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方法文章

使用扫描电子显微镜观察膜皱褶的形成

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DOI：

10.3791/62658

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2021年5月27日

 ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

本文内容

摘要

大胞饮作用是一种高度保守的内吞过程，由富含F-actin的片状膜突起（也称为膜皱褶）的形成为起始。大胞饮作用对溶质内吞速率的增加已发现与多种病理状态相关。本实验方案介绍了一种定量检测膜皱褶形成的方法。 体外 使用扫描电子显微镜。

摘要

膜皱褶是含有新聚合肌动蛋白丝网状结构的可运动性细胞膜突起的形成过程。膜皱褶可自发产生，也可由生长因子、炎性细胞因子和佛波酯诱导形成。部分膜突起可重新排列为环形膜皱褶，其远端边缘融合，形成杯状结构，随后闭合并从细胞膜分离，在细胞质中形成称为巨胞饮体的大型异质性空泡。在此过程中，皱褶结构包裹细胞外液及溶质，并将其内化至巨胞饮体内。高分辨率扫描电子显微镜（SEM）是一种常用的成像技术，用于观察和定量细胞表面的膜皱褶形成、环形突起以及闭合的巨胞饮杯状结构。以下方案描述了细胞培养条件及诱导膜皱褶形成的刺激方法 体外 以及如何固定、脱水并利用扫描电镜（SEM）对细胞进行成像制样。本文还描述了膜皱褶的定量分析、数据归一化方法，以及膜皱褶形成的刺激剂和抑制剂。该方法有助于解答关于大胞饮作用在生理与病理过程中的作用的关键问题，探索调控膜皱褶形成的新靶点，并鉴定尚未明确的生理刺激因子以及新型的大胞饮作用药理学抑制剂。

引言

巨胞饮作用是一种内吞过程，通过称为膜皱褶的动态且由肌动蛋白驱动的质膜突起，大量摄取细胞外液体及其内容物1。许多此类膜皱褶会形成杯状结构，闭合并重新融合至细胞，随后从质膜分离，形成体积较大、异质性的胞内内体，即巨胞饮体1。尽管在多种细胞类型中，巨胞饮作用可由生长因子（如巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和表皮生长因子（EGF））诱导，但在天然免疫细胞中还观察到另一种独特的、依赖钙离子的过程，称为组成型巨胞饮作用2,3,4,5,6,7,8。

细胞通过巨胞饮作用内化胞外物质的能力已被证明在多种生理过程中发挥重要作用，从营养物质摄取到病原体捕获及抗原呈递均涉及此过程9,10,11。然而，由于该过程具有非选择性和可诱导性，它也与多种病理状态相关。事实上，先前的研究表明，巨胞饮作用在阿尔茨海默病、帕金森病、癌症、肾结石以及动脉粥样硬化中均具有重要作用12,13,14,15,16。此外，某些细菌和病毒已被发现可利用巨胞饮作用侵入宿主细胞并引发感染17,18。有趣的是，巨胞饮作用的激活也可被用于在多种疾病状态下实现治疗剂的靶向递送19,20。

既往研究通过定量分析在存在或不存在大胞饮作用抑制剂的情况下，被细胞内化的荧光标记液相示踪剂，利用流式细胞术和共聚焦成像来探索大胞饮作用21,22。目前可用的抑制大胞饮作用的药理学工具十分有限，主要包括：1）肌动蛋白聚合抑制剂（如细胞松弛素D和拉盾菌素），2）PI3K阻断剂（LY-294002和渥曼腺素），以及3）钠氢交换体（NHE）抑制剂（阿米洛利和EIPA）5,14,15,23,24,25。然而，由于这些抑制剂具有与内吞作用无关的其他效应，因此难以特异性地确定大胞饮作用在溶质摄取及疾病发生机制中的贡献，尤其是在体内（in vivo）条件下21。

扫描电子显微镜（SEM）是一种利用聚焦电子束产生细胞超高分辨率图像的电子显微镜26在巨胞饮研究中，扫描电镜成像被视为可视化细胞质膜地形学和形态学特征、量化膜皱褶形成及其向巨胞饮体内部化进展的金标准技术。此外，将扫描电镜与溶质摄取的定量分析相结合，在有或无巨胞饮抑制剂的条件下，可提供一种可靠策略以检测巨胞饮介导的溶质内化过程。 体外本文提供了一套详细的方案，用于制备扫描电镜（SEM）样品、观察细胞表面、定量分析皱褶形成，并检测其向杯状结构闭合及巨胞饮泡内化的过程。

