使用扫描电子显微镜可视化膜褶皱形成

大毛细胞增多症是一种内吞过程，负责通过形成动态和肌动蛋白驱动的质膜突起（称为膜褶皱¹）内化大量细胞外液及其含量。许多这些膜褶皱形成杯子，这些杯子关闭并融合回细胞上，并与质膜分离成大而异质的细胞内体，也称为大蛋白酶体¹。虽然在多种细胞类型中，巨噬细胞增多症是由巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和表皮生长因子（EGF）等生长因子诱导的，但在先天免疫细胞²，³，⁴，^{5，6，7，8}中也观察到另一种独特的钙依赖性过程，称为组成性大羽细胞增多症。

细胞通过大羽核细胞增多症内化细胞外物质的能力已被证明在从营养吸收到病原体捕获和抗原呈递的各种生理过程中起重要作用^9，10，11。然而，由于这一过程是非选择性和可诱导的，它也与许多病理条件有关。事实上，以前的研究表明，巨旋毛细胞增多症在阿尔茨海默病，帕金森病，癌症，肾结石和动脉粥样硬化中起重要作用^{12，13，14，15，16}。此外，某些细菌和病毒已被证明利用大羽翼虫病进入宿主细胞并诱导感染^17，18。有趣的是，巨旋细胞增多症的刺激也可用于在各种疾病条件下靶向递送治疗剂^19，20。

以前的研究已经探索了大旋毛细胞增多症，方法是使用流式细胞术和共聚焦成像在不存在和存在抑制大羽细胞增多症的药理学药物的情况下定量内化荧光标记的液相标志物^21，22。目前可用的抑制大旋毛细胞增多症的药理学工具仅限于并包括1）肌动蛋白聚合抑制剂（细胞查拉菌素D和latrunculins），2）PI3K阻滞剂（LY-290042和麦芽素）和3）钠氢交换剂（NHE）抑制剂（阿米洛利和EIPA）^{5，14，15，23，24，25}.然而，由于这些抑制剂具有内吞作用的独立作用，因此很难选择性地确定大毛细胞增多对溶质摄取和疾病发病机制的贡献，特别是在 体内²¹中。

扫描电子显微镜（SEM）是一种电子显微镜，它使用聚焦的电子束²⁶产生细胞的超高分辨率图像。在大毛细胞增多症研究中，SEM成像被认为是可视化质膜的形貌和形态特征，量化膜褶皱形成并研究其向大胰岛素体内化进展的金标准技术。此外，在存在和不存在大毛细胞增多症阻滞剂的情况下，扫描电子显微镜结合溶质摄取的定量，为体 外检查大羽细胞溶质内化提供了可靠的策略。本文提供了有关如何为SEM制备细胞，可视化细胞表面，量化褶皱形成以及检查其向杯封和大胰岛素体内化进展的详细方案。

注意:以下是用于使用SEM显微镜定量RAW 264.7巨噬细胞中膜褶皱形成的通用方案。可能需要针对不同的细胞类型进行优化。

1. 细胞系和细胞培养

1. 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中生长RAW 264.7巨噬细胞，并在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中补充10%（体积/体积）热灭活胎牛血清（FBS），100 IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素。每隔一天更换一次生长培养基。
2. 当细胞融合80%时，使用无菌PBS洗涤板两次。
3. 通过加入1，000μL0.5%胰蛋白酶-EDTA分离细胞，并将细胞培养板在37°C的加湿培养箱中孵育3-5分钟。
4. 在光学显微镜下检查板以确认细胞解离。加入10mL含有10%FBS的生长培养基以灭活胰蛋白酶。
5. 将细胞悬浮液收集在50mL锥形管中，并在室温下以400× g 离心5分钟。轻轻地将细胞重悬于完整的细胞培养基中，并使用台盼蓝（0.4%）染色测定细胞计数和活力。
   注意:该实验的推荐最小细胞活力为>90%。
6. 使用高压灭菌的镊子将无菌玻璃盖玻片放入24孔板的孔中。将细胞以1×10⁶ 细胞/ mL的密度将种子细胞放在盖玻片上，并将板在37°C和5%CO₂的加湿培养箱中孵育过夜。
7. 在处理前用新鲜的500μL完整培养基更换每个孔的培养基。用载体（DMSO或其他用于溶解EIPA的溶剂）或大旋细胞增多症抑制剂5-（N-乙基-N-异丙基）-阿米洛利（EIPA，25μM²¹）预处理巨噬细胞30分钟。
8. 用大旋毛细胞增多症的载体和刺激物处理细胞以促进膜皱褶:佛波bol 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA，1μM，30分钟²¹）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，100ng / mL，30分钟³）。
   注意:大棘球菌病的替代抑制剂[例如，拉龙古菌素 A （1 μM，30 分钟）或细胞查拉辛 D （1 μM，30 min）] 和刺激剂 [例如，表皮生长因子 （EGF， 100 ng/mL， 10 分钟）或血小板衍生生长因子 （PDGF， 100 ng/mL， 15 min）] 也可用于表征巨噬细胞和其他细胞类型的大棘皮细胞增多症^{16，27，28，29}.在用大棘球增多症的生理刺激物治疗之前，细胞可能需要过夜血清饥饿。重要的是要注意，必须确定最有效的浓度和孵育时间，以刺激其他细胞类型的大旋毛细胞增多症。

