使用扫描电子显微镜可视化膜褶皱形成

Summary

大旋毛细胞增多症是一种高度保守的内吞作用过程，由形成富含F的片状膜突起（也称为膜褶皱）而引发。大旋细胞溶质内化速率增加与各种病理疾病有关。该协议提出了一种使用扫描电子显微镜 在体外 量化膜褶皱形成的方法。

Abstract

膜褶皱是含有新聚合的肌动蛋白丝网状物的运动质膜突起的形成。膜褶皱可能自发形成或响应于生长因子、炎性细胞因子和磷脂醇酯。一些膜突起可能重组成圆形膜褶皱，在其远端边缘融合并形成杯子，这些杯子关闭并分离成称为大的异质液泡，称为大孔蛋白酶体。在此过程中，褶皱会捕获细胞外液和内化在大蛋白酶体内的溶质。高分辨率扫描电子显微镜（SEM）是一种常用的成像技术，用于可视化和量化细胞表面上的膜褶皱形成，圆形突起和封闭的大毛细胞杯。以下方案描述了细胞培养条件， 体外 膜褶皱形成的刺激，以及如何固定，脱水和制备用于使用SEM成像的细胞。该方法可以帮助回答有关大毛细胞增多症在生理和病理过程中的作用的关键问题，研究调节膜褶皱形成的新靶点，并鉴定尚未表征的生理刺激物以及巨棘球增多症的新型药理学抑制剂。

Introduction

大毛细胞增多症是一种内吞过程，负责通过形成动态和肌动蛋白驱动的质膜突起（称为膜褶皱¹）内化大量细胞外液及其含量。许多这些膜褶皱形成杯子，这些杯子关闭并融合回细胞上，并与质膜分离成大而异质的细胞内体，也称为大蛋白酶体¹。虽然在多种细胞类型中，巨噬细胞增多症是由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和表皮生长因子（EGF）等生长因子诱导的，但在先天免疫细胞²，³，⁴，^{5，6，7，8}中也观察到另一种独特的钙依赖性过程，称为组成性大羽细胞增多症。

细胞通过大羽核细胞增多症内化细胞外物质的能力已被证明在从营养吸收到病原体捕获和抗原呈递的各种生理过程中起重要作用^9，10，

Protocol

注意:以下是用于使用SEM显微镜定量RAW 264.7巨噬细胞中膜褶皱形成的通用方案。可能需要针对不同的细胞类型进行优化。

1. 细胞系和细胞培养

1. 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中生长RAW 264.7巨噬细胞，并在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中补充10%（体积/体积）热灭活胎牛血清（FBS），100 IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素。每隔一天更换一次生长培养基。
2. 当细胞融合80%时，使用无菌PBS洗涤板两次。
3. 通过加入1，000μL0.5%胰蛋白酶-EDTA分离细胞，并将细胞培养板在37°C的加湿培养箱中孵育3-5分钟。
4. 在光学显微镜下检查板以确认细胞解离。加入10mL含有10%FBS的生长培养基以灭活胰蛋白酶。
5. 将细胞悬浮液收集在50mL锥形管中，并在室温下以400× g 离心5分钟。轻轻地将细胞重悬于完整的细胞培养基中，并使用台盼蓝（0.4%）染色测定细胞计数和活力。
   注意:该实验的推荐最小细胞活力为>90%。
6. 使用高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。将细胞以1×10⁶ 细胞/ mL的密度将种子细胞放在盖玻片上，并将板在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中孵育过夜。
7. 在处理前用新鲜的500μL完整培养....

Results

在这里，我们描述了所呈现技术的结果。 图1 所示的代表性SEM图像显示，在用PMA和M-CSF处理后，RAW 264.7巨噬细胞中形成膜褶皱。首先以3，500x的放大倍率捕获图像以进行定量，然后在更高的放大倍率（8，500x至16，000x）下捕获图像，以显示更详细的质膜。用大旋细胞增多症抑制剂EIPA预处理巨噬细胞减弱膜褶皱形成（图1）。与大毛细胞增多症相关的质膜活性可分为五个连续的步骤:1）膜皱褶的开始，2）环状，3）杯状形成，4）杯子闭合，以及5）通过大核小体形成内化细胞外液及其相关溶质。 图2 显示了M-CSF刺激后这些形态学上不同的质膜活动的代表性图像。在6，000x至7，000x的放大倍率下捕获大片状褶皱（图2A），圆形C形褶皱（图2B）和大片状褶皱杯（图2C）。扫描电子.......

Discussion

目前的SEM成像方案提供了一种工具，用于可视化和量化体 外细胞表面的膜褶皱形成，圆形突起和大毛细胞杯。虽然目前的方案侧重于巨噬细胞，但研究表明，膜褶皱的形成也发生在各种其他细胞类型上，包括树突状细胞，成纤维细胞，神经元和癌细胞^{11，12，14，21，30}。鉴于此，可能需要优化细胞培养条件并使用不同的刺激器或治疗条件来可视化其他细胞类型中的膜褶皱。

尽管样品制备存在一些余地，但必须严格遵循脱水和临界点干燥步骤，以保持细胞表面结构。此外，水或其他溶剂（如乙醇）的存在会扰乱真空，这对于SEM成像至关重要，因此，必须以受控的方式将其除去以保持样品形态完整¹⁴。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	15400-054
2% 戊二醛	电子显微镜科学	16320
4% 多聚甲醛	Santa Cruz 生物技术	281692
5-（N-乙基-N-异丙基）-阿米洛利	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 流式细胞仪
碳胶片	电子显微镜科学	77825-09
二甲基亚砜	康宁	25-950-CQC
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基	Cytiva 生命科学	SH30022.01
Falcon 24 孔透明平底 TC 处理的多孔细胞培养板	Falcon	353047
胎牛血清	Gemini Bio	900-108
FitC-葡聚糖	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 培养箱	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Model 6.2 溅射镀膜机	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR 扫描电子显微镜
显微镜盖板 玻璃	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
笔 链球菌	Gibco	15140-122
佛波醇 12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 巨噬细胞	ATCC	ATCC TIB-71
重组人 M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790临界点干燥器	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM 铝样品架	电子显微镜科学	75220
二甲胂酸钠	电子显微镜科学	12300
德克萨斯州红酥	Thermo Fisher Scientific	D1864
台盼蓝溶液	Thermo Fisher Scientific	15250061
蔡司 LSM 780 共聚焦显微镜