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方案

注意：以下是一个通用方案，用于通过扫描电镜（SEM）显微技术定量分析RAW 264.7巨噬细胞中的细胞膜皱褶形成。不同细胞类型可能需要进行条件优化。

1. 细胞系与细胞培养

  1. 在含有10%（体积比）热灭活胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养RAW 264.7巨噬细胞，置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中。每隔一天更换一次培养基。
  2. 当细胞融合度达到80%时，使用无菌PBS洗涤培养板两次。
  3. 加入1,000 µL 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C湿化培养箱中孵育3–5分钟以使细胞脱落。
  4. 在光学显微镜下观察培养板，确认细胞已解离。加入含10% FBS的10 mL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
  5. 将细胞悬液收集至50 mL锥形管中，于室温下以400 × g离心5分钟。用完全细胞培养基轻柔重悬细胞，并使用台盼蓝（0.4%）染色法测定细胞数量和活率。
    注意：本实验建议的最低细胞活率为>90%。
  6. 使用经高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。以1 × 106 个细胞/mL的密度将细胞接种于盖玻片上，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育过夜。
  7. 处理前，每孔更换为500 µL新鲜完全培养基。用溶剂对照（DMSO或其他用于溶解EIPA的溶剂）或巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利（EIPA，25 µM21）预处理巨噬细胞30分钟。
  8. 用溶剂对照及巨胞饮刺激剂处理细胞，以促进细胞膜皱褶形成：佛波酯-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（PMA，1 µM，30分钟21）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，100 ng/mL，30分钟3）。
    注意：也可使用其他抑制剂[如拉盾菌素A（1 µM，30分钟）或细胞松弛素D（1 µM，30分钟）]和刺激剂[如表皮生长因子（EGF，100 ng/mL，10分钟）或血小板源性生长因子（PDGF，100 ng/mL，15分钟）]来表征巨噬细胞及其他细胞类型中的巨胞饮作用16,27,28,29。在使用生理学刺激剂处理前，细胞可能需要进行过夜血清饥饿处理。需注意的是，不同细胞类型中有效刺激巨胞饮作用的最佳浓度和孵育时间需另行确定。

2. 扫描电镜固定

  1. 处理后，吸去孔板中的培养基，并用预冷的 PBS 洗涤盖玻片两次。
  2. 在室温下用固定液（含 4% 多聚甲醛和 2% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠溶液）固定细胞 30 分钟，随后于 4 °C 在固定液中过夜孵育。
  3. 轻柔洗涤并依次将盖玻片与以下试剂各 500 µL 孵育，操作过程中避免破坏细胞单层。
    1. 用 0.1 M 二甲胂酸钠溶液洗涤一次，孵育 15 分钟。
    2. 用去离子水（dH2O）洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
    3. 用 25% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
    4. 用 50% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
    5. 用 75% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
    6. 用 80% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
    7. 用 95% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
    8. 用 100% 乙醇洗涤两次，每次洗涤孵育 10 分钟。
      注意：更换试剂时应迅速操作，以防止细胞干燥。盖玻片可在 4 °C 的 100% 乙醇中保存数天。如需长期保存，应补充适量 100% 乙醇，并用封口膜覆盖孔板以防止样品干燥。

3. 临界点干燥

  1. 将盖玻片放入临界点干燥仪中，并用100%乙醇覆盖。按下电源按钮并打开CO2气罐。
  2. 按下冷却按钮约30秒，直至温度降至0 °C。按下填充按钮，直到观察窗中出现气泡。
  3. 按下 purge 按钮，直至排气口处的乙醇气味消失。再次按下冷却按钮，直至温度降至0 °C。
  4. 重新按下填充和 purge 按钮以关闭它们，并关闭CO2气罐。重新按下冷却按钮以关闭冷却功能，然后按下加热按钮。
  5. 将温度设定为42 °C，压力设定为1,200 psi。待温度和压力稳定后，按下放气按钮，使压力缓慢下降。
  6. 当腔室压力降至150 psi时，按下通气按钮，并等待压力降至0 psi。关闭临界点干燥仪，取出盖玻片。
  7. 使用碳导电胶带将盖玻片固定在扫描电镜用铝制样品台上，并在溅射镀膜仪中采用金/钯进行溅射镀膜处理。
  8. 打开电源按钮，等待真空度达到30 mTorr。通过关闭气体开关并将微调气体阀门逆时针旋转，冲洗腔室以去除湿气和空气。
  9. 当真空度上升至200 mTorr时，关闭气体开关，等待真空度再次降至30 mTorr。重复此步骤3次。
  10. 按下定时器按钮，并调节电压旋钮，使仪表读数为10 mA。从腔室中取出已镀膜的盖玻片。
    注：请遵循制造商的说明对样品进行临界点干燥和溅射镀膜。

