时间分辨单分子蛋白质诱导荧光增强是一种有用的荧光光谱邻近传感器，可灵敏检测蛋白质局部结构变化。本文展示了该方法可用于揭示α-突触核蛋白中稳定的局部构象，而使用长程FRET标尺测量时，该蛋白通常被认为呈球状无序且不稳定。
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摘要
摘要
利用光谱尺追踪单个生物大分子的多种构象及其动态过程，已彻底改变了人们对结构动力学及其在生物学中作用的理解。虽然基于FRET的测量方法可报告3-10 nm范围内的染料间距离，但其他光谱技术（如蛋白诱导荧光增强效应，PIFE）则可报告染料与蛋白质表面在更短的0-3 nm范围内的接近程度。无论选择何种方法，当用于逐个测量自由扩散的生物大分子时，均可获得实验参数的直方图，呈现出多个独立的、中心分布的亚群，每个亚群代表一种在毫秒时间内保持不变的单一构象，或代表多种在远快于毫秒的时间尺度上相互转换的构象，因而表现为一个平均化的亚群。在单分子FRET实验中，直方图所报告的参数为染料间的FRET效率；先前研究发现，在缓冲液中的α-突触核蛋白单体这类本质上无序的蛋白质，表现出单一的平均化亚群，对应于快速相互转换的多种构象。尽管这些以往的发现依赖于FRET光谱尺3-10 nm的测量范围，我们在此尝试采用单分子PIFE技术对这种蛋白质进行检验，通过逐个追踪位点特异性sCy3标记的α-突触核蛋白的荧光寿命来实现。有趣的是，使用这种测量范围更短的光谱接近性传感器，sCy3标记的α-突触核蛋白表现出多个具有显著不同平均寿命的寿命亚群，且这些亚群在10-100 ms时间尺度上相互转换。这些结果表明，尽管α-突触核蛋白在整体上可能处于无序状态，但它仍能形成稳定的局部结构。总之，本研究强调了使用不同光谱接近性传感器的优势，这些传感器能够逐个生物分子地追踪局部或全局的结构变化。
引言
在过去的二十年中，基于单分子荧光的方法已成为测量生物大分子的有力工具1,2，可用于研究不同生物分子参数的分布情况，以及这些参数在亚毫秒分辨率下不同亚群之间动态相互转换的过程3,4,5。这些技术中涉及的参数包括FRET 测量中的能量转移效率6,7、荧光各向异性8,9、荧光量子产率和荧光寿命10,11，这些参数会因不同的荧光猝灭12或增强13机制而发生变化。其中一种机制被称为蛋白质诱导荧光增强（PIFE）14，其原理是当荧光团处于激发态时，其自由异构化过程受到邻近蛋白质表面造成空间位阻的影响，从而导致荧光量子产率和荧光寿命增强
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方案
1. 质粒转化
- 制备 0.5 L SOC 培养基
- 称取 10 g 胰蛋白胨、2.5 g 酵母提取物、0.25 g 氯化钠（NaCl）、0.1 g 氯化钾（KCl）。
- 加入重蒸水（DDW）至总体积为 0.5 L。
- 加入氢氧化钠（NaOH）调节 pH 至 7。
- 分装成每份 100 mL 的储存液，并进行高压灭菌。
- 使用前，在 100 mL SOC 培养基中加入 0.5 mL 无菌氯化镁（MgCl2）和 1.8 mL 无菌葡萄糖。
- 将 BL21 (DE3) 感受态 Escherichia coli 细胞置于冰上解冻。
- 轻柔混匀感受态 细胞。
- 准备两个 15 mL 离心管。分别标记为转化反应管和对照管。
- 将 100 µL 感受态 细胞分装至各管中。
- 向转化反应管中加入 1 µL 浓度为 0.1 ng/µL 的质粒。
- 将 SOC 培养基置于 42 °C 水浴中预热，用于步骤 1.8。
- 将两管样品在 42 °C 水浴中热激 45 秒。（关键步骤！）
- 向每管中加入 900 µL 预热的 SOC 培养基。
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结果
作为一种内在无序蛋白（IDP），当其未与其他生物分子结合时 α-Syn 在多种构象之间表现出结构动力学，其转换发生在数微秒量级40 甚至在数百纳秒的时间尺度上41。当 α-当Syn穿过共聚焦光斑时，可能在构象间发生数千次转变。事实上，单分子FRET（smFRET）实验中正是观察到了这种情况39,40. 此处我们进行单分子光诱导电子转移（smPIFE）测量，以探究局部构象动力学 α-同义词
测量记录来自连接在半胱氨酸巯基上的磺化Cy3（sCy3）染料所发射的荧光光子 α-Syn A56C 突变体。sCy3 荧光团在激发态时可能发生异构化。然而，当 sCy3 从其激发态退激并发射光子时 转 异构化过程。因此，如果空间位阻未阻碍sCy3激发态的异构化，其平均发射光子数将较少，表现为较低的荧光量子产率和.......
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讨论
已开展大量生物化学与生物物理研究，以探讨α-Syn的结构特征及其无序性质33,34,35,36,37,38。已有多个研究利用自由扩散的单分子FRET（smFRET）技术，探究无结合状态下α-Syn单体的分子内动力学。这些研究报道了α-Syn具有高度动态异质性，导致在典型扩散时间内通过共聚焦焦点区域时，多种不同结构态被平均化，从而呈现出单一的FRET群体39,40。然而，必须注意的是，smFRET测量反映的是3–10 nm范围内染料间距离的变化，这一尺度表征的是α-Syn这类小蛋白的整体结构变化。
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披露
所有作者均无利益冲突。
致谢
编码A56C α-突触核蛋白突变体的pT-t7质粒由Asaf Grupi博士、Dan Amir博士和Elisha Haas博士赠予我们。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目号R01 GM130942，E.L.为子项目负责人）、以色列科学基金会（项目号3565/20，属于KillCorona冠状病毒防控研究计划）、Milner基金以及耶路撒冷希伯来大学（启动资金）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amicon Ultra-15 离心过滤装置 | Merc | C7715 | 截留分子量：100 kDa |
| 硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| 半胱胺 | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| 透析袋 - MEGA GeBaFlex-tube | Gene Bio-Application | MEGA320 | |
| 二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fast SeeBand 染色液 | Gene Bio-Application | SB050 | |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| HiTrap 脱盐柱 5 mL | Sigma-Aldrich | GE17-1408 | |
| 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸（TROLOX） | Sigma-Aldrich | 238813 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG） | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| LB 培养基 | Sigma-Aldrich | L3152 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | 63068 | |
| MonoQ 柱 | Sigma-Aldrich | 54807 | |
| 蛋白质 LoBind 管 | Sigma-Aldrich | EP0030108094 | 0.5 mL |
| 冲洗 µ-slide 18 | Ibidi | 81816 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 一水合磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | 71507 | |
| 无菌涂布棒，Drigalski 刮铲 | mini-plast | 815-004-05-001 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| 磺基-Cy3 马来酰亚胺 | abcam | ab146493 | |
| 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP） | Sigma-Aldrich | 75259 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 93363 | |
| 胰蛋白胨 | Sigma-Aldrich | T7293 | |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625 |
参考文献
- Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
- Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1....
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