗 µ-slide 18	Ibidi	81816
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	75746
乙酸钠	Sigma-Aldrich	S2889
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045
一水合磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	71507
无菌涂布棒，Drigalski 刮铲	mini-plast	815-004-05-001
硫酸链霉素	Sigma-Aldrich	S9137
磺基-Cy3 马来酰亚胺	abcam	ab146493
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）	Sigma-Aldrich	75259
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	93363
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	T7293
酵母提取物	Sigma-Aldrich	Y1625