2. 扫描电镜固定

1. 处理后，从孔中吸出培养基，并用冰冷的PBS清洗盖玻片两次。
2. 在室温下固定细胞（4%多聚甲醛和2%戊二醛在0.1M二甲酸钠中）30分钟，然后在4°C下在固定剂中孵育过夜。
3. 轻轻洗涤并用500μL以下试剂孵育盖玻片，而不会干扰细胞单层。
   1. 在0.1M二甲肱酸钠中洗涤一次，孵育15分钟。
   2. 用dH₂O洗涤两次，每次洗涤10分钟。
   3. 用25%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   4. 用50%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   5. 用75%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   6. 用80%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   7. 用95%乙醇洗涤两次，每次洗涤10分钟孵育。
   8. 用100%乙醇洗涤两次。在每次洗涤中进行10分钟的孵育。
      注意:应快速更换/更换试剂，以防止细胞风干。盖玻片可以在4°C下在100%乙醇中放置数天。 对于长期储存，添加额外的100%乙醇并用parafilm覆盖孔，以防止样品的空气干燥。

3. 临界点干燥

1. 将盖玻片放入临界点干燥器中，并用100%乙醇盖住。按 电源 按钮并打开 CO₂ 油箱。
2. 按住 冷却 按钮约30秒，直到温度降至0°C。 按"填充"按钮，直到腔室窗口中出现气泡。
3. 按下 "吹扫 "按钮，直到吹扫排气中的乙醇气味消失。再次 按下冷却 按钮，直到温度降至 0 °C。
4. 按下 "填充 "和" 清除 "按钮以将其关闭并关闭 CO₂ 油箱。按下" 冷却 "按钮将其关闭，然后按" 加热 "按钮。
5. 将温度设置为42°C，压力设置为1，200 psi。压力和温度稳定后，按下 "排气 "按钮，使压力缓慢下降。
6. 一旦腔室压力达到150 psi，按下 排气 按钮并等待压力降至0 psi。关闭临界点干燥器并取下盖玻片。
7. 使用 碳粘合剂 片在SEM铝试样安装座上安装盖玻片，并在溅射涂布机中使用金/钯进行溅射镀膜。
8. 打开 电源 按钮，等待真空度达到 30 mTorr。冲洗腔室以通过关闭气体开关并逆时针旋转 精细气体 阀来去除湿度和空气。
9. 一旦真空度增加到200 mTorr，请关闭气体开关，等待真空度达到30 mTorr。重复此步骤 3 次。
10. 按下 定时器 按钮并调整 电压 旋钮，直到仪表读数为10 mA。从腔室中取出涂层盖玻片。
    注意:按照制造商的说明对样品进行临界点干燥和溅射镀膜。

4. 成像和定量

1. 将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的腔室中。关上门，然后按 依凡克 按钮。
2. 打开扫描电镜操作软件。将加速电压设置为15 kv，工作距离设置为10 mm。
3. 按 坐标按钮 并在控制器周围移动，直到单元格出现在观察屏幕的中心。将放大倍率设置为 3，500 倍，然后单击"照片"按钮对样品进行成像。
   注意:使用更高级别的放大倍率（8，500x至16，000x）以显示更详细的质膜。
4. 从盖玻片上的至少10个随机位置拍摄图像，确保每个微观场包含多个细胞。将图像另存为.tif文件。
5. 从图像中，定位膜褶皱，定义为质膜的突出的毯子状褶皱，尺寸大于500nm（图1）。计算每个单元格的褶皱数。
   注意:C形褶皱被鉴定为弯曲的膜突起，其侧端没有融合[（图1 （M-CSF处理）和 图2B]。熔融的圆形膜褶皱在闭合之前被鉴定为大旋毛细胞杯（图2C）。
6. 将膜褶皱的数量归一化为所评估的微观场中的细胞总数。对每组的样本重复此分析。