4. 成像与定量分析

  1. 将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的样品室中。关闭舱门，然后按下 Evac 按钮。
  2. 打开扫描电镜操作软件。将加速电压设为 15 kV，工作距离设为 10 mm。
  3. 按下 Coordinates 按钮，移动控制器，直到细胞出现在观察屏幕中央。将放大倍数设为 3,500×，然后点击“Photo”按钮拍摄样品图像。
    注意：使用更高倍数的放大（8,500× 至 16,000×）可更清晰地显示细胞质膜的细节。
  4. 在盖玻片上至少选取10个随机位置拍摄图像，确保每个显微视野中包含多个细胞。将图像保存为 .tif 文件。
  5. 从图像中识别膜皱褶，定义为细胞质膜上突出的、毯状折叠结构，其尺寸大于 500 nm（图1）。统计每个细胞的膜皱褶数量。
    注意：C形皱褶被识别为弯曲的膜突起，其侧端未发生融合[（图1（M-CSF处理）和 图2B）]。在完全闭合前的闭合环状膜皱褶被识别为巨胞饮杯（图2C）。
  6. 将膜皱褶数量归一化为所评估显微视野中细胞的总数。对每组样品重复此分析。

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结果

本文描述了所展示技术的实验结果。图1 中的代表性扫描电镜（SEM）图像显示，经PMA和M-CSF处理后，RAW 264.7巨噬细胞出现膜皱褶形成。图像首先以3,500倍放大倍数采集，用于定量分析，随后在更高放大倍数（8,500倍至16,000倍）下成像，以更清晰地展示质膜结构细节。在用巨胞饮抑制剂EIPA预处理巨噬细胞后，膜皱褶的形成受到抑制（图1）。与巨胞饮相关的质膜活动可分为五个连续步骤：1）膜皱褶启动，2）环化，3）杯状结构形成，4）杯状结构闭合，以及5）通过巨胞饮体的形成将胞外液体及其相关溶质内化。图2 展示了经M-CSF刺激后这些形态上可区分的质膜活动的代表性图像。片状大皱褶（图2A）、环化呈C形的皱褶（图2B）以及巨胞饮杯结构（图2C）均在6,000倍至7,000倍放大倍...

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讨论

本扫描电镜成像方案提供了一种用于观察和量化细胞表面膜皱褶形成、环形突起及巨胞饮杯的工具 体外尽管本实验方案主要关注巨噬细胞，但已有研究表明，膜皱褶的形成也发生在其他多种细胞类型中，包括树突状细胞、成纤维细胞、神经元和癌细胞。11,12,14,21,30因此，可能需要优化细胞培养条件，或使用不同的刺激物或处理条件，以便在其他细胞类型中观察到膜皱褶。

尽管样品制备过程允许一定程度的灵活性，但脱水和临界点干燥步骤必须严格遵循操作流程，以保持细胞表面结构的完整性。此外，水或其他溶剂（如乙醇）的存在会破坏扫描电镜成像所必需的真空环境，因此必须以受控方式彻底去除，以维持样品形态的完整14。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢奥古斯塔大学的 Libby Perry 在扫描电镜样品制备方面的帮助。本研究由美国国立卫生研究院 [R01HL139562（G.C.）和 K99HL146954（B.S.）] 和美国心脏协会 [17POST33661254（B.S.）] 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTAGibco15400-054
2% 戊二醛Electron Microscopy Sciences16320
4% 多聚甲醛Santa Cruz Biotechnology281692
5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利Sigma Life ScienceA3085
Accuri C6 流式细胞仪
碳胶粘附标签Electron Microscopy Sciences77825-09
二甲基亚砜Corning25-950-CQC
杜尔贝科改良伊格尔培养基Cytiva Life SciencesSH30022.01
Falcon 24孔透明平底TC处理多孔细胞培养板Falcon353047
胎牛血清Gemini Bio900-108
FitC-葡聚糖Thermo Fisher ScientificD1823
FM 4-64Thermo Fisher ScientificT13320
HERAcell 150i CO2 培养箱Thermo Fisher Scientific51026282
Hummer Model 6.2 溅射镀膜仪Anatech USA58565
JSM-IT500HR 扫描电子显微镜
显微镜盖玻片Thermo Fisher Scientific12-545-82
青霉素-链霉素Gibco15140-122
佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯Millipore Sigma524400
RAW 264.7 巨噬细胞ATCCATCC TIB-71
重组人M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790 临界点干燥仪Tousimis Research Corporation8778B
SEM 铝制样品台Electron Microscopy Sciences75220
二甲胂酸钠Electron Microscopy Sciences12300
德克萨斯红-葡聚糖Thermo Fisher ScientificD1864
台盼蓝溶液Thermo Fisher Scientific15250061
Zeiss LSM 780 共聚焦显微镜

参考文献

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