在这里，我们描述了所呈现技术的结果。 图1 所示的代表性SEM图像显示，在用PMA和M-CSF处理后，RAW 264.7巨噬细胞中形成膜褶皱。首先以3，500x的放大倍率捕获图像以进行定量，然后在更高的放大倍率（8，500x至16，000x）下捕获图像，以显示更详细的质膜。用大旋细胞增多症抑制剂EIPA预处理巨噬细胞减弱膜褶皱形成（图1）。与大毛细胞增多症相关的质膜活性可分为五个连续的步骤:1）膜皱褶的开始，2）环状，3）杯状形成，4）杯子闭合，以及5）通过大核小体形成内化细胞外液及其相关溶质。 图2 显示了M-CSF刺激后这些形态学上不同的质膜活动的代表性图像。在6，000x至7，000x的放大倍率下捕获大片状褶皱（图2A），圆形C形褶皱（图2B）和大片状褶皱杯（图2C）。扫描电子显微镜可用于提供细胞表面的高分辨率图像，但不能用于可视化内化大孔小体。PMA和M-CSF处理后膜褶皱的定量如图 3所示。大孔蛋白酶体的形成可以通过替代成像技术确认，包括共聚焦显微镜检查，如图 4所示。最后，膜褶皱的 SEM 定量应辅以荧光液相标志物（例如 FITC 或德克萨斯红葡聚糖）的流式细胞术定量，以确认对大旋细胞增多症的刺激（图 5）。

图1:RAW 264.7巨噬细胞的扫描电子显微镜图像。 用载体（DMSO对照）或EIPA（25μM）预处理RAW 264.7巨噬细胞30分钟，并与PMA（1μM，30分钟）或M-CSF（100ng / mL，30分钟）一起孵育以刺激膜皱褶。右侧的图像显示了细胞表面的放大倍率。红色箭头:膜褶皱。绿色箭头:C形荷叶边。 请点击此处查看此图的大图。

图2:通过扫描电子显微镜捕获的大毛细胞增多症的形态学阶段。 用M-CSF（100ng / mL）处理RAW 264.7巨噬细胞30 min，并处理细胞进行SEM成像。 （A） 片状膜突出， （B） C形膜褶皱， （C） 大毛细胞杯。 请点击此处查看此图的大图。

图3:膜褶皱形成的定量。 用载体（DMSO对照）或EIPA（25μM）预处理RAW 264.7巨噬细胞30分钟，并与PMA（1μM，30分钟）或M-CSF（100ng / mL，30分钟）一起孵育以刺激膜皱褶。条形图显示归一化为总细胞数（n = 3）的膜褶皱数量。数据表示SEM±均值。*p < 0.05 vs. 车辆， #p < 0.05 vs. PMA 或 M-CSF 治疗。 请点击此处查看此图的大图。

图4:巨蛋白酶体形成。 用PMA预处理细胞30分钟，并与德克萨斯红葡聚糖（25μg/ mL，红色）和FM4-64（5μg/ mL，绿色）一起孵育10分钟。使用共聚焦显微镜进行成像。蓝色箭头:膜褶皱，黄色箭头:含有德克萨斯红葡聚糖的大胰岛素样体，绿色箭头:大胰岛素样体。 请点击此处查看此图的大图。

图5:大旋毛细胞增多症的定量。 用载体（DMSO对照）或EIPA（25μM）预处理RAW 264.7巨噬细胞30分钟，并与PMA（1μM）和FITC-葡聚糖（100μg/mL;70，000 MW）一起孵育2小时。条形图显示了归一化为载体治疗的平均荧光强度（MFI）折叠变化（n = 3，一式三份进行）。数据表示SEM±均值。*p < 0.05 vs. 车辆， #p < 0.05 vs. PMA。 请点击此处查看此图的大图。

作者声明没有利益冲突。